Name: の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発 Q熱リケッチア (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: 学ぶ凍結乾燥LAMP法を用いたCoxiella burnetiiの迅速検出技術。特殊な保存を必要とせず、資源が限られた地域でのQ熱診断に適した簡便な分子診断法の確立手順を解説します。

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この研究は、米海軍医学研究センター、研究作業単位6000.RAD1.J.A0310によってサポートされていました。この記事で表明された見解は執筆者のものであり、必ずしも海軍省、国防省、または米国政府の公式な政策や位置を反映するものではありません。魏メイチンは、米国政府の従業員です。この作品は彼女の公務の一部として用意しました。タイトル17 USC§105」このタイトルの下に著作権保護は、米国政府のいずれかの作業には使用できません。」ことを提供しますタイトル17 USC§101は、その人の公務の一環として、米国政府の兵役のメンバーや従業員によって調製作品として米国政府の仕事を定義します。

1. LAMP反応のための標準としてプラスミドDNA希釈液を調製<ol><li> （C.バーネッティ RSA 493の標的遺伝子IS1111aを含む）プラスミドを決定するために、260nmの光学密度（OD）を測定し、DNA濃度を分光光度計を使用します。 1のOD 260は、DNAを50μg/μlに相当します。 </li><li>コピー数にプラスミドDNAの量に変換します。プラスミドのサイズは6,330 bpであることから、このプラスミドの分子量は4.1×10 6グラム（6,330 bpのX 649グラム/ BP）です。プラスミドDNAの濃度は、34.2 ngの/μL（ステップ1.1で決定される）です。このDNA試料の1μlのDNAの5×10 9コピー（34.2×10 -9グラム/ 4.1×10 6 GX 6.02×10 23）に等しくする、プラスミドDNAの34.2 ngのが含まれています。 </li><li> 5×10 8コピー/μlにDNAサンプルを作るために10倍希釈するための水90μlにプラスミドDNAを10μl（5×10 9コピー/μl）を追加します。。 </li><li>繰り返しステップ1.3は、5×10 7のDNAサンプルを調製した5×10 6、5×10 5、5×10 4、5×10 3、5×10 2、5×10 1、および5×10 0コピー/ μlの。 </li></ol> 2. LAMP反応のための試料からDNAテンプレートを準備します<ol><li>製造業者のプロトコルに従って市販のDNAミニキットを使用して、ヒト血漿試料からのDNAの抽出を行います。抽出のための200μlのサンプルの合計を使用して、20μl容量で抽出したDNAを溶出します。 </li></ol> 3. 2倍LAMP反応緩衝液を準備します<ol><li> 2倍LAMP緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、のdNTP混合物（各10mM）の280μlの水188μlに12μlの320μlの200μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li></ol> 4.標準LAMP反応を行います<ol><li> 2倍LA12.5μlのミックスMPバッファ（ステップ3で調製した、40mMのトリス-HCl（pHは8.8）、20 mMの塩化カリウム、16mMのMgSO 4を、20mMの（NH 4）2 SO 4、0.2％トリトンX-100、1.6 Mトリメチルグリシン、1.4 mMののdNTP混合物）、プライマーミックスの1.2μlを、 のBst DNAポリメラーゼ（8 U /μl）を1μlの、水5.3μlを0.2ミリリットルのPCRチューブ内で反応混合物（20μl）を作ります。 </li><li> （ステップ1または2から）20μlの反応混合物にDNAの5μl加え、よく混ぜます。 </li><li>近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。これは、以前に決定され、最適な反応温度です。 </li><li>反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。 </li><li>核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに負荷反応生成物5μLを。 </li><li> 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。 </li><li> UV光によって結果を可視化します。 </li></ol>前記再構成でLAMP反応を行います試薬<ol><li>再構成緩衝液1mlを作るために10倍ポル・バッファ、5 Mトリメチルグリシン、1 M MgSO 4を、水の667.5μlに7.5μlの200μlを125μlのを混ぜます。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li><li>密封されたアルミホイル袋から凍結乾燥試薬を含むチューブを外します。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。 </li><li>凍結乾燥試薬を再懸濁するために、各チューブに再構成緩衝液20μlを追加します。 </li><li>バッファ上下に5回ピペッティングして混ぜます。凍結乾燥試薬が完全に再懸濁されていることを確認するために見てみましょう。白色粉末をチューブに消えるはずです。 </li><li> （ステップ1または2からの）再構成試薬にDNAテンプレートの5μl加え、よく混ぜます。 </li><li>近い管および水浴または加熱ブロック中で60分間60℃でインキュベートします。 </li><li>反応を停止し、10倍ゲルローディング緩衝液5μLを加えます。 </li><li>負荷反応液5μl核酸染色を挿入で染色した2％アガロースゲルに製品。 </li><li> 1×TBE緩衝液中で35分間、100Vでゲルを実行します。 </li><li> UV光によって結果を可視化します。 </li></ol> 6. HNBまたは蛍光インターカレート色素を含む再構成緩衝液でLAMP反応を行います<ol><li>への水の10倍ポルBufferを125μlの、5 ​​Mトリメチルグリシン、1MのMgSO 4、20mMのHNB（または100倍の蛍光挿入色素の12.5μl）を7.5μlに7.5μlの660μlの（または655マイクロリットル）の200μLをミックス再構成緩衝液1mlを作ります。 10秒間パルスボルテックスして混和します。 </li><li> 5.6 - 手順5.2を繰り返すセクション6で調製した再構成されたバッファを使用してください。 </li><li>肉眼での結果（HNBを含む反応）またはUV光（蛍光挿入色素を含む反応）を視覚化します。 </li></ol> 7.チューブスキャナによるリアルタイムLAMP反応を行います<ol><li> reconstitutに5μlのDNAを追加します。ED試薬は、蛍光挿入色素、近いチューブを含む、チューブスキャナにそれを挿入します。 </li><li> 60℃に設定したインキュベーション温度。 60分間の520nmでの蛍光を測定します。 </li></ol>

