にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化 S - シタロプラム

この手順の全体的な目標は、構造研究に十分に安定なトランスポーターを生成し、この修飾トランスポーターを使用して、X線結晶構造解析によって高分解能に脱フラクションする結晶を生成することです。この手法は、重要な創薬標的である膜タンパク質の構造をどのように解くかなど、構造生物学の分野における重要な疑問に答えることができます。この技術の主な利点は、機能アッセイを使用して薬物結合コンフォメーションから選択するために使用できることです。

この方法は、神経伝達物質トランスポーターに関する洞察を得ることができますが、低分子に高い親和性で結合する受容体、チャネル、および可溶性タンパク質にも適用できます。10%ウシ胎児血清を添加したDMEM中のトリプソン化HEK293S GnTIマイナス細胞を、使い捨てピペットリザーバーで1ミリリットルあたり50万細胞の密度まで完全に再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、ポリD-リジンコーティングプレートの各ウェルに100マイクロリットルの細胞を加えます。

各プレートを充填した後、細胞をピペットリザーバーに再懸濁して、細胞が均一に分布するようにします。摂氏37度のインキュベーターで細胞を8%二酸化炭素とインキュベートします。トランスベクションの1時間前に細胞培地を交換してください。

スクリーニングするcert TCバックグラウンドの各コンストラクトについて、450ナノグラムのDNAと45マイクロリットルの無血清DMEMを混合することにより、DNAトランスベクション試薬複合体を調製します。その後、トランスベクション試薬1.6マイクロリットルを無血清DMEM45マイクロリットルに加えて混合します。希釈したトランスベクション試薬溶液を直ちにDNA溶液に加え、混合します。

溶液を逆の順序で混合しないでください。10〜15分待ってから、20マイクロリットルのトランスベクション試薬DNA混合物を4つのウェルに加えます。細胞を200ナノモルのシタロプラムと25マイクロリットルのTBSと室温で5分間インキュベー

細胞を可溶化するために、TBSに25マイクロリットルの8ミリモルC12M、1ミリモルCHS、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを加えます。次に、20ナノモルのトリチウム化シタロプラム、0.1%ウシ血清アルブミン、およびタグアフィニティシンチレーション近接アッセイまたはSPAビーズのミリグラム/ミリグラムを含むTBSを、各コンストラクトの3つのウェルに加えます。

最後のウェルには、同じTBS溶液を追加しますが、100マイクロモルのセルトラリンを補充して、非特異的結合を決定します。彼のタグアフィニティーSPAビーズを96ウェルプレートに加える際には、ビーズが完全に混合されていることを確認してください。96ウェルシンチレーションカウンターを使用して、室温でトリチウム化シタロプラム結合を測定し、ウェルあたり1分間のカウント時間で

約36時間で合計カウントが横ばいになるまで、プレートのカウントを続けます。測定後、33°Cに加熱された蓋付きの加熱ブロックでプレートを15分間加熱します。加熱後、トリチウム化シタロプラム結合を再度測定します。

加熱ステップを変更して、これらの手順を繰り返します。標的タンパク質の見かけの融解温度と最も安定したコンストラクトの耐熱性に応じて、加熱温度を調整します。すべてのコンストラクトの比数が少なくなるまで、プレートを加熱し続けます。

HEK293S GnTIマイナス細胞を、摂氏37度の懸濁液中で、8%二酸化炭素、湿度85%のシェーカーで130 RPMで増殖させ、293発現培地に2%ウシ胎児血清を添加して増殖させます。10リットルの細胞にP2ウイルスを感染させ、感染の多重度が2回、密度が1ミリリットルあたり300万個の細胞で感染させます。感染後12〜16時間で、1モルストックから10ミリモルの濃度まで酪酸ナトリウムを添加します。.

感染後48〜60時間で、15分間Gの4,000倍で遠心分離することにより細胞を回収します。上清を取り除きます。150ミリリットルのTBSに細胞を2マイクロモルエスシタロプラムまたは他のSERT阻害剤で再懸濁します。.

