肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

我々は、幹細胞特性および腫瘍発癌能を示す癌細胞の亜集団においてHLA-Iがエピジェネティックに減少することを発見した。HLA-Iのダウンレギュレーションは免疫脱出に直接関係し、がん幹細胞の生存利点を提供し、HLA-I否定性をこれらの細胞の正確な機能マーカーにします。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポスドクであるSudeh Izadmehrです。

サンプルを取得すると、滅菌バイオセーフティキャビネット内の100ミリメートルペトリ皿に組織を入れ、500マイクロリットルの無菌PBSを皿に加えます。滅菌メスを使用して、0.1ミリメートルを超える断片がなくなるまで、組織を小片に機械的に三分化します。35マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通してPBSの500マイクロリットルのボリューム全体を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。

組織断片にさらに500マイクロリットルのPBSを加え、組織を再びミンチします。次に、細胞ストレーナーを通して上清を同じ採取管にフィルターし、サンプルが完全に解き分けるまで組織片をミンチし続けます。細胞の最後の体積が収集されたら、遠心分離によって腫瘍細胞をスピンダウンし、5ミリリットルの分解緩衝液中のペレットを再中断する。

室温で5分後、別の遠心分離で細胞を収集し、別の5ミリリットルのPBSでペレットを洗浄します。PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、生存細胞を数える。氷上のPBS濃度200マイクロリットル当たり7番目の細胞に10倍に希釈し、200マイクロリットルの基質膜マトリックスを穏やかな混合で細胞に加えます。

次に、細胞懸濁基膜マトリックスを皮下にNOD scidガンママウスの側面に注入し、週に2回注射部位で腫瘍の成長を確認する。腫瘍が直径1センチメートルに達したら、腫瘍を半分に切り、組織学的分析のために一晩4%パラホルムアルデヒドで異種移植片の半分を固定する。単一の細胞懸濁液を達成することを実証したように腫瘍の後半を処理し、5%FBS濃度を補ったPBSの1ミリリットル当たり6細胞に2倍10に細胞を希釈した。

細胞懸濁液を1つのアイソタイプ制御と1つの抗体チューブの間で分割する前に、氷上の細胞を30分間維持します。各チューブ内の細胞数に注意し、抗体チューブ内の細胞を抗HLA抗体とアイソタイプコントロールチューブ内の細胞と、氷上で90分間のインキュベーションのための適切な抗アイソタイプ対照抗体と混合します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって両方の細胞集団を収集し、続いて遠心分離によって2つの10ミリリットルPBSの水を吸う。

2回目の洗浄後、ペレットをDAPI1ミリリットル当たり10マイクログラムで10ミリリットルの7細胞に10倍に再懸濁する。次に、35マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して、各セル懸濁液を個々の12 x 75ミリメートルのポリスチレンチューブにフィルターします。蛍光活性化細胞選別後、HLA-I陰性および陽性細胞集団を、サルコスフィア増殖培地の15ミリリットルで10倍~5番目の細胞濃度をサブセット当たり10倍に希釈する。

細胞を10~4番目、10〜3番目、2濃度10に10に連続して希釈して15ミリリットルの新鮮なサルコスフィア成長培地で希釈し、各希釈から100マイクロリットルの細胞を1つの96ウェル超低接着性細胞培養板の各ウェルに添加する。プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素細胞培養インキュベーターに入れ、光顕微鏡でサルコスフィア形成を毎日監視し、3日ごとに培地を変えることなく各ウェルに新鮮な基本的な線維芽細胞成長因子と表皮成長因子を加える。3週間後、HLA-I陰性細胞とHLA-I陽性細胞の両方の細胞希釈ごとにサルコスフィア陽性およびサルクスフィア陰性ウェルの数をカウントし、ポアソン確率分布に基づいて球形成細胞周波数の計算を可能にする。

典型的には、ヒト患者由来肉腫異種移植片は、親の原発腫瘍によって示されたものと同様の組織学を有する2つの異なるHLA-I陽性および負の集団から構成される。示されるように、患者由来異種移植片腫瘍を起知する細胞の蛍光活性化細胞選別は、親細胞集団からの多数のHLA-I陰性細胞の濃縮を促進する。HLA-I陰性細胞は、わずか10個の細胞の初期入力で球を形成し、HLA-I陽性肉腫患者が異種移植腫瘍開始細胞に到着したよりも高い腫瘍形成能力を示すことができる。

同じマウスの反対側に同じ数のHLA-I陰性および陽性細胞を皮下に注射すると、HLA-I陰性細胞が有意に高い腫瘍形成能を有することを示す。HLA-I陰性および陽性亜集団の両方によって形成される異種移植片は細胞性不均一な腫瘍である。さらに、腫瘍開始細胞の遺伝子発現解析により、HLA-I陰性細胞が幹細胞分化マーカーを発現し、脂肪原性および骨形成経路の両方に沿って分化誘導できることが明らかになり、強い油-赤-OおよびアリザリンレッドS染色および培養が実証される。

この方法は、様々なヒト癌における癌幹細胞を単離するために使用することができる。分子炭化は、例えば、次世代シーケンシングによって、細胞を治療的に標的化するための一般的なマーカーを明らかにすることができる。我々の発見は、HLA-Iの回復が機能的ユニット免疫細胞増強戦略の成功のための重要なステップであることを示している。