レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。

この実験の全体的な目標は、単一細胞における複数の遺伝子発現を観察することです。この方法は、細胞集団内の分子シグネチャの不均一性や希少な分子シグネチャなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、少なくとも48の異なる遺伝子を持つ特定の分子シグネチャを多くの細胞で同時に評価できることです。

この手順は、1.5ミリリットルのチューブで48反応の増幅前混合物を調製することから始めます。チューブに240マイクロリットルの特異的後転写バッファー、62.4マイクロリットルの低EDTA TEバッファー、および9.6マイクロリットルのTaq DNAポリメラーゼを添加します。電動ピペットを使用して、6.5マイクロリットルのプレアンプミックスを96ウェルのシングルセルプレートの48ウェルのそれぞれに分配します。

次に、1.5ミリリットルのチューブに0.2倍アッセイミックスを調製します。各プライマーの1.4マイクロリットルをチューブに追加します。最終容量を140マイクロリットルに調整し、EDTA TEバッファーを低くします。

電動ピペットを使用して、2.5マイクロリットルの0.2倍アッセイミックスを、プレアンプミックスを含む96ウェルのシングルセルソーティングプレート内の48ウェルに分配します。プレートをカバーフィルムで密封します。プレートを渦巻き、280gで1分間回転させます。

単一の肝自然リンパ球 (ILC) は、蛍光活性化細胞ソーティングによって選別されます。この手順は、空の96ウェルプレートをテストとして使用することから始めます。テストプレートをプレートホルダーに配置し、aウェルを左側にして実験者に向けて

プレートホルダーを調整して、検証ビーズを備えた1つのウェルの中央にドロップを取得します。適切に調整したら、アッセイミックスとプレアンプが入った96ウェルのシングルセルソーティングプレートをプレートホルダーに置きます。プレートレイアウトを描画し、ゲート母集団のウェルごとに1つのセルをソートします。

96ウェルのシングルセルソーティングプレート上の各セルの適切な配置が不可欠であり、プレートのレイアウトはスプレッドシートソフトウェアで保持する必要があります。0.2倍アッセイミックスとプレアンプミックスを含むウェルを1つ、細胞なしで、インプットなしのコントロールとして残します。オプションで、プライマー効率のコントロールとして、cDNA希釈用の6ウェルを2列残します。

シングルセルソーティングの直後に、96ウェルのシングルセルソーティングプレートをボルテックスしてスピンダウンします。プレートをサーモサイクラーに入れます。示されているように、逆転写と前増幅を行います。

十分な材料を得るためには、選別された単一細胞上の特定の標的遺伝子の事前増幅が必要です。各ウェルに36マイクロリットルの低EDTA TEバッファーを加えて、事前に増幅したサンプルを希釈します。この手順を開始するには、175マイクロリットルのqPCRマスターミックスと17.5マイクロリットルのサンプルローディング試薬を1.5ミリリットルのチューブにピペッティングして、191マイクロリットルのマスターミックスを調製します。

新しい96ウェルプレートで、3.6マイクロリットルのマスターミックスを48ウェルのそれぞれに分配します。これが96ウェルサンプルプレートです。2.9マイクロリットルの増幅済みcDNAを96ウェルのシングルセルソーティングプレートから新しい96ウェルサンプルプレートに移し、2つのプレート間の各サンプルの位置を同じに保ちます。

新しい96ウェルプレート上の48ウェルのそれぞれに3マイクロリットルのアッセイローディング試薬を分配することにより、96ウェルアッセイプレートを調製します。各ウェルに3マイクロリットルのプライマーを加えます。96ウェルアッセイプレート内の各プライマーの適切な配置が不可欠です。

プレートのレイアウトはスプレッドシートソフトウェアで保持します。この手順を開始するには、統合マイクロ流体回路(IFC)をベンチに置き、シリンジを使用してバルブを確認します。シリンジのキャップを取り外し、片方のバルブに対して垂直に置き、しっかりと押します。