<ol><li>Anderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+and+management+of+Q+fever+United+States%2C+2013%3A+recommendations+from+CDC+and+the+Q+Fever+Working+Group%5BTitle%5D)+AND+%22MMWR+Recomm.+Rep%22%5BJournal%5D)">Diagnosis and management of Q fever United States, 2013: recommendations from CDC and the Q Fever Working Group.</a> MMWR Recomm. Rep. 62 (3), 1-30 (2013).</li>
<li>Rolain, J. M., Boulos, A., Mallet, M. N., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+ratio+of+serum+doxycycline+concentration+to+MIC+and+rapid+decline+of+antibody+levels+during+treatment+of+Q+fever+endocarditis%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob.+Agents+and+Chemother%22%5BJournal%5D)">Correlation between ratio of serum doxycycline concentration to MIC and rapid decline of antibody levels during treatment of Q fever endocarditis.</a> Antimicrob. Agents and Chemother. 49 (7), 2673-2676 (2005).</li>
<li>Fournier, P. E., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+PCR+and+serology+assays+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of PCR and serology assays for early diagnosis of acute Q fever.</a> J. Clin. Microbiol. 41 (11), 5094-5098 (2003).</li>
<li>Schneeberger, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+with+serum+samples+is+indispensable+for+early+diagnosis+of+acute+Q+fever%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vaccine+Immunol%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR with serum samples is indispensable for early diagnosis of acute Q fever.</a> Clin. Vaccine Immunol. 17 (2), 286-290 (2010).</li>
<li>Turra, M., Chang, G., Whybrow, D., Higgins, G., Qiao, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+of+acute+Q+fever+by+PCR+on+sera+during+a+recent+outbreak+in+rural+South+Australia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N+Y+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Diagnosis of acute Q fever by PCR on sera during a recent outbreak in rural South Australia.</a> Ann. N Y Acad. Sci. 1078, 566-569 (2006).</li>
<li>Notomi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+of+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification of DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28 (12), (2000).</li>
<li>Paris, D. H., Blacksell, S. D., Newton, P. N., Day, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple%2C+rapid+and+sensitive+detection+of+Orientia+tsutsugamushi.+by+loo-isothermal+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Trans.+R.+Soc.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Simple, rapid and sensitive detection of Orientia tsutsugamushi. by loo-isothermal DNA amplification.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 102 (12), 1239-1246 (2008).</li>
<li>Huber, E., et al. Loop-mediated isothermal amplification assay targeting the 47-kDa gene of Orientia tsutsugamushi.: A rapid and sensitive alternative to real-time PCR. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+E+%22J.+Med.+Microb.+Diagn%22">J. Med. Microb. Diagn</a>. 1 (112), (2012).</li>
<li>Pan, L., Zhang, L., Wang, G., Liu, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid%2C+sensitive+detection+of+the+ompB+gene+of+spotted+fever+group+rickettsiae+by+loop-mediated+isothermal+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">Rapid, sensitive detection of the ompB gene of spotted fever group rickettsiae by loop-mediated isothermal amplification.</a> BMC Infect. Dis. 12 (254), (2012).</li>
<li>Mori, Y., Nagamine, K., Tomita, N., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+loop-mediated+isothermal+amplification+reaction+by+turbidity+derived+from+magnesium+pyrophosphate+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Detection of loop-mediated isothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesium pyrophosphate formation.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 289 (1), 150-154 (2001).</li>
<li>Qiao, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+for+rapid+detection+of+Bacillus+anthracis.spores%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification for rapid detection of Bacillus anthracis.spores.</a> Biotechnol. Lett. 29 (12), 1939-1946 (2007).</li>
<li>Tomita, N., Mori, Y., Kanda, H., Notomi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loop-mediated+isothermal+amplification+%28LAMP%29+of+gene+sequences+and+simple+visual+detection+of+products%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) of gene sequences and simple visual detection of products.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 877-882 (2008).</li>
<li>Thekisoe, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+Loop-Mediated+Isothermal+Amplification+%28LAMP%29+reagents+and+its+amplification+efficiency+on+crude+trypanosome+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vet.+Med.+Sci%22%5BJournal%5D)">Stability of Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) reagents and its amplification efficiency on crude trypanosome DNA templates.</a> J. Vet. Med. Sci. 71 (4), 471-475 (2009).</li>
<li>Chen, H. W., Ching, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+loop-mediated+isothermal+amplification+assays+for+rapid+and+easy+detection+of+Coxiella+Burnetii%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol+Methods%22%5BJournal%5D)">Development of loop-mediated isothermal amplification assays for rapid and easy detection of Coxiella Burnetii.</a> J. Microbiol Methods. 107, 176-181 (2014).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comparison+of+In-House+Real-Time+LAMP+Assays+with+a+Commercial+Assay+for+the+Detection+of+Pathogenic+Bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">A Comparison of In-House Real-Time LAMP Assays with a Commercial Assay for the Detection of Pathogenic Bacteria.</a> Molecules. 20 (6), 9487-9495 (2015).</li>
</ol>

