Name: 肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-06-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 18 s
Description: 学ぶ FACSを用いた肉腫患者由来異種移植片からのHLA-I陰性腫瘍始発細胞の単離法。がん幹細胞の免疫逃避と腫瘍形成能を評価し、標的治療開発に寄与する重要な手法です。

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この研究はNCI-P01-CA087497(C.C.C.に)によって支持された。 そして、D.H.とNIH-U 54-0OD020353(C.C.C.、D.H.、およびJ.D.D.)、アジレント思考リーダー賞(C.C.C.C.)、およびマーテル財団(C.C.C.およびJ.D.D.)。

ここで議論されたマウス実験のためのすべてのプロトコルは、機関ガイドラインに従って、マウントシナイ医療センター機関人間研究倫理委員会と動物ケアと使用委員会によって承認されました。
1. 肉腫組織試料の処理とPDX形成
<ol><li>機関審査委員会が承認したプロトコルの下で、病理学サービス担当者が手術標本から肉腫サンプルを準備し、直ちに100mmペトリ皿の氷の上に各サンプルを置く。</li>
	<li>15 mLポリスチレン円錐管にサンプルを入れ、10%の胎児ウシ血清(FBS)と1%ペニシリン/ストレプトマイシンを補充した冷たいロズウェルパーク記念研究所(RPMI)1640培養培地の6 mLを用いた。組織サンプルを直ちに処理します。</li>
	<li>
(オプション)骨肉腫のみの場合は、軟部組織肉腫のためにスキップすることができる次の手順に従ってください。
	<ol>
<li>メスを使ってティッシュを20mm3に切ります。コラゲナーゼ溶液の3 mLを含む15 mLチューブ(1mg/mLコラゲナーゼを有するRPMI 1640)に組織片を移す。</li>
		<li>30分間37°Cの水浴にチューブを入れます。</li>
		<li>チューブを徹底的に渦にし、次に、コラゲナーゼ活性を中和するために10%FBSを補充したRPMI 1640の3 mLを添加する。</li>
		<li>室温で350 x gで5分間遠心分離機。上清を取り除く。</li>
	</ol>
</li>
	<li>滅菌バイオセーフティキャビネットで作業し、100 mmペトリ皿に組織サンプルを置きます。無菌1xリン酸緩衝生理食塩分(PBS)の500 μLを組織に加えます。滅菌メスを使用して、目に見えるティッシュ片が0.1mmより大きくなるまで、組織を機械的に小片にトリチュレートします。</li>
	<li>500 μLセルサスペンションを35μmセルストレーナーに移し、50 mLポリスチレンチューブで濾過した懸濁液を回収します。この50 mLポリスチレンチューブを氷の上にセルサスペンションを入れてください。</li>
	<li>組織にさらに500 μLのPBSを加えます。2回目のトリチュレートは、セルストレーナーを介して懸濁液を移し、同じ50mLチューブに集める。</li>
	<li>組織セクションが完全に解離されるまで、これらのステップ(ステップ1.5-1.6)を繰り返し、通常は6x - 8x。</li>
	<li>室温で10分間350xgで遠心分離による細胞懸濁液をペレットする。上清を廃棄し、5 mLの解血バッファー(0.15 M NH4Cl、10 mM KHCO3、および0.1 mM EDTA)を使用してペレットを再懸濁し、赤血球を除去するために室温で5分間溶液をインキュベートする。</li>
	<li>室温で350 x gで5分間遠心分離機を使用し、熱化バッファーを除去します。5 mLのPBSでペレットを洗浄します。350 x gで5分間遠心分離機を再び取り除き、上清を取り除きます。</li>
	<li>PBSの1 mLでペレットを再ステージングし、ヘモサイトメーターまたはその他の代替方法を使用して生存細胞数をカウントします。細胞を200μLのPBSで1 x 107細胞の最終濃度に希釈する。セルサスペンションを氷の上に置いておきます。</li>
	<li>地下膜マトリックスを氷の上に置いて溶かします。200 μL細胞懸濁液に200 μLの地下膜マトリックスを追加します。ゆっくりと混ぜて氷の上に置いてください。</li>
	<li>細胞懸濁液:基基膜マトリックス(1:1)混合物を2匹のNODサイッドガンマ(NSG)マウスの側面に皮下に注入する。注入ごとに 200 μL を使用します。</li>
	<li>マウスの注射部位を週2回確認してPDX形成を監視する。直径1cmに達したら腫瘍異種移植片を取り除く。</li>
</ol>2. PDXからのFACSによる腫瘍始動細胞の分離
<ol><li>前述の12に記載されているように、マウスからPDXを外科的に取り除く。</li>
	<li>腫瘍を半分に切って一晩4%のパラホルムアルデヒドで異種移植片の半分を固定します。これは組織学的分析のためです。上記のように組織の残りの半分を処理し(ステップ1.3-1.8)腫瘍細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>PBSでペレットを再中断し、実行可能なセル番号をカウントします。</li>
	<li>5%FBSを補充したPBS中の細胞懸濁液を2 x 106細胞/mLの濃度に希釈する。細胞懸濁液を氷の上に30分間放置し、2本のチューブにセル懸濁液を割ります。同位体制御と抗体でチューブをマークします。各チューブ内のセル数に注意してください。</li>
