Name: レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: 学ぶ単一細胞RT-qPCRによるマルチプレックス遺伝子発現解析法。レアリンパ集団の不均一性を48遺伝子同時評価で解明し、免疫学における細胞多様性の理解を深める。

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この作業は、Institut Pasteur, INSERM, Université Paris Diderot, and the Ministère de la Recherche (to S.C.); Association pour la Recherche sur le Cancer (to S.C. and R.G.); the REVIVE Future Investment Program and the Agence Nationale de Recherche (ANR; grant ''Twothyme'' to A.C.);ANR助成金「Myeloten」(R.G.へ)。および国立がん研究所(肝臓発がん中の免疫微小環境の役割、R.G.)。パスツール研究所のCenter for Human Immunology and Cytometryプラットフォームのご支援に感謝いたします。

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</ol>

著者らは開示するものは何もない。

このプロトコルは、クローンレベルでの網羅的な遺伝子発現情報を取得する方法について説明します。ここでは、肝臓ILCコンパートメントの不均一性を調べました。 （広く発現ILC表面マーカーに基づいて）異なるILC集団の単一細胞選別後、サンプルを特定の予め選択された遺伝子のための予備増幅しました。次に、得られたcDNAおよびプライマーは、多重RT-qPCRをマイクロ流体チップにロードしました。最後に、我々は48の単一細胞からの48の異なる遺伝子の発現を得ました。遺伝子発現の結果は、遺伝子サイン及び細胞集団の関係を調査するためのオンラインソフトウェアによって分析しました。 この手法の主な利点は、同時に複数の遺伝子の発現を評価する能力です。また、クローンレベルで、非常にまれな集団での作業を可能にします。遺伝子発現は、クローンレベルで評価されているので、従来のRT-qPCRの方法とは異なり、単一セル多重RT-qPCRを、ない平均化効果がありません。このようにして、集団内の不均一性を検出し、分析することができます。ごく少数の細胞が遺伝子発現の全体の情報を得るために必要とされるので、単一細胞RT-q...

過去数年間、先天性リンパ系細胞（ILCS）は、ますます研究されてきました。抗原特異的受容体の欠如にもかかわらず、彼らはリンパ系統に属し、組織の恒常性や炎症のための重要な番兵を表します。 ILCSは、現在、特定の転写因子の組合せの発現におよびサイトカイン6,7を産生する能力に基づいて3つのグループに分けています。 ILCSは、特定のサイトカイン産生8、9を介して多様な器官における数多くの恒常性および病態生理学的状況に貢献しています。これらの細胞の役割を理解することができるためには、臓器ごとに様々なILC亜集団を決定し、それらの発達の関係を識別することが重要です。また、異なるサブセット間の可塑性の現象が関連しています。異質性を研究することによって1つの器官に存在する細胞では、成熟のその段階を区切るために、それらの特定の機能を区別することが可能です。 単一セルの多重RT-qPCRの技術を説明するために、肝ILCSは同じILCグループ（タイプ1 ILC）10内に、その異質性に特に重点を置いて、選択されました。まず、フローサイトメトリーを使用することによって、三つの異なるILC集団は、肝臓中で特徴づけました。他の二つの集団が、稀な肝ILC集団（先天性エフェクターの5％未満）でありながら、グループ1 ILCは、生来のエフェクターの約80％を占めています。これらの集団は、ILC集団の広く発現される細胞表面マーカーを用いて選別しました。その結果、肝臓におけるILC集団が別に広く同様のものを見て選別しました。 シングルセル多重RT-qPCRを速やかにこれらの集団11の不均一性を調査するための最良の手法の一つとして浮上しています</s&gt;アップ。二つの主な特徴は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの技術を利用して決定されます。まず、クローンレベルを見て、明らかに類似した発達段階を示す細胞との比較のために、細胞特異的遺伝子発現を回復することが可能です。そして、遺伝子発現の予め選択された組み合わせを見ることによって、我々は、1つの時点での同時の遺伝子発現パターンに基づいて、新たな遺伝子特性を決定します。技術は、クローンレベルで行われるので、これらの態様は、さらに稀な集団に、多数の細胞のための発現データの多様な収集を可能にします。これにより、肝臓におけるILC異質性が適切に評価することができます。 次に、グローバルILC表現型を有するすべての細胞を選別することにより、肝臓ILC集団の複数の遺伝子の発現の広範な概要は、それらが非常にまれな集団を表していても、得られます。マイクロ流体ベースのチップもで実験を可能にします細胞物質の少量。その結果、希少細胞集団の遺伝子発現プロファイルを得ることができます。オンライン遺伝子特性分析ソフトウェアを用いて、細胞集団のクラスタと電位セルとの関係を調べることができます。これにより、機能テストは、in vivoレベルでクラスタリングデータを検証するために行うことができます。 遺伝子発現の十同じチップ3、11、12の数百以上の単一の細胞に同時に評価することができます。アッセイの設計は、実験の最長かつ最も重要な部分です。試験されるべき仮説に関連する遺伝子の決意は、適切な結果を得るために最も重要です。 （そのようなソートに使用される公知の表面マーカーなど）第二に、内部統制および特定のコントロールが必要とされています。これは、プライマー増幅特異性、増幅効率、およびtをテストすることが重要ですプライマー競争の彼が不在。セルの複数の遺伝子発現を同時に評価されるようにそのため、単一セル多重RT-qPCRをでの作業は、時間節約テクニックです。 すべてのセルのための試薬の同じチップとミックスを使用すると、操作のエラーの可能性を制限し、サンプル間の再現を可能にします。要するに、単一セル多重RT-qPCRをのさまざまな側面は​​、サンプルや遺伝子の幅広い感度の偉大なレベルで、クローンレベルでの信頼性の高い結果の生成を可能にします。得られた結果は、生物統計学的試験のための強力かつ堅牢なデータを提供しています。 これは、材料の非常に少量の作業を可能にし、徹底的な結果をもたらす方法のマイクロ流体態様に達成することができます。最後に、オンラインソフトウェアを使用して、所望の集団を比較することができます。

