の検出のための凍結乾燥LAMP法試薬の開発

この実験の全体的な目的は、凍結乾燥試薬を用いた簡便なLAMP法を開発し、患者検体中のC.burnetiiを検出することです。このプロトコルの主な利点は、試薬の保存に冷却保存（コールドチェーン）を必要としない点にあります。この手法は、Q熱が流行している資源限定的な環境での使用に最適です。

本手順の実演は、当研究室の技術者であるTatianaが行います。C.burnetii RSA493由来の標的遺伝子IS1111aのDNAを用い、分光光度計を用いて260 nanometersでプラスミド濃度を測定します。プラスミドDNA濃度を以下の計算式を用いてコピー数に変換します。ここで、6330はプラスミドの塩基対数（長さ）であり、34.2 nanograms per microliterは分光光度計で測定したプラスミド濃度です。

次に、プラスミドを8倍から10倍の段階希釈し、1µLあたりのコピー数を以下のように調整します。LAMP反応用のDNAテンプレートを調製するには、まず200µLのヒト血漿サンプルを用意し、DNAミニプレップキットを用いて製造元のプロトコルに従ってDNAを抽出します。最終サンプルを20µLの容量に希釈してください。

以下の試薬を混合し、2x LAMP反応バッファーを1 milliliter調製します。パルスボルテックスで10秒間混合してください。標準的なLAMP反応を行うには、0.2 milliliter PCRチューブに、2x LAMPバッファー 12.5 microliters、プライマーミックス 1.2 microliters、Bst DNA polymerase 1 microliter、および水 5.3 microlitersを混合します。

次に、20 µLの反応液に5 µLのDNAを加え、十分に混合した後、ウォーターバスまたはヒーティングブロックを用いて60 °Cで60分間インキュベートします。インキュベーション後、チューブに5 µLの10xゲルローディングバッファーを加えて反応を停止させます。その後、反応産物を5 µL、核酸インターカレーション染料で染色した2%アガロースゲルにロードします。

1x TBEを用いて100 Vで35分間電気泳動を行い、その後、UVライトを使用して結果を可視化します。再構成試薬を用いてLAMP反応を行うには、以下の試薬を混合して1 mLの再構成バッファーを調製します。パルスボルテックスで10秒間混合してください。

次に、密封されたアルミホイル袋から、凍結乾燥試薬の入ったチューブを取り出します。ステップ4.2では、袋を開封する前にアルミホイル袋が適切に密封されていることを確認することが非常に重要です。アルミ袋が密封されていない場合や破損している場合は、チューブを使用しないでください。

各試薬チューブに20 µLの再構成バッファーを加え、ピペッティングで5回上下に混ぜ合わせます。凍結乾燥試薬が完全に再懸濁されていることを確認してください。その後、再構成した試薬に5 µLのDNAテンプレートを加え、によく混ぜ合わせます。

ウォーターバスまたはヒーティングブロックを用い、60 °Cで60分間インキュベートします。インキュベート後、反応を停止させるために10xゲルローディングバッファーを5 µL加え、その後、反応産物5 µLを核酸インターカレーション染色剤で染色した2%アガロースゲルにアプライします。1x TBEバッファー中、100 Vで35分間電気泳動を行い、UVライトで結果を確認します。

ヒドロキシナフトールブルー（HNB）またはインターカレーション染料を用いてLAMP反応を行うには、以下に示すHNBまたは蛍光インターカレーション染料を含む試薬を混合し、1 mLの再構成バッファーを調製します。パルスボルテックスで10秒間混合します。上述の手順に従ってLAMP反応を行い、UVライトまたは目視で結果を確認します。

チューブスキャナーを用いてLAMP反応を行うには、蛍光インターカレーション色素を含む再構成済み試薬に5 µLのDNAを加え、チューブの蓋を閉じてチューブスキャナーに挿入します。インキュベーション温度を60 °Cに設定し、520 nmで60分間蛍光を測定します。この図は、調製直後の試薬と凍結乾燥試薬を用いた場合の、アガロースゲル上でのLAMP反応の結果を示しています。

凍結乾燥した試薬が活性を維持していることを確認します。両方の試薬を用いて調製したLAMP反応により、25コピーのDNAテンプレートが検出されました。本図では、HNBまたは蛍光インターカレーション色素による反応生成物の検出結果を示しています。

反応液にHNBを添加すると、DNAテンプレートが25、50、および100コピー存在する場合に、紫色から青色への視覚的な色変化が生じます。さらに、反応液に蛍光インターカレーション染料を含めると、同様のDNAコピー数が存在する場合にUVライト下で強い蛍光信号が示されます。ここでは、蛍光インターカレーション染料を用いてチューブスキャナーで蛍光信号をリアルタイムでモニタリングした結果を示しています。

反応液中のDNAテンプレート量が10^6、10^4、10^3、100コピーの場合、蛍光シグナルはそれぞれ14、18、21、23分後にベースラインを上回ります。習熟すれば、この手順は90分で完了します。本アッセイの開発により、資源の限られた地域におけるCoxiella burnetii感染症の迅速な診断への道が開かれました。

このビデオを視聴することで、凍結乾燥されたLAMP試薬の復元方法について十分に理解できるはずです。患者サンプルは感染性がある可能性があるため、この手順を行う際は常に安全上の注意を払うことを忘れないでください。