Name: 血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: 学ぶ動静脈ループのマイクロ外科的手法による血管化組織工学と血管新生研究。この技術は個別化医療への応用と病理状態での血管形成メカニズム解明に有用です。

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私たちは、AVループ研究を支援するために、次の機関に感謝したいと思います：ステッドラー財団、博士フリッツエルラーフォン、ジェンダーと多様性のためのエルスクローネFesenius財団、バクスター・ヘルスケア社、DFG、IZKF / ELAN / EFI /オフィス、Forschungsstiftung Medizin 、エアランゲン・ニュルンベルク（FAU）、AO財団、マンフレッド・ロス財団、雪香港、ハンス・ゲオルク・ガイス財団、ドイツ学術交流会（DAAD）、ドイツ、および高等教育省と科学研究、イラクのフリードリヒ・アレクサンダー大学。私たちは、その優れた技術サポートのためのステファン・フライシャー、マリーナミルデ、カトリン・コーンとイルゼアーノルド・Herberthに感謝したいと思います。

エアランゲン・ニュルンベルク（FAU）のフリードリヒ・アレクサンダー大学の動物実験委員会とミッテルフランケン、ドイツ政府は、すべての実験を承認しました。実験のため、300の体重を有する雄のLewisラット - 350 gを使用しました。 1.ラットにおける動静脈ループモデル<ol><li> 移植手順（図2） <ol><li>麻酔のためにイソフルラン気化器にチューブを介して接続されており、蓋によって閉鎖されている特殊なプラスチック製のボックスを使用します。供給ガスをオンにして、0.8との間の流量計 - 1.5 L /分。 </li><li>誘導プラスチックの箱にラットを置き、上部を密封します。 5パーセントにイソフルラン気化器の電源をオンにします。 </li><li>慎重に麻酔の導入時にラットを観察します。 3後 - 4分、ラットを麻酔されます。 </li><li>適切な麻酔の確認：正向反射の消失、眼瞼反射の消失、引っ込め反射、正の角膜反射を。 </li><li>箱からラットを削除し、そのを確認します薬物の計算のための重量。麻酔下ながら乾燥を防ぐために、眼軟膏を適用します。 </li><li>鎮痛薬と抗生物質投与（ 例えば 、7.5ミリグラム/キログラムのエンロフロキサシン皮下（s）、12.5ミリグラム/キログラムトラマドール及び/ kgのメタミゾール100mgの両方の静脈内（IV））。動作中の体重に適応クリスタを管理する（ 例えば 、30ミリリットル/ kg皮下）。 </li><li>マスクを介して投与2％イソフルラン吸入- 1麻酔下で、37℃で加温プレート上にその背中にラットを置きます。 </li><li>適切に麻酔を監視し、麻酔のレベルが低すぎる場合（ラットの運動、痛みに応じて、顎のトーン、反射の損失なし（1.1.4を参照。）、心拍数が増加）をイソフルランを高めます。イソフルラン（角膜反射の消失、高い心拍数、酸素飽和度の低下）を過剰摂取しないように注意してください。ラットの - （450 /分250） - （100％95）と心拍数、酸素飽和度をチェックするための小動物のための特別なパルス酸素濃度計を使用してください。 operati中、ラットのモニタ温度に（36から40°C）、必要に応じて加温プレートの温度を調整します。 </li><li>電気かみそりで後肢の内側を剃るし、防腐剤を有する領域を消毒します。後肢を広げ、粘着テープで固定し。 </li><li>手術用顕微鏡下でラットを置き、滅菌ドレープでラットをカバーしています。全体の操作手順は、無菌条件下で行われることを確認してください。 </li><li>メス（10号）を使用して、鼠径部への上位膝から縦切開で左太ももの真ん中で肌を開きます。 </li><li>大腿維管束が膝大腿動脈の分岐部に鼠径部の骨盤動脈から露出するまで解剖ハサミとマイクロピンセットを用いて、長さが約3cmの層における皮下組織および筋膜をカットします。 </li><li>血管を分離し、外膜のハサミとマイクロピンセットを用いて、外膜を除去します。 </li><li> b側を凝固電気凝固を使用して牧場。湿った圧縮とオペレーションフィールドをカバーしています。 </li><li> 1.1.14 - 左サイドで説明したように、1.1.11を右側の皮膚を開きます。 </li><li> 1.5センチメートル - 静脈グラフトを採取するために、1の距離で近位端と遠位端上の電気凝固により右大腿静脈を結紮。 </li><li>マイクロピンセットで静脈グラフトを除去し、ヘパリン溶液で静脈グラフトをフラッシュ（0.9％塩化ナトリウム溶液中にmlの50 IU /）灌漑カニューレを使用して、左大腿部に転送します。