<table><tbody><tr><td>Cells Direct One Step qRT-PCRキット</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td>11753100</td><td>プライマープローブ検出キット。2x反応ミックス、SSIIIプラチニウム酵素が含まれています。</td></tr><tr><td>Low TE EDTA Buffer</td><td>Affymetrix</td><td>75793 100ML</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>AB 1100</td><td>96 ウェルプレート 細胞のソーティングとサーモサイクリングに対応</td></tr><tr><td>カバーフィルム</td><td>Dominique Dutscher</td><td>106570</td><td>アルミニウムカバーフィルム; 汚染と蒸発を回避</td></tr><tr><td>Actb</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00607939_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>AES</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・サイエンティフィック <td>Mm01148854_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Ahr</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td>・<td>Mm00478932_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Bcl2</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック<td>・Mm00477631_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>c-myc</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm00487804_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Cbfb</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm01251026_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Cd27</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01185212_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Cd49a</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01306375_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>CD49b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00434371_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Cxcr5</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00432086_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Cxcr6</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm02620517_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Eomes</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01351985_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Ets1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01175819_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Foxo1</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490672_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Gapdh</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm03302249_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Gata3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00484683_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Gm-csf</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm01136644_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Hes1</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm01342805_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm00446968_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Id2</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm01293217_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-12rb2</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm00711781_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-18r1</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・Mm00515178_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-1rl1</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・Mm00434237_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-22</td> サー<td>モフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm001226722_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-23r</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm00519943_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-2ra</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm01340213_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Il-2rb</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm01195267_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>IL-7r</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm00434295_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>KLR5</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm04207528_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Lef1</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック Mm00550265_s1</td><td></td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Ncr1</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm01337324_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Nfil3</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm01339838_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Notch1</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm00435249_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Notch2</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm00803069_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>ローラ</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>Mm01173766_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Rorc</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01261