	<li>5%FBS(1:250)を補充したPBSで抗体を希釈して2x HLA-1-PE抗体を調製する。同じ条件で陰性アイソタイプコントロール抗体を希釈する。「抗体」チューブから希釈抗体(1:1)と細胞懸濁液を混合し、最終的な抗体希釈を1:500にします。同位数制御(1:1)と「同位板制御」チューブからセル懸濁液を混ぜます。セルサスペンションを氷の上に90分間置き、その場に置き下ろします。</li>
	<li>4°Cで350 x gで5分間遠心分離機を取り除き、上清を取り除きます。ペレット2xを洗浄するためにPBSの10 mLを追加します。</li>
	<li>PBSに4',6-6-ジアミド-2-フェニリンドール(DAPI)を10μg/mLの最終濃度に加えます。このDAPI溶液をセルペレットに追加し、107細胞/mLの細胞懸濁液を作ります(ステップ2.4からの細胞番号を使用)。</li>
	<li>35 μm ストレーナーキャップを通してセルサスペンションを12 mm x 75 mm ポリスチレンチューブにフィルタリングします。</li>
	<li>フローサイトメーターを使用して、HLA-1 陰性 TIC サブ母集団6をソートします。ゲート生存細胞(DAPI陰性)とHLA-1陰性および-陽性の両方のサブ集団を2つの15 mL回収管に集め、それぞれRPMI 1640培養培地の4mLを含む。</li>
</ol>3. 腫瘍始発細胞の特性
<ol><li>サルコスフィア形成
	<ol>
<li>α-MEM細胞培養培地を用いてサルコスフェア増殖培地を作る。B-27サプリメント(1x)、N2サプリメント(1x)、基本線維芽細胞増殖因子(bFGF)(20 ng/mL)、表皮成長因子(EGF)(20 ng/mL)およびペニシリン/ストレプトマイシン(100 IU/mL)の最終濃度を作るためにサプリメントを追加します。使用前に0.2 μmの細胞培養フィルターで培地を濾過します。</li>
		<li>ステップ2.9から並べ替えられたHLA-1陰性および-正のサブ母集団をペレットし、各サブ母集団の細胞数をカウントする。</li>
		<li>1.5 x 106細胞をサルコ球増殖培地の15mLに希釈し、1 x 105細胞/mLの細胞希釈を行う。</li>
		<li>新鮮なサルコ球増殖培地で細胞を連続的に希釈し、10 4、103、および102細胞/mLの各細胞希釈の15mLを作る。次に、4枚の96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートを調製し、それぞれ細胞希釈用に用いる。</li>
		<li>10 5細胞/mL希釈から最初の96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液を移します。このプレートは、各井戸に104細胞を有する。</li>
		<li>他の3つの細胞希釈に対して、他の3つの96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートを使用します:10 4、103、および102細胞/mL。96ウェル超低アタッチメント細胞培養プレートの各ウェルに100μLの細胞懸濁液を移します。これらの3つの培養プレートは、それぞれ1,000細胞/ウェル、100細胞/ウェル、および10細胞/ウェルを持っています。</li>
		<li>プレートを37°C、5%CO2細胞培養インキュベーターに入れます。</li>
		<li>新しいbFGFおよびEGFを細胞培養培地(20ng/mLの最終濃度)に3日ごとに直接加え、懸濁培養中に失われた細胞を避けるために培地を変えることなく。</li>
		<li>光顕微鏡を使用して、図2Aに示すように、毎日3週間サルコ球形成を監視する。</li>
		<li>3週間後、HLA-1陰性およびHLA-1陽性細胞の両方の各細胞希釈のサルコ球陽性ウェルとサルコスフェア陰性ウェルの数をカウントします。</li>
		<li>ポアソン確率分布13に基づいて球形成細胞周波数を計算する。HLA-1 陰性の TIC を HLA-1 陽性バルクセルと比較します。</li>
	</ol></li>
	<li>シリアル希釈腫瘍形成アッセイ
	<ol>
<li>手順 2.9 から HLA-1 負および -正の亜集団をカウントします。</li>
		<li>PBSを有する細胞の連続希釈を10 6、10 5、104、および103細胞/mLの濃度にする。10匹のマウスにおける腫瘍形成に各希釈の1mLを使用する。</li>
		<li>各希釈の1mL細胞懸濁液に基塩膜マトリックスの1mLを加える(1:1)。各混合物の2 mLを氷の上に保管してください。</li>
		<li>細胞の200 μLを皮下に注入する:NGSマウスの側面に基基基膜マトリックス混合物を注入し、同じマウスのもう一方のフランクに対してHLA-1陰性細胞およびHLA-1陽性細胞を用いた。希釈ごとに、10匹のマウスを使用する。注射用の針で25G注射器を使用してください。</li>
		<li>腫瘍の増殖速度に応じて、マウスの腫瘍形成を4~8週間モニタリングする。</li>
		<li>異なる入力細胞数における腫瘍形成のパーセンテージによって腫瘍を始動する細胞頻度を計算する。HLA-1 陰性の TIC を HLA-1 陽性バルクセルと比較します。</li>
	</ol></li>
	<li>間葉系経路に沿った誘導分化
	<ol>