著者らは、開示することは何もありません。

以前、我々は、挿入要素IS1111a 14をターゲットに高感度で特異的なLAMPアッセイを開発しました。それは非常にC.の異なる株の間で保存されているため、IS1111要素が選択されましたバーネッティと細菌中のコピーのその高い番号（110から7）（クレー2006）。我々の結果は、LAMPはコクシエラ DNAのわずか1染色体コピーに相関し得るIS1111要素の約25コピーを検出することができることを示しました。本研究では、 のBst DNAポリメラーゼ、LAMPプライマー、およびdNTPを凍結乾燥し、圧縮さアルミ箔袋に包装されます。これらの凍結乾燥試薬の感度は25コピーのまま。室温で保存された少なくとも1ヶ月間、新たに調製した試薬に似ています。アルミ箔袋が適切にそれを開く前に、密閉されていることを確認してくださいすることが非常に重要です。それが破損している場合アルミ箔袋が密閉されているかどうかのチューブを使用しないでください。これは、再水和Oを引き起こす可能性がありますそ...

小さ ​​いグラム陰性菌コクシエラバーネッティは、世界中の人獣共通感染症であり、Q熱の原因物質です。 Q熱の世界的な分布とCの高い感染へ海外展開バーネッティ 、米軍と文民要員が流行地域に感染しているの危険にさらされています。 急性および慢性の感染症：Q熱は、2つの形で現れます。急性Q熱は、インフルエンザ様症状、肝炎、または肺炎で自身を提示し、通常、低い死亡率と自己制限疾患です。慢性Q熱は、あまり普及しているが、多くの場合、1,2-放置すれば、はるかに高い死亡率を有している心内膜炎、になります。したがって、適切な治療を導くために早期診断は患者のケアのために重要です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）および定量的リアルタイムPCR（定量PCR）アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床サンプル3-5 &lt;中バーネッティ DNA/ SUP&gt;。 PCRおよび定量PCRの両方がルーチンワークのリソースに制約のある地域でのコストがかかり、多くの場合、容易に入手できません。 もともと納富6で説明した、LAMP法（LAMP）は、代替のDNA増幅法を提供しています。 LAMPは、標的遺伝子の少なくとも6つの独立した領域を認識する特別に設計されたプライマーセットと共に、鎖置換型DNA合成のためのBst DNAポリメラーゼを使用します。 LAMPの最も重要な利点は、増幅が等温条件下で起こることです。したがって、唯一の水浴、加熱ブロックまたはインキュベータが必要です。この方法は、いくつかのリケッチア病原体7-9を検出するために使用されてきました。ゲル電気泳動により増幅されたDNA産物の可視化は、非特異的な増幅に起因する偽陽性から真陽性を区別することができる最も正確な方法です。しかし、ゲル電気泳動に関わる手順は、リソースが制限されたARのための実用的ではありませんEAS。いくつかの代替方法は、反応生成物を検出するために開発されました。このようなピロリン酸マグネシウムの形成10またはUV光11,12の下で可視化する蛍光挿入色素を使用してから派生した濁度としてこれらの代替は、ゲルを実行するよりも有利で ​​す。 Q熱が流行し13である熱帯および亜熱帯の国では、周囲温度である25℃、37℃、で保存した場合LAMP試薬は、1ヶ月間安定でした。 LAMPアッセイはCの存在を検出するために我々の研究室で開発されました血漿試料中のバーネッティ 14。ここでは、凍結乾燥試薬からLAMP反応液を調製するためのシンプルなプロトコルを記述します。室温で保存した場合、凍結乾燥試薬は、1ヶ月間安定です。簡単に可視化手法と組み合わせると、これはCを検出するために使用するのに理想的な方法であり、リソース制限の設定においてバーネッティ 。