022_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Runx3</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00490666_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Tbx21</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01299453_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Tcf3</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>Mm01175588_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Tcf7</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm00493445_s1</td><td>20倍プライマー</td></tr><tr><td>Tle1</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・サイエンティフィック・Mm00495643_s1</td><td>20倍プライマー</td></tr><tr><td>Tle3</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック・<td>Mm00437097_s1</td><td>20倍プライマー</td></tr><tr><td>Tsc22d3</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>・サイ</td>エンティフィック・Mm01306210_s1 <td>20倍プライマー</td></tr><tr><td>Tnfrsf11a</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td>・サイエンティフィック・<td>Mm00437132_s1</td><td>20倍プライマー</td></tr><tr><td>Tox</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00455231_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Zbtb16</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm01176868_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>Zbtb7b</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>Mm00784709_s1</td><td>20x プライマー</td></tr><tr><td>qPCR マスターミックス&nbsp;</td><td>Applied BioSystems</td><td>P/N 4304437</td><td></td></tr><tr><td>2x Assay Loading Reagent</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000736</td><td>マルチプレックスRT-qPCRマイクロ流体チップにアッセイをロードするための比密度媒体です。&nbsp;</td></tr><tr><td>2x サンプルローディング試薬</td><td>Fluidigm</td><td>P/N 85000735</td><td>比重媒体 マルチプレックスRT-qPCRマイクロ流体チップにサンプルをロードします。&nbsp;</td></tr><tr><td>48.48 マルチプレックス RT qPCR マイクロ流体チップ</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M-48.48</td><td>48.48 遺伝子発現用ダイナミックアレイ IFC;シングルセルマルチプレックスRT-qPCR反応用チップ</td></tr><tr><td>48.48 マルチプレックス RT qPCR マイクロ流体チップコントローラ</td><td>Fluidigm</td><td>89000020</td><td>48.48 IFC Controller; チップ内部の流体システムを制御し、サンプルとアッセイを反応チャンバーにロード</td></tr><tr><td>マルチプレックスRT qPCR マイクロ流体サーモサイクラー</td><td>Fluidigm</td><td>GE48.48</td><td>48.48 ダイナミックアレイ IFC サーモサイクラー</td></tr><tr><td>96ウェルプレート</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB 1100</td><td>細胞の選別とサーモサイクリングに適した96ウェルプレート</td></tr><tr><td>C57Bl/6マウス</td><td>Janvier</td><td>C57Bl/6 miceJ@RJ</td><td></td></tr><tr><td>10 ml シリンジ</td><td>BD Biosciences</td><td>309639</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14040174</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>24020133</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>CVFSVF000U</td><td>Eurobio Abcys</td><td>Standard 子牛胎児血清</td></tr><tr><td>ポッターチューブ</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml チューブ</td><td>コーニング</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml チューブ</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>FACS マシン</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>75004538</td><td></td></tr><tr><td>1,000 & マイクロ;l tips</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・サイエンティ</td>フィ<td>ック・10313272</td><td></td></tr><tr><td>P1000&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-0891-01</td><td></td></tr><tr><td>Facs tube</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD8 Biotin mouse antibody</td><td>Sony</td><td>1103520</td><td>lineage antibody</td></tr><tr><td>anti-CD19 Biotin mouse antibody</td><td>Sony</td><td>1177520</td><td>lineage antibody</td></tr><tr><td>anti-TCRab Biotin mouse antibody</td><td>BioLegend</td><td>109204</td><td>系統抗体</td></tr><tr><td>抗TCRgd ビオチンマウス抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553176</td><td>系統抗体</td></tr><tr><td>抗Ter119 ビオチンマウス抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553672</td><td>系統抗体</td></tr><tr><td>抗Gr1 ビオチンマウス抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td>系統抗体</td></tr><tr><td>抗CD45.2 PerCPCy5.5 マウス抗体</td><td>BioLegend</td><td>109828</td><td></td></tr><tr><td>抗IL7ra PeCy7マウス抗体</td><td>ebioSciences</td><td>25-1271-82</td><td></td></tr><tr><td>抗CD3 BV510マウス抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>563024</td><td></td></tr><tr><td>抗CD4 BV786マウス抗体</td><td>BD Biosciences</td><td>563727</td><td></td></tr><tr><td>抗NKp46 PEマウス抗体</td><td>ebioSciences</td><td>12-3351-82</td><td></td></tr><tr><td>ストレプトアビジン</td><td>ソニー 2626025</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヨウ化プロピジウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864-10ML</td><td></td></tr><tr><td>電動ピペット</td><td>エッペンドルフ</td><td>4986000017</td><td></td></tr><tr><td>Combitips 0.1 ml</td><td>エッペンドルフ</td><td>30089405</td><td></td></tr><tr><td>マルチチャンネルピペット</td><td>レイニン</td><td>L8-10XLS+</td><td></td></tr><tr><td>Accudrop</td><td>BD Biosciences</td><td>345249</td><td>FACS用検証ビーズ</td></tr></tbody></table>