湿った湿布で右側のオペレーションフィールドをカバーしています。 </li><li>微小血管クランプと鼠径部に近位左側の大腿静脈を結紮。約2cmの距離で、分岐する前に上部膝で、電気凝固によって遠位大腿静脈を凝固。 </li><li>吻合のため11-0 suturでエンドツーエンドの吻合によって静脈の近位端と静脈グラフトの近位端に接続電子。約8中断縫合糸を使用してください。 12時と6時の位置に最初の2本の縫合糸を配置することで始まります。そして、フロント側のこれらの点の間に2〜3以上の縫合糸に入れ、裏面に3以上の縫合糸に2を入れました。 </li><li>大腿静脈（1.1.18。）のために説明したのと同じ方法で、大腿動脈を結紮。ループ血管がねじれていないことを確認してください。大腿静脈に記載のように動脈の近位端を有する静脈グラフトの遠位端を吻合（1.1.19ステップ）。 </li><li>静脈内に25 IUのヘパリンを管理します。ループ血管がねじれていないされ、再びていることを確認し、クランプを外し、約5分間ループの漏れや開通性を確認してください。 </li><li>血管のドリブルパパベリン（ 例えば、4 mg / mlで）は、血管痙攣を防止します。開通性がある場合、ループが展開され、動脈の脈拍を観測することができます。 </li><li> 例えば（行列の最初の半分（約500μL）で注入室を事前入力&lt;/ em&gt;の、細胞の有無にかかわらず、ヒドロゲルまたは骨基質）。注入チャンバ内にループを埋め込みます。 </li><li>千マイクロリットルの総容量に行列の後半で注入チャンバーを埋めます。チャンバ蓋付き容器を密閉。 </li><li>非吸収性縫合糸6-0と大腿部に注入チャンバーを修正しました。非吸収性の6-0縫合糸でチャンバ蓋を固定してください。電気凝固で可能な出血を止めます。 </li><li>吸収性4-0縫合糸で皮膚を閉じます。アルミスプレーで傷をカバーしています。 </li><li>抗生物質や鎮痛剤を投与する（ 例えば、7.5ミリグラム/キログラムエンロフロキサシン皮下、飲料水を介して、OS（PO当たりトラマドール12.5ミリグラム/キログラム）（）3 -ラットの行動に応じて5日間、その後）。 </li><li>オフ気化器の電源を入れ、目覚め始めるまでラットは、供給ガスを呼吸することができます。 </li><li>熱サポート付きのボックスにラットを置き、完全に回復するまで慎重に観察します。 </li><li>ラット解除のままにしないでくださいそれは胸骨横臥位を維持するのに十分な意識を取り戻したまで出席しました。 </li><li>完全に回復するまで、他の動物の会社にラットを返さないでください。 </li></ol></li><li> 外植手順 <ol><li>短時間または長時間注入後の外移植を行う（研究デザインに応じて、例のための参考資料27-32を参照してください）。ステップ1.1.1.-1.1.9に従ってラットを麻酔。 </li><li>メス（10号）で腹部の皮膚を開き、圧縮して脇に腸を動かします。綿棒を使用して、尾腹部大動脈と大静脈を公開します。 </li><li>腹部大動脈（ 例えば 、24ゲージのプラスチックカニューレ）をカニューレを挿入し、解剖ハサミで大静脈尾を切りました。 </li><li>漏出液が透明になるまで100 IU / mlのヘパリンを含む0.9％塩化ナトリウム溶液で腹部大動脈をフラッシュします。 30 mlの灌流液（ 例えば 、造影剤またはインドで大動脈を灌流K）。 </li><li>深い麻酔中 - （0.2ミリリットル/キログラム0.1）embutramide、mebezonium、ヨウ化テトラカイン塩酸塩注射液の致死量の注射によってラットを安楽死させます。 </li><li>非吸収性4-0縫合糸で腹部大動脈と大静脈尾を連結。 </li><li> 2クランプ - 1で開いた創傷領域を閉じます。 4°C（灌流液の硬化）で24時間、ラットを保管してください。 </li><li>その背中にラットを置きます。後肢を広げ、粘着テープで固定し。 </li><li>メス（10号）で縦切開でチャンバー上の皮膚を開きます。 </li><li>解剖ハサミとマイクロピンセットを用いてチャンバとループ茎から結合組織を削除します。解剖ハサミでチャンバ開口部から1センチメートルの距離でループ茎をカットし、室内を削除します。 </li><li>チャンバーの蓋を開け、慎重にピンセットでチャンバーから構造物を除去し、室温で24時間、4％緩衝ホルマリン溶液中でそれを修正温度。その後、3Dマイクロコンピュータ断層撮影法またはパラフィン包埋組織学的分析の30ための構築物を使用しています。 </li></ol></li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

