パラレル・セグメントフローカラムをチューニングし、多重化された検出のイネーブル化

このHPLC手順の全体的な目的は、マルチプレックス検出を可能にするために並列セグメントフローカラムを調整することです。この手法は、健康とウェルビーイング、環境科学、法医学、およびバイオディスカバリーなどの複雑なサンプルの分析を必要とするあらゆる分野における重要な課題に応えるものです。本手法により、包括的なサンプル分析が可能になると同時に、複雑な混合物に含まれる物質の化学的および生物学的活性に関する情報を得ることができます。

マルチ検出プロトコルにより、迅速な分析も可能になります。この手法により、コーヒーやワインなどの複雑な混合物の化学的フィンガープリントを定義する戦略の開発が可能となり、製造業者は自社製品と安価な模造品を区別できるようになります。当初は、正確な分析のためにサンプル全体を単一の検出器に送らないことが、型破りな方法に感じられるかもしれません。

しかしながら、各フローストリーム内の分析物濃度は、従来のカラムの全フローストリームよりも高くなります。まず、HPLC装置をセットアップし、移動相Aに100%UE水、移動相Bに純メタノールをそれぞれ設定します。MS検出器を使用する場合は、両方の移動相に0.1%ギ酸を添加し、メーカーの指示に従ってHPLCポンプをパージしてください。

メーカーの指示に従い、MS UV VSおよびDPPH検出器を組み立てます。検出器ラインのデッドボリュームが最小限になるよう、各コンポーネントを適切に配置してください。

次に、UV VISTA検出器の波長を、今回のサンプル固有の波長に設定します。MS検出器については280 nmに設定してください。トータルイオンカウント（TIC）分析には、フルスキャン検出法を用い、ポジティブモードを使用します。

MS検出器の温度とガス流量を、以下の値に平衡化させます。気化器温度500 °C、キャピラリー温度350 °C、補助ガス流量40 units、スイープガス流量5 units、シースガス流量60 units、およびスプレー電圧3.5 kVです。DPPHラジカル試薬を調製するには、まず25 mgのDPPHラジカルをメスフラスコを用いて250 mLのメタノールに溶解させます。

溶液に250 µLのギ酸を加え、10分間超音波処理します。その後、遮光のためフラスコをホイルで覆います。次に、メーカーの指示に従い、DPPHラジカル溶液でポンプをパージして、DPPHラジカル系を構築します。

ポンプラインがTピースの入口に固定されていることを確認し、次に100 µLの反応コイルをTピースの出口に接続します。検出器を反応コイルENCケースのもう一方の端、反応コイル、およびカラムヒーターに取り付けます。最後に、DPPHラジカルUV検出器を520 nmに設定します。

並列セグメントフロー（PSF）カラムを構築するために、まずカラムの入口をHPLC装置に接続します。次に、チューブを用いて中央ポートをMS検出器に接続します。同じ寸法のチューブを使用して、一方の周辺カラムポートをUV VS検出器に、もう一方をDPPHラジカル検出システムのT字管に接続します。

使用しない周辺ポートをカラムストッパーで塞ぎます。内径4.6 mm、長さ250 mmのカラムを使用する場合、HPLCの流量を100%移動相Bで1 mL/minに調整します。20分間平衡化させます。

PSFシステムの調整を開始するには、まず空の回収容器を準備します。これらのバイアルを使用して、UV VSおよびDPPHラジカルポートからの移動相を個別に回収します。回収時間を記録し、各容器に少なくとも500 mgの溶媒を回収してください。

次に、回収容器を計量して移動相の質量を測定し、その質量をメタノールの密度で割ることで、各ポートから回収された移動相の体積を算出します。最後に、MS検出器への流速を測定し、テキストプロトコルに記載されている通り、全流量に対する各検出器の流量比率をパーセントで算出します。流量比率が理想的な値から大幅に逸脱している場合は、必要に応じてチューブを追加して背圧を調整し、回収および算出プロセスを繰り返します。

最後に、DPPHラジカル試薬ポンプの流量を、検出器に接続された出口ポートの流量と一致させます。コーヒー試料を用いてマルチプレックスHPLC分析を行いました。DPPHラジカルのUVおよびMSクロマトグラムを同時に記録できるため、DPPHラジカルに正の反応を示した試料中の化合物を、UVクロマトグラムと容易に照合させることができます。

保持時間の整合性に基づいたMSレスポンスにおいて、MSS TIC検出器から陽性反応が確認されたピークの分子量を記録しました。異なる検出プロセス間でピークのマッチングを容易に行えるため、コーヒーのような複雑な試料に対して、より迅速かつ効率的なスクリーニングと特性評価が可能になります。この手法を習得すれば、本手順に従うことで、約1時間でセットアップを完了し、試料分析に移行することができます。さらに、屈折率検出器や蛍光検出器、あるいは化学発光などの化学ベースの検出器を使用することで、試料に関する追加情報を得ることが可能です。

このビデオを視聴することで、複雑な試料への理解を深めるために、検出プロセスをマルチプレックス化することの重要性を認識できるはずです。さらに、パラレルセグメント流カラムを用いたマルチプレックス検出は、バイオエクスプロレーションを行う上で極めて効率的な手法です。