<table><tbody><tr><td>LAMPプライマー</td><td>ユーロフィン MWGオペロン</td><td>10 nmol、無塩</td><td>顧客によって設計されたシーケンス</td></tr><tr><td>Bst DNAポリメラーゼ</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0275L</td><td>8ユニット/ ml</td></tr><tr><td>10x サーモポールバッファー</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>B9004S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP混合物</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>N0447L</td><td>10 mM 各</td></tr><tr><td>ベタイン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>B0300</td><td>5 M、トリメチルグリシン</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3409-1ML</td><td>1 M</td></tr><tr><td>10x Bluejuice</td><td>Invitrogen</td><td>10816-015</td><td>gel loading buffer</td></tr><tr><td>SYBR green</td><td>Invitrogen</td><td>S7585</td><td>10,000x, visualize products in tubes</td></tr><tr><td>GelRed</td><td>Phenix Research Products</td><td>RGB-4103</td><td>10,000x, visualize products in gels</td></tr><tr><td>凍結乾燥試薬</td><td>Gene Reach</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒドロキシナフトール</td><td>ブルーFluka</td><td>33936-10G</td><td></td></tr><tr><td>ESEクアントチューブ</td><td>スキャナーQiagen</td><td></td><td>リアルタイム検出</td></tr></tbody></table>

の検出のための凍結乾燥lamp法試薬の開発<em&gt; q熱リケッチア</em

The Development of Lyophilized Loop-mediated Isothermal Amplification Reagents for the Detection of Coxiella burnetii

Q熱リケッチア 、Q熱を引き起こす因子は、偏性細胞内細菌です。 PCRに基づく診断アッセイは、Cを検出するために開発されています細胞培養物および臨床試料中バーネッティ DNA。 PCRは、特殊な装置や大規模なエンドユーザのトレーニングを必要とし、したがって、それは、特に、リソ​​ースに制約のある領域にルーチン作業には適していません。我々は、Cの存在を検出するためのループ媒介等温増幅（LAMP）アッセイを開発しました患者サンプル中バーネッティ 。この方法は、水浴または加熱ブロック中60℃付近の単一の温度で行われます。このLAMPアッセイの感度は、反応当たり約25コピーの検出限界を用いたPCRに非常に類似しています。このレポートでは、凍結乾燥試薬およびhydroxynaphtholブルー（HNB）または反応中の蛍光挿入色素とUVランプを使用して結果の可視化を用いて反応の調製を記載します。 LAMP試薬はlyophiliました検出感度を損なうことなくZED 1ヶ月室温（RT）で保存しました。反応混合物の調製は、複雑な工程を必要としないので、このLAMPアッセイは、特に頑強です。この方法は、Q熱が流行しているリソースが制限された設定での使用に最適です。

0.2ミリリットル管内の凍結乾燥LAMP試薬はのBst DNAポリメラーゼ、プライマー、およびdNTPが含まれています。再構成用緩衝液20μlを、凍結乾燥された試薬を再懸濁するために使用される。 図1は、新たに調製した試薬および凍結乾燥試薬を用いて、アガロースゲル上でLAMP反応結果を示します。凍結乾燥試薬は、その活性を低下させません。両方の試薬 ​​によって調製LAMP反応は、DNA鋳型の25コピーを検出することができる。 図2は、HNBまたは反応中に存在する蛍光インターカレート染料との反応生成物の検出を示します。反応にHNBの添加は、反応中に存在するDNAテンプレートの25、50および100コピーと青紫から視覚的な色の変化を生じます。反応中の蛍光インターカレート色素を含めることは、DNAテンプレートの25、50、及び100のコピーが存在するUV光で強い蛍光シグナルを示しています。チューブスキャナを使用しましたリアルタイム検出のために本研究です。このマシンは、同時に8反応を行うことが...

ここでは、患者サンプル中のC. burnetiiを検出するための凍結乾燥試薬を用いた単純なループ媒介等温増幅(LAMP)法について説明しました。

の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発<em&gt; Q熱リケッチア</em

Coxiella burnetii, the agent causing Q fever, is an obligate intracellular bacterium. PCR based diagnostic assays have been developed for detecting C. ...