<li>前の手順で形成されたサルコスフィアを使用します(ステップ 3.1.9)。サルコスフィアを新しい6ウェルプレートに移します。2.5mLのα-MEMを用いたサルコスフェアを10%FBSで培養し、細胞を培養板表面に付着させる。</li>
		<li>2日間の添付ファイルの後、培養培地を10%FBSで補充したα-MEMから10%FBSおよびヒト間葉系幹細胞(hMSC)増殖培地で補充されたα-MEMの1:1混合物に切り替える。</li>
		<li>2 日後、完全な hMSC 成長培地に切り替えます。</li>
		<li>細胞が90%の合流に達したら、hMSC培地を吸引し、分化培地を加える。骨原分化のために、骨原分化培地(hMSC増殖培地に10nMデキサメタゾン、5mMβ-グリセロリン酸、50μg/mL L-アスコルビン酸、および10mM塩化リチウムを添加する)を加える。脂肪原分化のために、脂肪細胞分化培地(hMSC増殖培地は0.5 μMデキサメタゾン、0.5 μMイソブチルメチルキサンチン、および50μMのインドメタシンを添加する)を追加する。</li>
		<li>分化媒体を3日ごとに変更します。</li>
		<li>3〜4週間後、分化を停止し、PBSで細胞を洗浄します。次いで、PBSを吸引し、10%ホルマリンの2mLを細胞に加えて固定する。細胞を室温で45分間座らせます。脱イオン水で洗う。アリザリンレッドS染色(ステップ3.3.6.1)またはオイルレッドO染色(ステップ3.3.6.2)の準備が整いました。<ol>
<li>骨原分化を検出するには、アリザリンレッドS染色を行います。水を吸引し、アリザリンレッドS作動溶液(2%アリザリンレッドS、pH 6.0)を細胞に2mL加え、染色のために5分間座らせます。脱イオン水で細胞を洗浄し、顕微鏡で反応を観察します。</li>
			<li>脂肪原性分化を検出するには、オイルレッドO染色を行います。<ol>
<li>オイルレッドO溶液を作ります。イソプロパノールの100 mLにオイルレッドO粉末の300mgを添加することにより、ストック溶液を調べます。</li>
				<li>使用前の2時間以内に、脱イオン水の2つの部分(20 mL)でオイルレッドOストック溶液の3つの部品(30 mL)を混合します。混合物が室温で10分間座るようにします。</li>
				<li>使用前に作業ソリューションをフィルタリングします。</li>
				<li>ステップ3.3.6に従って調製した細胞から水を取り除きます。60%イソプロパノールの2mLを加えて細胞単層を覆い、細胞は2分間座る。</li>
				<li>イソプロパノールを取り出し、オイルレッドO作動液を2mL加えます。細胞が室温で5分間座るようにします。</li>
				<li>脱イオン水で細胞をすすいで、光顕微鏡で反応を観察します。</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Medema, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+the+challenges+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: the challenges ahead.</a> Nature Cell Biology. 15 (4), 338-344 (2013).</li>
<li>Jordan, C., Guzman, M., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells.</a> The New England Journal of Medicine. 355 (12), 1253-1261 (2006).</li>
<li>Jordan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells%3A+controversial+or+just+misunderstood%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells: controversial or just misunderstood?</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 203-205 (2009).</li>
<li>Bapat, S., Mali, A., Koppikar, C., Kurrey, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Research. 65 (8), 3025-3029 (2005).</li>
<li>Charafe-Jauffret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+cell+lines+contain+functional+cancer+stem+cells+with+metastatic+capacity+and+a+distinct+molecular+signature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Breast cancer cell lines contain functional cancer stem cells with metastatic capacity and a distinct molecular signature.</a> Cancer Research. 69 (4), 1302-1313 (2009).</li>