10年以上にわたり、我々は、組織工学のために動静脈（AV）ループを正常に使用していると、小さな動物モデルにおいてin vivoでの血管新生を研究します。我々は、この顕微モデルが異なる組織を操作するための、それはまた、血管新生または抗血管新生研究のために使用することができる非常によく適していることを示している可能性があります。 既存の/代替方法に関して技術の意義 操作された組織または器官は、彼らが欠損部位41への移植後の生存および統合の成功のために必要な栄養と酸素を供給するために機能的な血管網を必要とします。異なるprevascularization戦略の数は、in vitro対in vivoで 、固有のアプローチ対外因性に応じて区別することができる、過去数十年にわたって開発されてきました。 足場はファブリカすることができます管状の構造とテッドと、このような試験管42<...

人体のほとんどの組織や器官は、栄養素を供給するガスを交換し、老廃物を除去する機能血管網に依存しています。局所または全身の血管の問題によって引き起こされるこのシステムの機能不全は、深刻な病気の多数につながることができます。また、このような組織工学や再生医療などの研究分野において、人工的に生成された組織または移植された臓器内の機能的血管網が成功臨床応用のために不可欠です。 何十年もの研究者らは、新規な治療的介入を見つけて、血管障害のより良い予防を提供するために、病理学的な状況へのより深い洞察を得るために成長している血管系に関与する正確なメカニズムを調査してきました。第1のステップでは、そのような細胞-細胞相互作用または血管系の細胞上の分子の影響のような基本的なプロセスは、通常、インビトロ 2Dまたは3Dによって調査されています実験。従来の2Dモデルは、実行が容易であり、十分に確立されており、これらのプロセスのより良い理解に大きく貢献してきました。 1980年に初めて、フォークマンら 。ゼラチンコーティングしたプレート1上の毛細血管内皮細胞のin vitroでの血管新生の播種に報告しました。これはすぐに、さらに2D血管新生内皮細胞管形成アッセイ2、遊走アッセイ3と異なる細胞タイプ4の共培養上の実験と同様に、他の多数の出版物に道を譲りました。これらのアッセイは、今日でも使用され、 インビトロ方法における標準として受け入れられています。 ほとんどの細胞型は、関連する生理学的組織構造5を形成するために、3D環境を必要とするので、この実験は、常に、 インビボ細胞挙動の研究には適していません。三次元マトリックスのアーキテクチャは、毛細管morphogenesiために決定的であることを示すことができS 6と、その細胞の細胞外マトリックス（ECM）相互作用および3D培養条件は、腫瘍の血管新生7に関与する重要な因子を調節します。 3Dマトリックスは、エフェクタータンパク質と結合し、組織規模溶質濃度勾配を確立することができ、複雑な機械的な入力を提供します。また、それは複雑な組織5においてインビボ形態形成およびリモデリングの手順で模倣するために必要であると考えられます。これらのシステムでは、血管新生および脈管の両方を研究することができます。血管新生は、血管8既存の毛細血管の出芽を説明しているが、脈管形成は、内皮細胞またはその前駆体9,10を介して血管のデノボ形成を指します。血管の成熟は、平滑筋細胞11の動員を介して 「動脈形成」と呼ばれるプロセスに記載されています。 インビトロモデルにおける典型的な血管新生は、既存の単層からの内皮細胞の発芽でありますSは、ゲル内または内皮細胞スフェロイド12を構築することにより、埋め込まれたミクロスフェアの表面に、ゲル表面上の単層として播種しました。血管性のモデルでは、単一の内皮細胞は3Dゲル内に捕捉されています。それらは、典型的には支持セル12と組み合わせて、新規血管構造とネットワークを形成するために隣接の内皮細胞と相互作用します。 