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスrt-qpcrのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Single-cell Gene Expression Using Multiplex RT-qPCR to Characterize Heterogeneity of Rare Lymphoid Populations

遺伝子発現の不均一性は、リンパ集団で調査する興味深い特徴です。これらの細胞における遺伝子発現は、細胞活性化、ストレス、又は刺激中に変化します。単一セルマルチプレックス遺伝子発現は遺伝子1、2、3の数十の同時評価を可能にします。単一細胞レベルでは、多重遺伝子発現は、集団の不均一4,5判定する。これは、成熟した細胞間の多様な前駆段階の可能性ミックスとも刺激に対する細胞応答の多様性の両方を決定することにより、人口の異質性の区別を可能にします。 先天性リンパ系細胞（ILC）は最近、免疫応答6、7の生来のエフェクターの集団として記載されています。 ILC彼のこのプロトコルでは、細胞の不均一paticコンパートメントは恒常性の間に検討されています。 現在、遺伝子発現を評価するための最も広く使用される技術は、RT-qPCRのです。この方法は、一度に遺伝子発現1つの遺伝子のみを測定します。複数のセルを1つのテストのために必要とされるのでさらに、この方法は、遺伝子発現の不均一性を推定することができません。これは、集団の平均遺伝子発現の測定をもたらします。多数の遺伝子を評価する場合、RT-qPCRのは、時間、reagent-、およびサンプルのかかる方法になります。したがって、トレードオフがグローバル画像を欠落するリスクを増大させる、評価することができる遺伝子または細胞集団の数を制限します。 この原稿は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRには、これらの制限を克服するために使用することができる方法を記載しています。この技術は、最近のマイクロフルイディクス技術の進歩1、2から恩恵を受けています。マルチプレックスRT-qPCRをチップに起こる反応はEXCありませんナノリットルレベルをEED。したがって、単一細胞遺伝子発現、ならびに同時に複数の遺伝子の発現、reagent-、試料 - 、および費用対効果の高い方法で行うことができます。異なる発達段階で、または異なる条件4,5の下で集団内の細胞のサブセット間クローンレベルでの細胞遺伝子シグネチャーの不均一性をテストすることができます。単一細胞レベルでの条件の数が多い希少な集団での作業はもはや制限ではありません。

リンパ系集団は、遺伝子発現に大きな多様性を示します。このプロトコルでは、肝臓ILC区画の不均一は、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を用いて調べました。他の遺伝子発現技術とは異なり、単一細胞マルチプレックスRT-qPCRの遺伝子発現を同時に、さらに希少、いくつかの集団での作業を可能にします。クローンレベルで高感度に結合されたこの特異性は、集団内で希少な集団間の遺伝子特性の違いを調査することができます。一例として、4週齢のマウスの肝臓から3 ILC集団の遺伝子サインを評価しました。他の2つは肝臓で（系統陰性細胞の1％未満）はまれであるのに対し、一つの人口は、容易に識別するのに十分に頻繁です。 96ウェルシングルセルソーティングプレートと96ウェルアッセイプレートは、肝dissectio前に調製しましたnおよび解離（ 図1）。各ミックスは無菌フード下で調製し、ボリューム精度と再現性のための電子ピペットで配...

このプロトコルは、クローンレベルでの遺伝子の大規模な配列の発現を評価する方法について説明します。単一細胞RT-qPCRをサンプルと数百の遺伝子のための強力な感度を有する信頼性の高い結果が得られます。

レアリンパ集団の不均一性を特徴づけるためにマルチプレックスRT-qPCRのを使用した単一細胞の遺伝子発現

Gene expression heterogeneity is an interesting feature to investigate in lymphoid populations. Gene expression in these cells varies during cell ...