<li>Domingo-Domenech, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+acquired+docetaxel+resistance+in+prostate+cancer+through+depletion+of+notch-+and+hedgehog-dependent+tumor-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells.</a> Cancer Cell. 22 (3), 373-388 (2012).</li>
<li>Reya, T., Morrison, S., Clarke, M., Weissman, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells%2C+cancer%2C+and+cancer+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem cells, cancer, and cancer stem cells.</a> Nature. 414 (6859), 105-111 (2001).</li>
<li>Yi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+DNA+methylation+of+CD133+in+colorectal+and+glioblastoma+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Abnormal DNA methylation of CD133 in colorectal and glioblastoma tumors.</a> Cancer Research. 68 (19), 8094-8103 (2008).</li>
<li>Ginestier, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALDH1+is+a+marker+of+normal+and+malignant+human+mammary+stem+cells+and+a+predictor+of+poor+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome.</a> Cell Stem Cell. 1 (5), 555-567 (2007).</li>
<li>Garrido, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+history+of+HLA+expression+during+tumour+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+Today%22%5BJournal%5D)">Natural history of HLA expression during tumour development.</a> Immunology Today. 14 (10), 491-499 (1993).</li>
<li>Chang, C. C., Campoli, M., Ferrone, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Classical+and+nonclassical+HLA+class+I+antigen+and+NK+cell-activating+ligand+changes+in+malignant+cells%3A+current+challenges+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Classical and nonclassical HLA class I antigen and NK cell-activating ligand changes in malignant cells: current challenges and future directions.</a> Advances in Cancer Research. 93, 189-234 (2005).</li>
<li>Han, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+sarcoma+tumor-initiating+cells+through+differentiation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting sarcoma tumor-initiating cells through differentiation therapy.</a> Stem Cell Research. 21, 117-123 (2017).</li>
<li>Hu, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELDA%3A+Extreme+limiting+dilution+analysis+for+comparing+depleted+and+enriched+populations+in+stem+cell+and+other+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">ELDA: Extreme limiting dilution analysis for comparing depleted and enriched populations in stem cell and other assays.</a> Journal of Immunology. 347, 70-78 (2009).</li>