この実験の全体的な目的は、凍結乾燥試薬を用いた簡便なLAMP法を開発し、患者検体中のC.burnetiiを検出することです。このプロトコルの主な利点は、試薬の保存に冷却保存（コールドチェーン）を必要としない点にあります。この手法は、Q熱が流行している資源限定的な環境での使用に最適です。本手順の実演は、当研究室の技術者であるTatianaが行います。C.burnetii RSA493由来の標的遺伝子IS1111aのDNAを用い、分光光度計を用いて260 nanometersでプラスミド濃度を測定します。プラスミドDNA濃度を以下の計算式を用いてコピー数に変換します。ここで、6330はプラスミドの塩基対数（長さ）であり、34.2 nanograms per microliterは分光光度計で測定したプラスミド濃度です。次に、プラスミドを8倍から10倍の段階希釈し、1µLあたりのコピー数を以下のように調整します。LAMP反応用のDNAテンプレートを調製するには、まず200µLのヒト血漿サンプルを用意し、DNAミニプレップキットを用いて製造元のプロトコルに従ってDNAを抽出します。最終サンプルを20µLの容量に希釈してください。以下の試薬を混合し、2x LAMP反応バッファーを1 milliliter調製します。パルスボルテックスで10秒間混合してください。標準的なLAMP反応を行うには、0.2 milliliter PCRチューブに、2x LAMPバッファー 12.5 microliters、プライマーミックス 1.2 microliters、Bst DNA polymerase 1 microliter、および水 5.3 microlitersを混合します。次に、20 µLの反応液に5 µLのDNAを加え、十分に混合した後、ウォーターバスまたはヒーティングブロックを用いて60 °Cで60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに5 µLの10xゲルローディングバッファーを加えて反応を停止させます。その後、反応産物を5 µL、核酸インターカレーション染料で染色した2%アガロースゲルにロードします。1x TBEを用いて100 Vで35分間電気泳動を行い、その後、UVライトを使用して結果を可視化します。再構成試薬を用いてLAMP反応を行うには、以下の試薬を混合して1 mLの再構成バッファーを調製します。パルスボルテックスで10秒間混合してください。次に、密封されたアルミホイル袋から、凍結乾燥試薬の入ったチューブを取り出します。ステップ4.2では、袋を開封する前にアルミホイル袋が適切に密封されていることを確認することが非常に重要です。アルミ袋が密封されていない場合や破損している場合は、チューブを使用しないでください。各試薬チューブに20 µLの再構成バッ

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Research

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Immunology and Infection

免疫学と感染症

出典: Domesle, K. J. ほか。ループ媒介の等温増幅による動物性食品中の サルモネラ のスクリーニングおよび培養分離による サルモネラ の確認。 J. Vis.

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このビデオは、培養上皮細胞内のGFPタグ付きCoxiella変異体の細胞内増殖を評価する方法を示しています。変異体の表現型は、免疫染色および脱視顕微鏡を用いて可視化され、細胞内増殖に対する変異の影響を研究することができます。...

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の種特異的検出のためのLAMP法（LAMP）アッセイ<em&gt;アイメリア</em&gt;鶏に感染する

Provided は、サーマルサイクラーまたは顕微鏡とステージヒーターを使用して DNA...

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Q熱リケッチアは人獣共通感染症のQ熱の責任偏性細胞内グラム陰性細菌です。ここでは、 コクシエラ蛍光トランスポゾン変異体の生成と同様に、得られた内部移行、複製、および細胞傷害性表現型の自動識別と分析のための方法を説明します。...

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細菌性病原体とそれらのホスト間の相互作用を調査することは、生物学的研究の重要な領域です。ここでは、BLAM基板を用いたsiRNAの遺伝子サイレンシング中にQ熱リケッチアによってエフェクター転座を測定するために必要な技術を記載しています。...

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ループ媒介等温増幅(LAMP)は、病原体検出分野に広く関心を集めている等温核酸増幅試験(iNAAT)です。ここでは、動物性食品中のサルモネラ菌をスクリーニングし、培養分離から推定サルモネラ菌を確認するための迅速で信頼性の高い、堅牢な方法として、マルチラボ検証されたサルモネラLAMPプロトコルを提示します。...

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