しかし、 インビトロモデルでさえ複雑な3Dは完全に細胞-細胞および細胞- ECMは13の相互作用の多数与えられたin vivoでの設定で模倣することはできません。高いインビトロ活性を有する物質は、自動的にその逆も 14と同じin vivoでの効果とを示していません。血管新生プロセスの総合的な分析のためのより良い体内の状況をシミュレートするin vivoモデルで開発することが急務です。 インビボ血管新生アッセイの広い範囲を含めて、文献に記載されていますヒヨコ漿尿膜アッセイ（CAM）、ゼブラフィッシュモデル、角膜血管新生アッセイ、背気嚢モデル、背側皮下脂肪チャンバー、皮下腫瘍モデル14。しかし、これらのアッセイは、多くの場合、このような急速な形態学的変化、CAMアッセイ、または角膜血管新生アッセイ15内の限られたスペース内にすでに存在するものから区別する新たな毛細血管内の問題などの制限に関連しています。また、非哺乳動物システムが使用されている（ 例えば 、ゼブラフィッシュモデル16）異種移植17で問題につながります。隣接する組織が大幅に血管新生プロセスに寄与するため、皮下腫瘍モデルでは、腫瘍自体からのみ由来する血管新生を分析することはできません。また、周囲の組織は、腫瘍微小環境18の形成に決定的な役割を持つことができます。 血管新生又は脈管形成を研究するためだけでなく、強いneがありますEDのための標準化およびin vivoモデルでも組織工学と再生医療における異なる血管新生の戦略を研究するための十分に特徴付けられました。今日、複雑な人工器官または組織の発生は、 インビトロおよびインビボの両方が可能です。 3Dのbioprintingは、複雑な3D機能的なリビング組織19を生成するためのオンデマンド製造技術を提供します。さらに、バイオリアクターは、組織20、あるいは自身の体を生成するために使用することができるバイオリアクター21として使用することができます。しかし、人工的に生成された組織の成功のアプリケーションに対する主な障壁は工学構成物内の血管新生の欠如です。移植後の宿主の血管系への即時の接続は、特に大規模な人工組織または器官の場合には、生存のための主要な前提条件です。 in vitroまたはin vivo prevascularization戦略の異なるがdevelにしましたOPEDは移植前22に構築物における機能的な微小血管系を確立します。マウスの背部皮膚へのin vitroでの予備形成工学毛細血管と足場の移植は23日以内に、マウスの血管系の急速な吻合につながりました。対照的に、三次元の前血管ネットワークに組み立てヒト間葉系幹細胞およびヒト臍静脈内皮細胞からなるスフェロイド共培養は、in vivo移植後さらに開発しました。しかし、ホスト血管系との吻合は24限られていました。中でも、このような壊死性や照射領域として不十分に血管新生の欠陥で、このいわゆる外因性血管新生 - 足場に周辺地域からの血管の内部成長は - 多くの場合失敗します。内因性血管新生は、他の一方で、足場25に発芽新しい毛細血管のソースとして、血管の軸に基づいています。軸方向の血管新生のアプローチを使用して、改変された組織は、その血管軸を移植し、レシピエント部位での局所血管に接続することができます。すぐに移植後、組織が適切に最適な統合のための適切な条件を作成し、酸素と栄養、によってサポートされています。 in vivoでの血管新生を調査するために軸方向血管組織の生成の重要性が増していることの認識におけるモデルの利用が限らに、我々は動物モデル26における動静脈（AV）ループを生成するために、さらにエロルとスピラの顕微手法を開発しました。完全に閉じた注入室を使用することは、この方法は非常によくよくインビボ条件を特徴とする 「制御」（ 図1）の下で血管形成を研究するために最適です。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適な組織ENGINのための足場の軸方向の血管新生に適していますeering目的。