</ol>

著者は何も開示していない。

このプロトコルの成功を制限するいくつかの重要なステップは、ヒト肉腫PDXから腫瘍を起こし始める細胞を分離し、特徴付ける。我々は、PDX形成が肉腫のサブタイプに大きく依存することを観察した。組織学的に未分化性の表現型を持つ臨床的積極的な肉腫(例えば、多形非分化肉腫[成功率100%、n=2]、脱分化脂肪肉腫[成功率100%、n=2]、およびシノバル肉腫[ 成功率100%、n=3])はPDX形成の成功率が高い。 一方、分化表現型を持つ肉腫(例えば、十分に分化した脂肪肉腫[成功率0%,n=3])は、より低いPDX形成率を示す。 腫瘍を起用する細胞は、悪性の少ない分化サブタイプよりも高い割合で、より悪性のサブタイプに存在する可能性があります。さらに、細胞の生存率の損失を最小限に抑えるために、腫瘍を起点にする細胞単離手順を1日以内に停止することなく終了することをお勧めします。
我々は、HLA-1陰性細胞がヒト肉腫に広く存在することを同定した。しかし、HLA-1陰性細胞の割合は、異なる患者からのサンプル間で異なる場合があります。この方法により、0.5%未満から30%12以上の範囲のHLA-1陰性細胞を有するサンプルから腫瘍始発細胞を単離することに成功した。単離されたHLA-1陰性細胞の腫瘍始まり細胞同一性を確認するためには、球形成および腫瘍形成アッセイによってHLA-1陰性細胞を機能的に特徴付ける必要がある。
ただし、ここで説明するプロトコルにも制限があります。以前のデータは、HLA-1発現がエピジェネティックに調節され、同じ腫瘍12内におけるHLA-1発現の細胞不均一性の観察と一致することを示した。HLA-1ゲノム変異は肉腫および他の癌タイプで検出された。HLA-1遺伝子の突然変異は、腫瘍全体の細胞表面におけるHLA-1の完全な喪失、または非機能的変異HLA-1を発現させる可能性がある。いずれの場合も、HLA-1否定性は腫瘍内のICを同定するために使用することはできません。
HLA-1をネガティブマーカーとして用いることで、様々なヒト肉腫亜型からチークを分離し、機能解析により結果を検証することに成功しました。そこで、これらのTICを標的とした特異的な治療法を開発するために、TIC上の遺伝子発現解析を含む分子研究を行うことができました。

ヒト癌の腫瘍内細胞の不均一性は、過去10年間の証拠の増加によって支持されてきた1.正常な組織と同様に、癌組織は、腫瘍形成能力を示すTIC(癌幹細胞とも呼ばれる)の小さなサブ集団で構成されています。一方、癌細胞の大部分は、分化された型2を示す。これらのティックは、幹細胞マーカーの発現および自己再生および非対称細胞分裂の両方の能力を含む幹細胞様特性を示し、したがって、細胞の異種腫瘍3の形成を開始することができる。最近の研究では、TICが腫瘍開始の原因であるだけでなく、腫瘍の攻撃性4、転移5、および薬剤耐性6にも関連していることが明らかになった。したがって、チークの生物学を理解し、これらのTICを対象とした特定の治療戦略を策定することが重要です。
FACS ベースのメソッドは、CD133、CD24、および CD441を含む TIC マーカーを使用して TIC を識別するために使用されています。これらのマーカーのほとんどは、正常な幹細胞7でも発現される。ただし、これらのマーカーのいずれも、単に TIC をマークしません。これらの分子がCIの悪性腫瘍に果たす役割は、まだ明らかではない。例えば、CD133はDNAメチル化によって頻繁に不活性化され、したがって、この腫瘍間不均一性は、これらのマーカー8の精度をレンダリングし得る。ALDH1は、チーク9のステムを維持するためにも機能するマーカーです。乳がんのNCを同定する上でより効果的であるようだが、他の腫瘍タイプ9では依然として疑わしい。いくつかのシグナル伝達経路は、Wnt(翼のない関連統合部位)、TGF-β(変換成長因子ベータ)、およびヘッジホッグ1を含む幹細胞生物学において重要な役割を果たす。しかし、これらの経路がTIC特異的であることを証明し、これらの経路の活性を使用して、チクシーを原発性腫瘍から分離することは困難です。したがって、信頼性の高い新規TICマーカーが緊急に必要とされる。
ヒトMHCクラスIは、HLA-1とも呼ばれ、ほぼすべての核細胞10で発現する細胞表面タンパク質である。HLA-1は、CD8T細胞10によって特異的に認識される分子を提示する抗原として機能する。CD8 T細胞の細胞傷害作用は、癌細胞がHLA-1によって腫瘍抗原を提示すると活性化することができる。したがって、癌細胞の細胞表面にHLA-1を欠いていると、細胞傷害性CD8 T細胞からの免疫脱出につながる可能性がある。HLA-1のダウンレギュレーションは、異なるタイプのヒト癌に記載されており、予後不良、転移、および薬剤耐性11と相関している。我々は、細胞表面上のHLA-1発現の損失が肉腫、ならびに前立腺癌6、12におけるICを同定するために使用できることを示した。
ここでは、FACSによってヒト肉腫PDXからICを分離し、負のマーカーとしてHLA-1を用いて、これらのHLA-1陰性ICをさらに検証し、特徴付ける詳細なプロトコルについて説明する。