Oリングが動くはずです。チップに制御ライン液を充填します。2番目のバルブで前の手順を繰り返した後、チップの底から黒いフィルムを取り除きます。

チップをIFCコントローラーにロードします。IFC コントローラー画面で、prime を選択し、実行します。次に、チップを排出し、チップの底にある黒いフィルムを再シールします。

8チャンネルピペットを使用して、96ウェルアッセイプレートからチップの左側に5マイクロリットルを移します。チップの各ウェルのヒントを変更します。気泡の発生を避け、気泡が発生した場合は、10マイクロリットルのチップを使用して泡を取り除きます。

図のようにチップの左側にチップを埋めます。同様に、96ウェルサンプルプレートから5マイクロリットルを使用してチップの右側を充填します。この実験を成功させるには、IFCコントローラに適切にロードするために、IFCチップが適切に充填されていることが不可欠です。

チップの底から青いフィルムをはがし、チップをIFCコントローラーにロードします。IFC コントローラー画面で、 [load mix] を選択し、 [Run](実行) を選択します。完了したら、チップを排出し、チップの底に青いフィルムを再度シールします。

チップを実行するには、まずマイクロ流体qPCRコンピュータ上のデータ収集ソフトウェアを選択します。開始したら、新しい実行を選択します。イジェクトを選択し、チップをロードします。

テキストプロトコルの説明に従ってソフトウェアを設定したら、[実行の開始]を選択します。反応には約90分かかります。データ解析を開始するには、リアルタイムPCR解析ソフトウェアを開き、ファイルを選択し、実験フォルダを開いて探し、chip run dot b m one fileを選択します。

解析ビュー、結果テーブル、ヒートマップビューをクリックします。x でマークされたボックスは、しきい値検出レベルを下回っているか、増幅曲線が不良です。サンプルに名前を付けます。

サンプルセットアップに移動し、新しいSBS 96を選択します。マッピングをクリックし、96ウェルサンプルプレートのレイアウトに従ってサンプルレイアウトを選択します。スプレッドシートソフトウェアからサンプルレイアウトデザインをコピーして貼り付けます。

貼り付けたレイアウトをサンプル名として定義します。同じ手順でアッセイに名前を付けます。検出器のセットアップにプライマー名を入力し、貼り付けたレイアウトを検出器名として定義します。

分析ビューをクリックして分析します。ファイルを選択し、エクスポートして、ヒートマップの結果として保存します。フローサイトメトリーを用いて、広く発現しているILCマーカーに基づいて肝臓のILC集団を選別し、3つの異なる集団を定義しました。

適切にロードされたシングルセルのマルチプレックス遺伝子発現チップは、直線と列で表示され、各反応チャンバーが満たされ、同じ寸法で表示されるはずです。不適切にロードされたチップには、空のラインと反応チャンバーの列、および曲げラインがあります。このフルオレセインアミダイトの図は、適切にロードされたチップの図で、数サイクル後に現れる反応チャンバーの明るさの違いを示しています。

増幅シグナルのある反応チャンバーは、増幅シグナルがない、または増幅信号が少ない反応チャンバーよりも明るく見えます。適切な細胞選別、事前増幅、およびローディングを行った後、ILC集団は、成体、野生型マウスの肝臓における遺伝子発現について不均一であるように見えました。左側は修正なしのヒートマップです。

右側は、サンプルとアッセイ名の定義後に取得された修正ヒートマップです。オンラインソフトウェアを使用して、細胞特異的な遺伝子発現シグネチャーと細胞集団の関係を同定しました。各行は遺伝子を表し、各行は同じ細胞を表し、3つの細胞集団は青、赤、緑で表されます。

マスターすれば、このテクニックは適切に実行すれば9時間で完了します。この手順を試行する際は、細胞とプライマーの分布についてプレートの向きを注意深く追跡することが重要です。その開発後、この技術は、研究者が細胞集団の希少で特異的な分子シグネチャを探求する道を開きました。

このビデオを見た後、適切な細胞ソーティング、事前増幅、およびローディング後に、多くの単一細胞で同時に複数の遺伝子発現を評価する方法について十分に理解できるはずです。