にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化

この手順の全般的な目的は、構造解析に十分な安定性を有するトランスポーターを構築し、この修飾トランスポーターを用いてX線結晶構造解析により高分解能で回折する結晶を作製することです。本手法は、重要な創薬標的である膜タンパク質の構造をどのように決定するかという、構造生物学分野における重要な課題に対する答えを提示できます。この技術の主な利点は、機能アッセイを用いて、薬物が結合したコンフォメーションを選択できる点にあります。

この手法は神経伝達物質トランスポーターに関する知見を得るのに有用ですが、小分子に高親和性で結合する受容体、チャネル、および可溶性タンパク質にも適用可能です。トリプシン処理したHEK293S GnTI minus細胞を、10%胎児牛血清を添加したDMEMで、密度0.5 million cells/mLになるように使い捨てピペットリザーバー内で十分に再懸濁します。マルチチャンネルピペットを使用して、ポリ-D-リシンコートプレートの各ウェルに細胞懸濁液を100 µLずつ分注します。

各プレートへの分注後、細胞が均一に分散するようにピペットリザーバー内で再懸濁します。細胞を37 °C、8% CO2のインキュベーターで培養します。トランスフェクションの1時間前に細胞培地を交換してください。

スクリーニング対象となるcert TC背景の各コンストラクトについて、450 nanogramsのDNAを45 microlitersの無血清DMEMと混合し、DNAトランスフェクション試薬複合体を調製します。次に、1.6 microlitersのトランスフェクション試薬を45 microlitersの無血清DMEMに加えて混合します。希釈したトランスフェクション試薬溶液を直ちにDNA溶液に加え、混合します。

溶液を逆の順序で混合しないでください。10〜15分待機した後、4つのウェルにトランスフェクション用DNA試薬混合液を20 µLずつ添加します。細胞を200 nMのシタロプラムおよび25 µLのTBSとともに、室温で5分間インキュベートします。

細胞を可溶化するため、8 mM C12M、1 mM CHS、およびプロテアーゼ阻害剤カクテルを含むTBSを25 µL添加します。細胞を室温で1時間インキュベートします。次に、20 nMのトリチウム標識シタロプラム、0.1% 牛血清アルブミン、およびmg/mLのHisタグ親和性シンチレーション近接アッセイ（SPA）ビーズを含むTBS 50 µLを、各コンストラクトにつき3つのウェルに添加します。

最後のウェルには同じTBS溶液を加え、非特異的結合を決定するために100 micromolarのセルトラリンを添加します。Hisタグ親和性SPAビーズを96ウェルプレートに加える際は、十分に混合されていることを確認してください。トリチウム標識シタロプラムの結合を、室温で96ウェルシンチレーションカウンターを用い、1ウェルあたり1分間の計数時間で測定します。

総カウント数が約36時間でプラトーに達するまで、プレートのカウントを継続します。測定後、加熱蓋付きのヒーティングブロックを用いて、プレートを33°Cで15分間加熱します。加熱後、トリチウム標識シタロプラムの結合を再度測定します。

加熱ステップを変更し、これらの手順を繰り返します。目的タンパク質の見かけの融解温度および、最も安定なコンストラクトの熱安定性に応じて、加熱温度を調整してください。すべてのコンストラクトの比カウント値が低くなるまで、プレートの加熱を継続します。

HEK293S GnTI minus細胞を、2%胎児牛血清を添加した293発現培地を用い、37°C、8%二酸化炭素、85%湿度の条件下で、シェーカーを用いて130 RPMで懸濁培養する。細胞量10 Lに対し、感染多重度2、細胞密度3 million cells/mLでP2ウイルスを感染させる。感染後12〜16時間に、1 Mストック溶液からナトリウムブチレートを最終濃度10 mMとなるように添加する。

感染後48〜60時間に、4,000 ×gで15分間遠心分離して細胞を回収します。上清を除去します。2 µMのエスシタロプラムまたは他のSERT阻害剤を含む150 mLのTBSに細胞を再懸濁します。

約30 °Cの温水中で10 Lの培養液から細胞を回収し、10 mLピペットで細胞を急速に繰り返し通して均一になるまで再懸濁します。撹拌子を入れたビーカーにすべての細胞を加え、撹拌しながら細胞に界面活性剤溶液をすべて加えます。4 °Cで1時間、撹拌しながら細胞を可溶化します。