<table><tbody><tr><td>0.2 &mu;m 細胞培養フィルター</td><td>ThermoFisher</td><td>450-0020</td><td></td></tr><tr><td>100 mm ペトリ皿</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 円錐管</td><td>Falcon</td><td>352196</td><td></td></tr><tr><td>35 &mu;m 細胞ストレーナー</td><td>Falcon</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>50 mL ポリスチレンチューブ</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェル超低接着細胞培養プレート</td><td>Corning</td><td>7007</td><td></td></tr><tr><td>Alizarin Red S</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>08-0085SA</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>PHG0021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>デキサメタゾン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4902</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Invitrogen</td><td>PHG0311</td><td></td></tr><tr><td>HLA-1-PE抗体</td><td>Abcam</td><td>ab43545</td><td></td></tr><tr><td>hMSC増殖培地</td><td>ATCC</td><td>PCS-500-030</td><td></td></tr><tr><td>インドメタシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td></td></tr><tr><td>イソブチルメチルキサンチン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>アイソタイプコントロール抗体</td><td>Abcam</td><td>ab103534</td><td></td></tr><tr><td>L-アスコルビン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>塩化リチウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62476</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>Corning</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>MEM Alpha</td><td>Gibco</td><td>12571-063</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NSG マウス</td><td>The Jackson Lab</td><td>005557</td><td></td></tr><tr><td>Oil Red O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O0625</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>針付きシリンジ</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>&β;-グリセロリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

Isolation and Characterization of Tumor-initiating Cells from Sarcoma Patient-derived Xenografts

腫瘍始動細胞(TIC)の存在と重要性は、過去10年間に証拠を増やすことによって支えられてきました。これらのTICは、腫瘍の開始、転移、および薬剤耐性の原因であることが示されている。したがって、現在の化学療法戦略に加えて、特異的なTICターゲティング療法を開発することが重要であり、主に非TICの大部分に焦点を当てています。チークの悪性腫瘍の背後にあるメカニズムをさらに理解するために、ヒト肉腫のCIを分離し、特徴付ける方法を説明する。本明細書では、ヒト肉腫の患者由来異種移植片(PDX)を生成し、ヒト白血病抗原クラスI(HLA-1)を陰性マーカーとして用いる蛍光活性化細胞選別(FACS)によりICを単離する詳細なプロトコルを示す。また、球体形成アッセイや腫瘍形成アッセイを含むこれらのICを機能的に特徴付け、間葉系経路に沿って分化を誘導する方法についても述べている。PDX TICの分離と特性特性は、潜在的な標的治療試薬の発見の手がかりを提供します。さらに、証拠の増加は、このプロトコルが他のタイプのヒト癌からTICを分離し、特徴付けるためにさらに拡張される可能性があることを示唆している。

ヒト肉腫PDXが生成され、染色された。腫瘍内不均一性はHLA-1抗体を用いた免疫組織化学によって示された。異種移植片は、HLA-1陽性および陰性(図1A)12という2つの異なる亜集団から構成された。肉腫PDXは、親原発性腫瘍と組織学的類似性を示した(図1A)。肉腫PDX TICはFACSによって分離された。二重選別法を用いて、HLA-1陰性細胞は、親細胞集団から非常に濃縮された(図1B)12。
