の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発 Q熱リケッチア

この実験の全体的な目標は、患者サンプル中のC.burnetiiを検出するための凍結乾燥試薬を使用した簡単なLAMP法を開発することです。このプロトコルの主な利点は、試薬の保管にコーチングが必要ないことです。この方法は、Q熱が蔓延しているリソースが限られている環境での使用に最適です。

その手順を実演するのは、当研究室の技術者であるタチアナです。C.burnetii RSA493由来の標的遺伝子IS1111aのDNAから始めて、260ナノメートルの分光光度計でプラスミド濃度を決定します。6330はプラスミドの長さと塩基対に等しく、34.2ナノグラム/マイクロリットルはプラスミドの濃度であり、分光光度計を使用して決定したばかりの計算を使用して、プラスミドDNA濃度をコピー数に変換します。

次に、プラスミドの8倍から10倍の段階希釈液を調製して、マイクロリットルあたり次のコピー数に到達します。LAMP反応用のDNAテンプレートを調製するには、まず200マイクロリットルのヒト血漿サンプルから始め、DNAミニプレップキットを使用して、メーカーのプロトコルに従ってDNAを抽出します。最終サンプルを20マイクロリットルの容量に希釈します。

以下の試薬を組み合わせて、1ミリリットルの2x LAMP反応バッファーを調製します。パルスボルテックスで10秒間混合します。標準的なLAMP反応を行うには、0.2ミリリットルのPCRチューブに、12.5マイクロリットルの2x LAMPバッファー、1.2マイクロリットルのプライマーミックス、1マイクロリットルのBst DNAポリメラーゼ、および5.3マイクロリットルの水を混合します。

次に、20マイクロリットルの反応液に5マイクロリットルのDNAを加えてよく混合し、60°Cのウォーターバスまたは加熱ブロックで60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに5マイクロリットルの10倍ゲルローディングバッファーを加えて反応を終了します。次に、反応生成物5マイクロリットルを、インターカレート核酸染色で染色した2%アガロースゲルにロードします。

ゲルを1x TBEで100ボルトで35分間泳動し、UV光を使用して結果を視覚化します。再構成した試薬でLAMP反応を行うには、以下の試薬を組み合わせて1ミリリットルの再構成緩衝液を調製します。パルスボルテックスで10秒間混合します。

次に、凍結乾燥試薬が入っていたチューブを密封されたアルミホイルバッグから取り出します。ステップ4.2では、アルミホイルバッグを開ける前に、アルミホイルバッグが適切に密封されていることを確認することが非常に重要です。アルミ袋が密封されていない、または損傷している場合は、チューブを使用しないでください。

の各チューブに20マイクロリットルの再構成バッファーを加え、ピペッティングで5回上下させて混合します。凍結乾燥試薬が完全に再懸濁されていることを確認してください。次に、再構成した試薬に5マイクロリットルのDNAテンプレートを加え、よく混合します。

氏60度でウォーターバスまたは加熱ブロックで60分間インキュベートします。インキュベーション後に反応を終了するには、5マイクロリットルの10倍ゲルローディングバッファーを添加し、次に反応生成物5マイクロリットルをインターカレーション核酸染色で染色した2%アガロースゲルに添加します。ゲルを1x TBEバッファーで100ボルトで35分間泳動し、UV光で結果を可視化します。

ヒドロキシナフトールブルー、HNB、またはインターカレート色素とLAMP反応を行うには、HNBまたは蛍光インターカレート色素を含む以下の試薬を組み合わせて、1ミリリットルの再構成緩衝液を調製します。パルスボルテックスで10秒間混合します。今説明したようにLAMP反応を行い、UV光または肉眼を使用して結果を視覚化します。

チューブスキャナーでLAMP反応を行うには、蛍光インターカレート色素を含む再構成試薬に5マイクロリットルのDNAを添加し、閉じたチューブをチューブスキャナーに挿入します。インキュベーション温度を60°Cに設定し、520ナノメートルで60分間蛍光を測定します。この図は、アガロースゲルと新たに調製した試薬および凍結乾燥試薬を用いたLAMP反応結果を示しています。

凍結乾燥試薬がその活性を維持しているのを観察します。両試薬で調製したLAMP反応により、DNAテンプレートのコピーが25個検出されました。この図では、反応中のHNBまたは蛍光インターカレート色素による反応生成物の検出を示しています。

反応にHNBを添加すると、紫色から青色への視覚的な色の変化が生じ、反応中には25、50、100コピーのDNAテンプレートが存在します。さらに、反応に蛍光インターカレート色素を含めると、同様のDNAコピー数が存在する場合、UV光で強い蛍光シグナルが示されます。ここに示されているのは、チューブスキャナーを使用して、蛍光インターカレート色素で蛍光シグナルをリアルタイムでモニターした結果です。

蛍光シグナルは、14、18、21、および 23 分後にベースラインを上回っており、反応中の DNA テンプレートのコピーは 10^6、10^4、10^3、および 100 です。一度マスターすれば、この手順は90分で完了します。開発後、このアッセイは、資源が限られた地域でのCoxiella burnetii感染の迅速な診断への道を開きました。

このビデオを見れば、凍結乾燥LAMP試薬の再構成方法について十分に理解できるはずです。患者のサンプルは感染性である可能性があり、この手順を実行するときは常に安全対策を講じる必要があることを忘れないでください。