10リットルの培養物から約30°Cの温水で細胞を調製し、細胞を10ミリリットルのピペットに急速に通過させて均質になるまで再懸濁します。すべての細胞を攪拌棒付きのビーカーに加え、攪拌しながらすべての洗剤溶液を細胞に加えます。細胞を摂氏4度で攪拌しながら1時間可溶化します。

ライセートをGの8,000倍で摂氏4度で15分間回転させます。上清をきれいな超遠心チューブにデカントし、ペレットを廃棄します。次に、上清をGの100、000倍で超遠心分離機で1時間回転させます。

超遠心分離後、0.2ミクロンのフィルターで上清をろ過し、ペレットを廃棄します。次に、洗浄バッファーで平衡化したペリソルティックポンプを使用して、10ミリリットルを超える溶媒介性アフィニティー樹脂パッキンをカラムにライセートを通します。次に、連鎖球菌アフィニティーカラムを高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに接続し、66 ミリリットルの洗浄バッファーでカラムを毎分 2 ミリリットルで洗浄します。

精製したタンパク質を、5ミリモルのデスチオビオチンを添加した同じ洗浄バッファーで、33ミリリットルのバッファーを使用して毎分0.5ミリリットル溶出します。1ミリリットルのフラクションを収集します。ピークフラクションは約10ミリリットルになります。

トランスポーター抗体複合体を形成するには、まず精製したタンパク質をトロンビンで室温で一晩消化してタグを除去し、遠藤Hで脱グリコシル化します。100キロダルトンの分子量カットオフ遠心分離タンパク質濃縮器を使用して、タンパク質を1ミリリットルあたり10ミリグラム、250〜300マイクロリットルの容量に濃縮します。濃縮されたSERTタンパク質を8B6 Fabと1〜1.2のモル比で500マイクロリットル未満で混合します。

混合物をGの100,000倍、摂氏4度で20分間遠心分離します。遠心分離後、SERT Fab複合体を含む上清を回収し、ペレットを廃棄します。高速タンパク質液体クロマトグラフィーを用いて、サイズ排除カラムで複合体を分離します。

補充されたTBSと毎分0.5ミリリットルで平衡化します。結晶化に先立ち、分子量 100 キロトンのカットオフ遠心タンパク質濃縮器を使用して、複合体の分離から得られたピーク画分を 2 ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。280ナノメートルでの2AUの吸光度は、1ミリグラム/ミリリットルに相当します。

1 対 0.05 の複素数で Fab を 1 対 0.05 の比率で追加し、Fab をフリーにします。また、10マイクロモルフリーのSシタロプラムを追加します。サンプルを遠心分離した後、SERT Fab複合体を含む上清を回収し、ペレットを廃棄します。

テキストプロトコルの表1に従って、摂氏4度で吊り下げ式ドロップ24ウェルスクリーンを設定します。各リザーバー溶液の500マイクロリットルを、各ウェルにシーラントを塗布した薄型の24ウェルプレートに入れてピペットします。1.5、1.75、およびSERT Fabコンプレックスの2マイクロリットルを18ミリメートルのシリコンガラスカバースリップにピペット

次に、タンパク質サンプルの上に1マイクロリットルのリザーバー溶液をピペットで移します。単結晶は約3日以内に現れ、14日後には100〜175マイクロメートルに成長します。ここに示されているのは、トリチウム化シタロプラムの存在下での熱安定性のスクリーニングの代表的な結果です。

最大結合に対してプロットされた融解温度値は、高い耐熱性と発現を持つ変異体を示しています。ここに表示されているのは、野生型SERT TCと上位3つの変異体(Y110A、I291A、T439S)の耐熱性曲線です。この顕微鏡画像はHEK293S細胞膜上に緑色の蛍光が見られるSERT CCを発現するGnTIマイナス細胞を示しています。

SERT CCの蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーは、15ミリリットルで主要なピークを示しています。SDS-PAGEによる解析では、汚染物質がほとんどない単一のタンパク質種が表示されます。サイズ排除クロマトグラフィーによるトランスポーター抗体複合体の代表的な分離が示されています。

11.5 ミリリットルで抜けた主要なピークには、SDS-PAGE ゲルに示されているように、SERT と Fab の両方が含まれていました。成長の2週間後にSシタロプラムに結合したSERT抗体複合体の光学顕微鏡検査は、約100〜175ミクロンのプリズム形状の結晶を示しています。このビデオを見れば、リガンド結合確認で膜タンパク質を安定化させる変異を特定する方法と、タンパク質抗体複合体による結晶化スクリーニングの設定方法について十分に理解できるはずです。

この手順を行おうとするときは、リガンドがSERT TCの安定化に必要であり、SERT CCの結晶化に不可欠であることを覚えておくことが重要です。この手順に従うと、精製されたSERTの機能は、生化学的および生物物理学的方法を用いて特徴付けることができます。