幹細胞で発現した遺伝子(例えば、Oct4、Nanog、およびMyc)は、HLA-1陽性の細胞と比較した場合、単離されたHLA-1陰性細胞において高発現していることがわかった(図1C)。Sox-9は、乳癌などの他の癌幹細胞において重要な役割を果たしていると報告された発達遺伝子を、HLA-1陰性細胞で特異的に発現した(図1D)。
単離されたHLA-1陰性サブ集団を検証するために、細胞の自己再生能を調べるためにサルコシュフェア形成アッセイを行った。HLA-1陰性細胞は、わずか10セル(図1E)12の初期入力で球を形成することができた。腫瘍形成能を調べるために、シリアル希釈腫瘍形成アッセイが行われた。同じ数のHLA-1陰性および-陽性細胞を、同じマウスの各側面に皮下に注入した。HLA-1陰性細胞は有意に高い腫瘍形成能を示した(図1F)12、一方、HLA-1陰性および-陽性亜集団の両方によって形成された異種移植片は細胞細胞不均一腫瘍であった(図1H)。
単離されたHLA-1陰性TIC12の遺伝子発現解析を行った。正常間葉系細胞分化に関連する遺伝子は、TIC12において上昇した。そこで、HLA-1チークが末端分化に誘導され、腫瘍形成能力が低下するかどうかも試験した。結果は、HLA-1陰性細胞がリポゲン性および骨元経路の両方に沿って分化し、強いオイルレッドOおよびアリザリンレッドS染色を示すために誘導されうることを示した(図1G)。対照的に、HLA-1陽性細胞は同じ条件下で分化しない。したがって、これらの結果は、肉腫のTICを標的にするために使用されうる有望な分化療法戦略を示す。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig1.jpg"> 図1:腫瘍内異種肉腫PDXからのHLA-1陰性細胞の単離(A) HLA-1陰性細胞(矢印)は、免疫組織化学(IHC)によりヒト肉腫の異なるサブタイプで見出された。(a と b)細胞肉腫をクリアします。(c および d)多形性脂肪肉腫。(e および f)レイモミオ肉腫(g および h)悪性末梢神経鞘腫瘍。(i および j)脂肪肉腫、特に指定されていません。(k および l)脂肪肉腫を分解した。スケールバー= 100 μm. (B) 肉腫PDXは親腫瘍(ヘマトキシリンおよびエオシン[H&amp;E]染色)と組織学的に類似しており、IHCによるHLA-1発現において細胞の不均一性を示した。ここでは、透明細胞肉腫(CCS)、脱分化軟骨肉腫(DCS)、および脱分化脂肪肉腫(DDL)を含む肉腫PDXの代表的な写真を示しています。スケールバー = 100 μm. (C) HLA-1陰性細胞のサブ集団を二重ソート法でフローサイトメトリーにより単離した。上から下へ:最初のソート、2番目のソート、および純度チェック。単離されたHLA-1陰性およびHLA-1陽性細胞は、腫瘍形成アッセイを含むその後の機能分析を行った。この図の結果は、前のパブリケーション12からのものです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig1large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57011/57011fig2.jpg"> 図2:機能アッセイによるHLA-1陰性ICの特徴付け(A) 球体形成アッセイは、わずか10個のHLA-1陰性細胞が肉腫球を形成できることを示した。左:肉腫球の代表的な写真。右: 球体形成周波数;平均±SD.スケールバー=100μm(B)肉腫PDXから単離されたHLA-1陰性細胞は、高い腫瘍原性であった。以下は、DDL由来のHLA-1陰性および-陽性細胞によって形成された腫瘍の代表的な写真である。HLA-1陰性およびHLA-1陽性DDL細胞の千細胞を、同じマウスの別々の側面に注入した。(C) 幹細胞遺伝子のmRNAレベルOct4、Nanog、およびMycはHLA-1陽性細胞と比較してHLA-1陰性細胞において高いレベルで発現した。 データは平均±SD(n=5)を表す。(D)オイルレッドOおよびアリザリンレッドSの強い陽性染色は、肉腫のICから誘導されるリポ原性および骨因性経路に沿った末端分化を示す。(E) HLA-1陽性(左)および-陰性(右)亜集団によって形成されるPDXのHLA-1免疫染色。スケールバー = 100 μm。この図の結果は、前のパブリケーション12からのものです。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57011/57011fig2large.jpg" target="_blank">この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

蛍光活性化細胞選別によるヒト肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍開始細胞の単離に関する詳細なプロトコルを説明し、ヒト白血病抗原-1(HLA-1)を陰性マーカーとして用い、さらなる検証を行う。これらのHLA-1陰性腫瘍始発細胞の特徴付け。

The existence and importance of tumor-initiating cells (TICs) have been supported by increasing evidence during the past decade. These TICs have been ...