<table><tbody><tr><td>0.9% 塩化ナトリウム</td><td>Berlin-Chemie AG</td><td>34592508</td><td></td></tr><tr><td>11-0 エチロン/ポリアミド 6/6</td><td>Ethicon</td><td>EH7438G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 ビクリル/ポリガラクチン 910</td><td>Ethicon</td><td>V392H</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Prolene / ポリプロピレン</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウムスプレー</td><td>Pharma Partner Vertriebs-GmbH</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>防腐剤&nbsp;</td><td>BODE Chemie GmbH&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>カテーテル&nbsp;</td><td>B Braun Meslungen AG</td><td>4251612-02</td><td></td></tr>造<tr><td>影剤</td><td>フローテック</td><td>&nbsp;MV-122</td><td></td></tr><tr><td>エンブトラミド、ヨウ化メベゾニウム、塩酸テトラカイン注射液&nbsp;</td><td>Intervet International GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>encre de chine intense Indian ink</td><td>Lefranc &ブルジョア</td><td></td><td></td></tr><tr><td>エンロフロキサシン</td><td>バイエルAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>眼軟膏</td>バイ<td>エルAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン4%</td><td>カールロスGmbH&Co. KG</td><td>P087.4</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>レシオファームGmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン&nbsp;</td><td>アボットラボラトリーズ</td><td>6055482</td><td></td></tr><tr><td>ルイスラット、オスの</td><td>チャールズリバーラボラトリーズ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メタミゾール-ナトリウム&nbsp;</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>papaverine / Paveron N</td><td>Linden Arzneimittel-Vertrieb-GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tramadol / Tramal</td><td>Gr&uuml;ネンタールGmbH</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（av）ループ

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

機能的な血管ネットワークは、人体のほぼすべての組織と器官の生存と成長のための前提条件です。また、がんなどの病理学的状況では、血管新生が疾患の進行に主導的な役割を果たします。そのため、血管新生のメカニズムを解明し、組織工学や再生医療のためのさまざまな血管新生アプローチを開発するためには、標準化され、十分に特徴付けられたin vivoモデルが強く求められています。
私たちは、動静脈(AV)ループに吻合された静脈と動脈からなる血管軸の誘導のための小動物モデルのための顕微手術アプローチについて説明します。AVループは密閉された移植チャンバーに移され、生体内で孤立した微小環境を作り出し、血管軸によってのみ生体に接続されます。3Dイメージング(MRI、マイクロCT)と免疫組織学を使用して、成長する血管系を経時的に視覚化できます。さまざまな細胞、成長因子、マトリックスを埋め込むことで、血管ネットワーク形成におけるそれらの機能を、十分に制御可能な環境で周囲からの邪魔な影響なしに分析できます。
血管新生の研究に加えて、AVループモデルは血管新生組織のエンジニアリングにも完全に適しています。一定の血管前形成時間の後、生成された組織を欠損部位に移植し、局所血管に顕微鏡手術で接続できるため、手術された組織の即時の血液供給と統合が保証されます。マトリックス、細胞、成長因子、チャンバー構造を変化させることで、さまざまな組織を作製し、個々の患者のニーズに合わせて調整することができます。

