血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

この微小外科的手法の総合的な目的は、軸方向に血管化され、移植可能な組織を構築し、生体内および単離され十分に特性解析された環境において血管新生を分析するための動静脈ループを作製することです。この手法を用いることで、個々の患者のニーズに合わせたさまざまな種類の軸方向血管化組織を生成するための生体リアクターとして、自身の身体を利用することが可能です。本技法の主な利点は、作製された組織をその血管アクセスとともに移植でき、レシピエント側の局所血管に接続することで、酸素と栄養分を即座に供給できる点にあります。

組織工学の研究に加えて、この手法は生体内における血管狭窄プロセスの知見を得るためにも有用です。また、がんの血管新生などの病理学的状況にも適用可能です。一般的に、サブミリメートル血管の微小吻合など、手術の複雑さが非常に高いため、この手法に不慣れな方は習得に苦労すると考えられます。

この手法のアイデアは、広範な組織欠損を伴い、ドナー部位に大幅な可動性を生じさせる血管柄付き組織の移植が必要な臨床症例に直面した際に得られました。適切な麻酔を確認した後、ラットの体重を測定して薬剤投与量を算出します。その後、麻酔中の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。

鎮痛剤と抗生物質を投与した後、ラットをヒートパッドの上に置き、イソフルランを 지속的に投与します。次に、足指へのピンチテストを用いて麻酔深度を再確認します。可能であれば、パルスオキシメトリを用いてラットの麻酔レベルも確認してください。

後肢の内側を剃毛します。その後、ベタジンとアルコールを用いて手術部位を交互に洗浄し、消毒します。次に、後肢を広げて粘着テープで固定します。

最後に、ラットを手術用顕微鏡の下に配置し、ドレープを掛けます。滅菌手順に従って手術を進めてください。メスを用いて、左大腿部中央の膝上部から鼠径部にかけて縦切開を加え、皮膚を開きます。

次に、解剖用鋏とマイクロフォーセップスを用い、皮下組織と筋膜を約3cmの長さで層状に切除します。鼠径部の骨盤動脈から膝まで、大腿血管束が露出するまで切除を続けます。次に、組織用鋏とマイクロフォーセップスを用いて血管を剥離し、周囲の組織を除去します。

必要に応じて、電気凝固を用いて側枝を凝固させます。完了後、術野を湿ったガーゼで覆い、ラットの右側でも同様の手順を繰り返します。これで最初の処置が対称的に完了したため、静脈グラフトの採取を開始します。

まず、右大腿静脈の近位端と遠位端を電気凝固で結紮し、約1〜1.5 cmのグラフトを採取します。次に、マイクロ鉗子を用いて静脈グラフトを取り出します。静脈グラフトの開口部を拡張するには、血管拡張器を使用します。

次に、灌流カニューレを使用して、静脈グラフトをヘパリン溶液でフラッシュします。フラッシュしたグラフトを左大腿部へ移動させ、右側の術野を湿ったガーゼで覆います。続いて、微小血管クランプを用いて、左側の鼠径部近位で大腿静脈を結紮します。

次に、分枝前の膝上部で大腿静脈の遠位端を凝固させます。吻合では、静脈グラフトの近位端を静脈の近位端に、11-0縫合糸を用いて端端吻合術で接続します。まず、12時と6時の位置に最初の2本の縫合糸を配置することから始めてください。

次に、前面のこれらの点との間にさらに2〜3本の縫合糸を入れます。続いて、背面にもさらに2〜3本の縫合糸を入れます。ループ血管の吻合は、本プロトコルにおいて最も重要な工程です。

ループ血管の閉塞リスクを軽減するため、縫合を可能な限り正確に行うことが重要です。次に、大腿静脈の結紮と同様に、マイクロ血管クランプで大腿動脈を固定し、電気凝固を用いて結紮します。次へ進む前に、ループ化した血管がねじれていないことを確認してください。

次に、先に示したのと同じ縫合技術を用いて、静脈グラフトの遠位端を動脈の近位端と吻合します。2回目の吻合後、ヘパリン 25 iu を静脈内に投与します。ここで、ループ血管がねじれていないことを再確認し、クランプを取り除きます。

ループを約5分間観察し、漏出がないことと開通性を確認します。開通していれば、ループが拡張し、動脈の拍動が確認できます。観察中は、血管痙攣を防ぐためにパパベリンを血管に滴下してください。

次に、マトリックス混合液の半分（約0.5 mL）をインプランテーションチャンバーに予め注入します。その後、ループをインプランテーションチャンバーに埋め込みます。チャンバーの入口を2つのフィブリン凝塊で密閉し、残りのマトリックス混合液を注入して、総量を1 mLにします。

次に、大腿部にチャンバーを固定し、蓋でチャンバーを密閉し、非吸収性6-0縫合糸で蓋を固定します。その後、さらに非吸収性6-0縫合糸を用いて、インプラントチャンバーを大腿部に固定します。電気凝固を用いて止血を行います。

最後に、吸収性4-0縫合糸で皮膚を閉じ、創部をアルミスプレーで覆います。骨組織工学の目的で、ラットのA-Vループ小動物モデルに数種類の異なる骨代替材を移植しました。血管新生は3DマイクロCTを用いて観察しました。

加工したウシ海綿骨マトリックスを6週間事前に血管化させたことで、注入した骨芽細胞の生存率が向上しました。ループを採取し、移植後のさまざまな時点で切片作成および染色を行いました。例えば、H&E染色により、間葉系幹細胞と共にβ-三リン酸カルシウム・ヒドロキシアパタイト骨代替物を使用したところ、6週間以内に多くの血管接続が形成されたことが示されました。

この手法を習得し、適切に実施すれば、5〜6時間で完了させることができます。本手順に従うことで、多種多様な細胞因子や抗体を移植し、幅広い条件での検討を行うことが可能です。また、本手法は大型動物の羊静脈ループモデルでも適用可能です。

これにより、研究者は臨床的に有用な大量の血管新生組織を作製することが可能になります。このモデルは、病理学的条件下での血管新生を研究する機会を提供する可能性があります。例えば、腫瘍血管ネットワーク形成におけるさまざまな成長因子や細胞の影響を調査することができます。