我々は、幹細胞特性および腫瘍発癌能を示す癌細胞の亜集団においてHLA-Iがエピジェネティックに減少することを発見した。HLA-Iのダウンレギュレーションは免疫脱出に直接関係し、がん幹細胞の生存利点を提供し、HLA-I否定性をこれらの細胞の正確な機能マーカーにします。この手順のデモンストレーションは、私たちの研究室のポスドクであるSudeh Izadmehrです。サンプルを取得すると、滅菌バイオセーフティキャビネット内の100ミリメートルペトリ皿に組織を入れ、500マイクロリットルの無菌PBSを皿に加えます。滅菌メスを使用して、0.1ミリメートルを超える断片がなくなるまで、組織を小片に機械的に三分化します。35マイクロメートルの孔細胞ストレーナーを通してPBSの500マイクロリットルのボリューム全体を50ミリリットルの円錐形チューブに移します。組織断片にさらに500マイクロリットルのPBSを加え、組織を再びミンチします。次に、細胞ストレーナーを通して上清を同じ採取管にフィルターし、サンプルが完全に解き分けるまで組織片をミンチし続けます。細胞の最後の体積が収集されたら、遠心分離によって腫瘍細胞をスピンダウンし、5ミリリットルの分解緩衝液中のペレットを再中断する。室温で5分後、別の遠心分離で細胞を収集し、別の5ミリリットルのPBSでペレットを洗浄します。PBSの1ミリリットルでペレットを再懸濁し、生存細胞を数える。氷上のPBS濃度200マイクロリットル当たり7番目の細胞に10倍に希釈し、200マイクロリットルの基質膜マトリックスを穏やかな混合で細胞に加えます。次に、細胞懸濁基膜マトリックスを皮下にNOD scidガンママウスの側面に注入し、週に2回注射部位で腫瘍の成長を確認する。腫瘍が直径1センチメートルに達したら、腫瘍を半分に切り、組織学的分析のために一晩4%パラホルムアルデヒドで異種移植片の半分を固定する。単一の細胞懸濁液を達成することを実証したように腫瘍の後半を処理し、5%FBS濃度を補ったPBSの1ミリリットル当たり6細胞に2倍10に細胞を希釈した。細胞懸濁液を1つのアイソタイプ制御と1つの抗体チューブの間で分割する前に、氷上の細胞を30分間維持します。各チューブ内の細胞数に注意し、抗体チューブ内の細胞を抗HLA抗体とアイソタイプコントロールチューブ内の細胞と、氷上で90分間のインキュベーションのための適切な抗アイソタイプ対照抗体と混合します。インキュベーションの終了時に、遠心分離によって両方の細胞集団を収集し、続いて遠心分離によって2つの10ミリリットルPBSの水を吸う。2回目の洗浄後、ペレットをDAPI1ミリリットル当たり10マイクログラムで10ミリリットルの7細胞に10倍に再懸濁する。次に、35マイクロメートルの細孔ストレーナーを通して、各セル懸濁液を個々の12 x 75ミリメートルのポリスチレンチューブにフィルターします。蛍光活性化細胞選別後、HLA-I陰性および陽性細胞集団を、サルコスフィア増殖培地の15ミリリットルで10倍~5番目の細胞濃度をサブセット当たり10倍に希釈する。細胞を10~4番目、10〜3番目、2濃度10に10に連続して希釈して15ミリリットルの新鮮なサルコスフィア成長培地で希釈し、各希釈から100マイクロリットルの細胞を1つの96ウェル超低接着性細胞培養板の各ウェルに添加する。プレートを摂氏37度、5%の二酸化炭素細胞培養インキュベーターに入れ、光顕微鏡でサルコスフィア形成を毎日監視し、3日ごとに培地を変えることなく各ウェルに新鮮な基本的な線維芽細胞成長因子と表皮成長因子を加える。3週間後、HLA-I陰性細胞とHLA-I陽性細胞の両方の細胞希釈ごとにサルコスフィア陽性およびサルクスフィア陰性ウェルの数をカウントし、ポアソン確率分布に基づいて球形成細胞周波数の計算を可能にする。典型的には、ヒト患者由来肉腫異種移植片は、親の原発腫瘍によって示されたものと同様の組織学を有する2つの異なるHLA-I陽性および負の集団から構成される。示されるように、患者由来異種移植片腫瘍を起知する細胞の蛍光活性化細胞選別は、親細胞集団からの多数のHLA-I陰性細胞の濃縮を促進する。HLA-I陰性細胞は、わずか10個の細胞の初期入力で球を形成し、HLA-I陽性肉腫患者が異種移植腫瘍開始細胞に到着したよりも高い腫瘍形成能力を示すことができる。同じマウスの反対側に同じ数のHLA-I陰性および陽性細胞を皮下に注射すると、HLA-I陰性細胞が有意に高い腫瘍形成能を有することを示す。HLA-I陰性および陽性亜集団の両方によって形成される異種移植片は細胞性不均一な腫瘍である。さらに、腫瘍開始細胞の遺伝子発現解析により、HLA-I陰性細胞が幹細胞分化マーカーを発現し、脂肪原性および骨形成経路の両方に沿って分化誘導できることが明らかになり、強い油-赤-OおよびアリザリンレッドS染色および培養が実証される。この方法は、様々なヒト癌における癌幹細胞を単離するために使用することができる。分子炭化は、例えば、次世代シーケンシングによって、細胞を治療的に標的化するための一般的なマーカーを明らかにすることができる。我々の発見は、HLA-Iの回復が機能的ユニット免疫細胞増強戦略の成功のための重要なステップであることを示している。

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肉腫患者由来異種移植片からの腫瘍始発細胞の単離と特徴付け

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