ヒト組織工学 骨組織工学の目的のために、異なる代用骨の数は、小動物ラットAVループモデル27,28,33,34に移植しました。血管新生は、完全な3Dマイクロコンピュータ断層撮影（マイクロCT）（ 図3A）によって実証することができます。処理された牛海綿骨（PBCB）行列の血管新生は、血管新生のない群と比較してループ群で有意に高かったです。常に成長とmaturating血管網は、8週間にわたって注入チャンバー内で開発します。いかなる増加は、非血管新生群33で検出されなかった4および8週の間に、構築物の中心に向かって血管組織の継続的な成長が観察されました。 AVループモデルでの6週間のPBCB行列のPrevascularizationは、コントロール骨芽細胞と比較して、注入された骨芽細胞の優れた生存につながりました。対照群とは対照的に、骨特異的遺伝子の発現は、移植骨芽細胞28とAVループ群で検出されました。さらに、マトリックスのよ...

我々は、単離され、十分に特徴付けられた環境で、in vivoで血管新生を分析するためのモデルとして動静脈（AV）ループの生成のための顕微的なアプローチを説明します。このモデルだけでなく、血管新生の研究のために有用であるだけでなく、最適なエンジニアリングを軸方向に血管および移植組織に適しています。

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

この微小外科的手法の総合的な目的は、軸方向に血管化され、移植可能な組織を構築し、生体内および単離され十分に特性解析された環境において血管新生を分析するための動静脈ループを作製することです。この手法を用いることで、個々の患者のニーズに合わせたさまざまな種類の軸方向血管化組織を生成するための生体リアクターとして、自身の身体を利用することが可能です。本技法の主な利点は、作製された組織をその血管アクセスとともに移植でき、レシピエント側の局所血管に接続することで、酸素と栄養分を即座に供給できる点にあります。組織工学の研究に加えて、この手法は生体内における血管狭窄プロセスの知見を得るためにも有用です。また、がんの血管新生などの病理学的状況にも適用可能です。一般的に、サブミリメートル血管の微小吻合など、手術の複雑さが非常に高いため、この手法に不慣れな方は習得に苦労すると考えられます。この手法のアイデアは、広範な組織欠損を伴い、ドナー部位に大幅な可動性を生じさせる血管柄付き組織の移植が必要な臨床症例に直面した際に得られました。適切な麻酔を確認した後、ラットの体重を測定して薬剤投与量を算出します。その後、麻酔中の乾燥を防ぐために眼軟膏を塗布します。鎮痛剤と抗生物質を投与した後、ラットをヒートパッドの上に置き、イソフルランを 지속的に投与します。次に、足指へのピンチテストを用いて麻酔深度を再確認します。可能であれば、パルスオキシメトリを用いてラットの麻酔レベルも確認してください。後肢の内側を剃毛します。その後、ベタジンとアルコールを用いて手術部位を交互に洗浄し、消毒します。次に、後肢を広げて粘着テープで固定します。最後に、ラットを手術用顕微鏡の下に配置し、ドレープを掛けます。滅菌手順に従って手術を進めてください。メスを用いて、左大腿部中央の膝上部から鼠径部にかけて縦切開を加え、皮膚を開きます。次に、解剖用鋏とマイクロフォーセップスを用い、皮下組織と筋膜を約3cmの長さで層状に切除します。鼠径部の骨盤動脈から膝まで、大腿血管束が露出するまで切除を続けます。次に、組織用鋏とマイクロフォーセップスを用いて血管を剥離し、周囲の組織を除去します。必要に応じて、電気凝固を用いて側枝を凝固させます。完了後、術野を湿ったガーゼで覆い、ラットの右側でも同様の手順を繰り返します。これで最初の処置が対称的に完了したため、静脈グラフトの採取を開始します。まず、右大腿静脈の近位端と遠位端を電気凝固で結紮し、約1〜1.5 cmのグラフトを採取します。次に、マイクロ鉗子を用いて静脈グラフトを取り出します。静脈グラフトの開口部を拡張するには、血管拡張器を使用します。次に、灌流カニューレを使用して、静脈グラフトをヘパリン溶液でフラッシュします。