解剖やイトヨ鰓スケルトンのフラットマウント

本手順の目的は、トゲウオの鰓骨格を解剖し、フラットマウントすることです。この手法は、動物がどのように新しい環境に適応し、発生過程でどのように成体の形態学的変異が生じるかなど、発生学、遺伝学、および進化論の分野における重要な問いに対する答えを得るのに役立ちます。

この手法の主な利点は、鰓骨格を切り出してフラットマウントすることで、ホールマウントでは研究できない様々な栄養的形質を視覚化できることです。準備として、三棘側抜魚の頭部骨格形態に関する関連情報を確認してください。解剖のための魚の準備が整ったら、鋭利な5番ピンセットを眼の側面に45度の角度で挿入し、眼を覆う膜を穿刺することから始めてください。

次に、ヨーグルトの容器の蓋を剥がすようにして、眼膜を剥がします。続いて、開いたピンセットを眼の背後に挿入し、視神経を掴んで眼を取り出します。このとき、眼を突き刺すとメラニンが漏れ出すため、注意してください。

反対側の眼でもこの操作を繰り返します。次に、小型はさみの刃を鰓蓋フラップの後端の下に入れ、鰓蓋上の背側の軟組織を眼窩に向かって切断します。続いて、眼窩の背側にある前頭骨を切断します。

次に、眼窩の中央付近で、副蝶形骨の中央線を切断します。反対側でも同様に鰓蓋の切開を行います。以降の手順では、骨盤棘をハンドルとして使用できます。

それらを体から直接ゆっくりと引き離すことで、展開させます。次に、ピンセットをオペルクル（蓋）の下に挿入し、顔面を体からゆっくりと剥離させます。その過程で、まだ付着している軟組織を切り取りながら行います。

鰓耙（さいは）の周囲では注意し、それらを損傷させないようにしてください。顔面骨を除去する際、percollと共に第1鰓弓骨を誤って掴んでしまいやすいため注意が必要です。percollを前方に剥がす際は、余計な部位を掴んでいないか、その下を確認しながら行ってください。

次に、ピンセットを用いて、正中線のbasihyalの両側からceratohyalsを切り離しながら、前頭頭蓋顔面骨格を剥がして取り除きます。反対側でも同様に繰り返します。前頭頭蓋顔面骨格には、顎全体、舌骨格全体、その下にある背側および軟骨内骨化要素、および頭蓋骨の前部が含まれます。

次に、閉じたピンセットを腸管のすぐ下に挿入し、前方へ引きます。その際、鰓骨に付着している残りの筋肉や靭帯を丁寧に剥がします。その後、閉じたピンセットの先端を用いて、背側鰓骨を腹側脳頭蓋に付着させている筋肉を掻き出します。

後方から前方への動きで掻き出します。スティックルバックの反対側でも同様に筋肉の除去工程を繰り返します。次に、腸管の基部を掴んで前方に引き抜き、鰓骨格を除去します。

第5鰓弓骨の後方で、腸管を垂直に切断して分離します。よくある間違いは、腸管を前方で掴みすぎてしまい、腹側前方の管が取り残されることです。必ず胸腔の深部後方で掴むようにしてください。余分な腸管は後でいつでも取り除くことができます。

鰓骨格の背面側にある脳頭蓋から残っている骨片を取り除きます。その後、鋏を鰓籠に挿入し、左右の背面歯板の間を背面側で切開します。この際、背面歯板に損傷を与えないよう、切開位置を中央に保ってください。

次に、鰓骨の後端にあるゴム状の腸腔に、浅い側切開を2箇所入れます。腸管の前端において、鰓骨を開きやすくするために行います。

次に、骨格を50%グリセロールおよび0.25%水酸化カリウムを満たしたマイクロ遠心チューブに移し、緩やかな透過処理を行います。あるいは、これ以上の透過処理が不要な場合は、純粋なグリセロールに移してください。再染色が必要な場合は、テキストプロトコルに詳細が記載されています。

封入の準備として、溶液を純グリセロールに交換し、チューブを少なくとも5分間振盪します。次に、鰓骨を取り出し、22×60 mmのガラスカバースリップの底部付近に背側を上にして配置します。その後、骨格の上にグリセロールを数滴滴下します。

次に、造形粘土を小さく2つ丸め、カバーガラスの両端に1つずつ配置します。これらはスペーサーとして機能します。その後、2枚目のカバーガラスを標本の上に緩やかに置き、前鰓骨格が平坦になる程度の圧力をかけます。ここで、背側歯板を含む左側の背側フラップを剥がし、2枚のカバーガラスの間にそのフラップを滑り込ませます。

同様に右背側フラップに対しても操作を行います。その後、鰓骨格全体をカバーガラスの端から遠ざけます。手順を完了させるために、上のカバーガラスを軽く押し、クレイボールを平らにします。

鰓骨格が平らに固定される程度の圧力をかけます。ただし、押し潰されないように注意してください。作業中に鰓耙の列が隠れてしまった場合は、カバーガラスの間にピンセットを滑り込ませ、鰓弓（ceratobranchial）または標本全体の位置を調整してください。

純粋なグリセロールでフラットマウントした場合、標本は室温で少なくとも10年間、平坦な状態で保存することが可能です。このプロトコルにより、鰓骨格の摘出およびフラットマウントが行われ、さまざまな重要な栄養形質を時系列で記録することができます。

背面から観察すると、すべての鰓耙（さいは）列、すべての咽頭歯板、およびほぼすべての鰓骨を容易に視覚化し、年輪を記録することができます。アリザリンレッドSは、ロダミンまたは同様のレッドフィルターで蛍光を発するため、他のマーカーを用いた二重標識や代替的な視覚化手法が可能です。この画像では、鰓耙にキャレット記号（^）が付されています。

歯は矢印で、骨はアスタリスクで示しています。習得すれば、解剖は数分で完了し、数百匹の個体に対しても比較的迅速に実施することが可能です。今回はトゲウオの鰓骨格の解剖を実演しましたが、この手順が様々な魚種へのガイドとして活用されることを期待しています。

鰓骨格を解剖することで、ホールマウントでは確認できないさまざまな重要な栄養的形質を、迅速かつ容易に可視化することができます。これにより、頭蓋顔面骨格の発達と進化に関する理解を深めることが可能になります。