溶解物を4°Cで8,000 ×g、15分間遠心分離します。上清を清潔な超遠心管に移し、ペレットを廃棄します。その後、超遠心機を用いて上清を100,000 ×gで1時間遠心分離します。

超遠心分離後、上清を0.2 micronフィルターでろ過し、ペレットを廃棄します。次に、洗浄バッファーで平衡化したストレップアフィニティー樹脂10 millilitersをカラムに充填し、ペリスタポンプを用いてライセートを通します。その後、ストレップアフィニティーカラムを高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムに接続し、洗浄バッファー66 millilitersを用いて2 milliliters/minの流速でカラムを洗浄します。

5 mMのdesthiobiotinを添加した同一の洗浄バッファーを用い、流速0.5 mL/minで、合計33 mLのバッファーを使用して精製タンパク質を溶出させます。1 mLずつ分画して回収します。ピーク分画は約10 mLになります。

トランスポーター抗体複合体を形成するため、まず精製タンパク質を室温で一晩、トロンビンで処理してタグを除去し、Endo Hで脱糖鎖処理を行います。100 kDa 分切り限りの遠心式タンパク質濃縮器を用いて、タンパク質を濃度 10 mg/mL、液量 250〜300 µL まで濃縮します。濃縮した SERT タンパク質と 8B6 Fab を、モル比 1：1.2 で、全量が 500 µL 未満になるように混合します。

混合物を100,000 ×g、4 °Cで20分間遠心分離します。遠心分離後、SERT Fab複合体を含む上清を回収し、ペレットを廃棄します。サイズ排除カラムを用いた高速液体クロマトグラフィーにより、複合体を分離します。

添加剤入りのTBSを用いて、0.5 milliliters per minuteで平衡化します。結晶化の前に、複合体の分離で得られたピーク画分を、100 kilodaltonの分画分子量を持つ遠心式タンパク質濃縮機を用いて2 milligrams per milliliterまで濃縮します。280 nanometersにおける吸光度2 AUが1 milligram per milliliterに相当します。

複合体に対して遊離Fabが1:0.05の比率となるように、追加のFabを加えます。また、10 µMの遊離S-シタロプラムを加えます。サンプルを遠心分離した後、SERT Fab複合体を含む上清を回収し、ペレットを捨てます。

テキストプロトコルの表1に従い、4°Cでハンギングドロップ法による24ウェルスクリーニングを準備します。各ウェルに密封剤を塗布した低背24ウェルプレートに、各リザーバー溶液を500 µLずつピペットで分注します。18 mmのシリコン化ガラスカバースリップ上に、SERT Fab複合体を1.5、1.75、および2 µLずつピペットで分注します。

次に、リザーバー溶液を1 µL、タンパク質試料の上にピペッティングします。約3日以内に単結晶が出現し、14日後には100から175 µmまで成長します。ここでは、トリチウム標識シタロプラム存在下での熱安定性スクリーニングの代表的な結果を示しています。

最大結合量に対してプロットされた融解温度の値は、高い熱安定性と発現を示す変異体を示しています。ここでは、野生型SERT TCおよび上位3つの変異体（Y110A、I291A、T439S）の熱安定性曲線を示しています。この顕微鏡画像は、SERT CCを発現し、細胞膜に緑色蛍光が認められるHEK293S GnTIマイナス細胞を示しています。

SERT CCの蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィーでは、15 mLに主要なピークが認められます。SDS-PAGEによる分析では、不純物がほとんどない単一のタンパク質種が示されています。サイズ排除クロマトグラフィーによるトランスポーター抗体複合体の代表的な分離結果を示します。

SDS-PAGEゲルで示されているように、11.5 mLで溶出する主要なピークにはSERTとFabの両方が含まれていました。S-シタロプラムに結合したSERT抗体複合体を2週間育成し、光学顕微鏡で観察すると、約100〜175 µmのプリズム状の結晶が確認されます。このビデオを視聴することで、リガンド結合状態で膜タンパク質を安定化させる変異を特定する方法と、タンパク質抗体複合体を用いた結晶化スクリーニングの設定方法について深く理解できるはずです。

この手順を行う際は、リガンドがSERT TCの安定化に必要であり、SERT CCの結晶化に不可欠であることを覚えておくことが重要です。SERTは多くの抗うつ薬の分子標的であるため、この手法の意義は精神疾患の治療へと及びます。この手順に従い、精製したSERTの機能を生化学的および生物物理学的な方法を用いて特性解析することが可能です。