フラッシュしたグラフトを左大腿部へ移動させ、右側の術野を湿ったガーゼで覆います。続いて、微小血管クランプを用いて、左側の鼠径部近位で大腿静脈を結紮します。次に、分枝前の膝上部で大腿静脈の遠位端を凝固させます。吻合では、静脈グラフトの近位端を静脈の近位端に、11-0縫合糸を用いて端端吻合術で接続します。まず、12時と6時の位置に最初の2本の縫合糸を配置することから始めてください。次に、前面のこれらの点との間にさらに2〜3本の縫合糸を入れます。続いて、背面にもさらに2〜3本の縫合糸を入れます。ループ血管の吻合は、本プロトコルにおいて最も重要な工程です。ループ血管の閉塞リスクを軽減するため、縫合を可能な限り正確に行うことが重要です。次に、大腿静脈の結紮と同様に、マイクロ血管クランプで大腿動脈を固定し、電気凝固を用いて結紮します。次へ進む前に、ループ化した血管がねじれていないことを確認してください。次に、先に示したのと同じ縫合技術を用いて、静脈グラフトの遠位端を動脈の近位端と吻合します。2回目の吻合後、ヘパリン 25 iu を静脈内に投与します。ここで、ループ血管がねじれていないことを再確認し、クランプを取り除きます。ループを約5分間観察し、漏出がないことと開通性を確認します。開通していれば、ループが拡張し、動脈の拍動が確認できます。観察中は、血管痙攣を防ぐためにパパベリンを血管に滴下してください。次に、マトリックス混合液の半分（約0.5 mL）をインプランテーションチャンバーに予め注入します。その後、ループをインプランテーションチャンバーに埋め込みます。チャンバーの入口を2つのフィブリン凝塊で密閉し、残りのマトリックス混合液を注入して、総量を1 mLにします。次に、大腿部にチャンバーを固定し、蓋でチャンバーを密閉し、非吸収性6-0縫合糸で蓋を固定します。その後、さらに非吸収性6-0縫合糸を用いて、インプラントチャンバーを大腿部に固定します。電気凝固を用いて止血を行います。最後に、吸収性4-0縫合糸で皮膚を閉じ、創部をアルミスプレーで覆います。骨組織工学の目的で、ラットのA-Vループ小動物モデルに数種類の異なる骨代替材を移植しました。血管新生は3DマイクロCTを用いて観察しました。加工したウシ海綿骨マトリックスを6週間事前に血管化させたことで、注入した骨芽細胞の生存率が向上しました。ループを採取し、移植後のさまざまな時点で切片作成および染色を行いました。例えば、H&amp;E染色により、間葉系幹細胞と共にβ-三リン酸カルシウム・ヒドロキシアパタイト骨代替物を使用したところ、6週間以内に多くの血管接続が形成されたことが示されました。この手法を習得し、適切に実施すれば、5〜6時間で完了させることができます。本手順に従うことで、多種多様な細胞因子や抗体を移植し、幅広い条件での検討を行うことが可能です。また、本手法は大型動物の羊静脈ループモデルでも適用可能です。これにより、研究者は臨床的に有用な大量の血管新生組織を作製することが可能になります。このモデルは、病理学的条件下での血管新生を研究する機会を提供する可能性があります。例えば、腫瘍血管ネットワーク形成におけるさまざまな成長因子や細胞の影響を調査することができます。

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ウサギの動静脈瘻構築のための改良技術

発芽血管新生は、発生と疾患の基本であり、複雑な分子的および機械的プロセスに関与しています。ブタの頸動脈からの細胞芽を解析し、硬さ依存性の血管新生と明確なリーダーフォロワー細胞力学を明らかにする、汎用性の高い2.5D ex vivo...

生体組織における発芽血管新生の ex vivo 機械的特性評価のための2.5Dモデル

学ぶ動静脈ループのマイクロ外科的手法による血管化組織工学と血管新生研究。この技術は個別化医療への応用と病理状態での血管形成メカニズム解明に有用です。

血管新生および血管組織工学を研究するための小さな動物モデルにおける動静脈（AV）ループ

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