この実験の全体的な目標は、単一細胞における複数の遺伝子発現を観察することです。この方法は、細胞集団内の分子シグネチャの不均一性や希少な分子シグネチャなど、免疫学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、少なくとも48の異なる遺伝子を持つ特定の分子シグネチャを多くの細胞で同時に評価できることです。この手順は、1.5ミリリットルのチューブで48反応の増幅前混合物を調製することから始めます。チューブに240マイクロリットルの特異的後転写バッファー、62.4マイクロリットルの低EDTA TEバッファー、および9.6マイクロリットルのTaq DNAポリメラーゼを添加します。電動ピペットを使用して、6.5マイクロリットルのプレアンプミックスを96ウェルのシングルセルプレートの48ウェルのそれぞれに分配します。次に、1.5ミリリットルのチューブに0.2倍アッセイミックスを調製します。各プライマーの1.4マイクロリットルをチューブに追加します。最終容量を140マイクロリットルに調整し、EDTA TEバッファーを低くします。電動ピペットを使用して、2.5マイクロリットルの0.2倍アッセイミックスを、プレアンプミックスを含む96ウェルのシングルセルソーティングプレート内の48ウェルに分配します。プレートをカバーフィルムで密封します。プレートを渦巻き、280gで1分間回転させます。単一の肝自然リンパ球 (ILC) は、蛍光活性化細胞ソーティングによって選別されます。この手順は、空の96ウェルプレートをテストとして使用することから始めます。テストプレートをプレートホルダーに配置し、aウェルを左側にして実験者に向けて配置します。プレートホルダーを調整して、検証ビーズを備えた1つのウェルの中央にドロップを取得します。適切に調整したら、アッセイミックスとプレアンプが入った96ウェルのシングルセルソーティングプレートをプレートホルダーに置きます。プレートレイアウトを描画し、ゲート母集団のウェルごとに1つのセルをソートします。96ウェルのシングルセルソーティングプレート上の各セルの適切な配置が不可欠であり、プレートのレイアウトはスプレッドシートソフトウェアで保持する必要があります。0.2倍アッセイミックスとプレアンプミックスを含むウェルを1つ、細胞なしで、インプットなしのコントロールとして残します。オプションで、プライマー効率のコントロールとして、cDNA希釈用の6ウェルを2列残します。シングルセルソーティングの直後に、96ウェルのシングルセルソーティングプレートをボルテックスしてスピンダウンします。プレートをサーモサイクラーに入れます。示されているように、逆転写と前増幅を行います。十分な材料を得るためには、選別された単一細胞上の特定の標的遺伝子の事前増幅が必要です。各ウェルに36マイクロリットルの低EDTA TEバッファーを加えて、事前に増幅したサンプルを希釈します。この手順を開始するには、175マイクロリットルのqPCRマスターミックスと17.5マイクロリットルのサンプルローディング試薬を1.5ミリリットルのチューブにピペッティングして、191マイクロリットルのマスターミックスを調製します。新しい96ウェルプレートで、3.6マイクロリットルのマスターミックスを48ウェルのそれぞれに分配します。これが96ウェルサンプルプレートです。2.9マイクロリットルの増幅済みcDNAを96ウェルのシングルセルソーティングプレートから新しい96ウェルサンプルプレートに移し、2つのプレート間の各サンプルの位置を同じに保ちます。新しい96ウェルプレート上の48ウェルのそれぞれに3マイクロリットルのアッセイローディング試薬を分配することにより、96ウェルアッセイプレートを調製します。各ウェルに3マイクロリットルのプライマーを加えます。96ウェルアッセイプレート内の各プライマーの適切な配置が不可欠です。プレートのレイアウトはスプレッドシートソフトウェアで保持します。この手順を開始するには、統合マイクロ流体回路(IFC)をベンチに置き、シリンジを使用してバルブを確認します。シリンジのキャップを取り外し、片方のバルブに対して垂直に置き、しっかりと押します。Oリングが動くはずです。チップに制御ライン液を充填します。2番目のバルブで前の手順を繰り返した後、チップの底から黒いフィルムを取り除きます。チップをIFCコントローラーにロードします。IFC コントローラー画面で、prime を選択し、実行します。次に、チップを排出し、チップの底にある黒いフィルムを再シールします。8チャンネルピペットを使用して、96ウェルアッセイプレートからチップの左側に5マイクロリットルを移します。チップの各ウェルのヒントを変更します。気泡の発生を避け、気泡が発生した場合は、10マイクロリットルのチップを使用して泡を取り除きます。図のようにチップの左側にチップを埋めます。同様に、96ウェルサンプルプレートから5マイクロリットルを使用してチップの右側を充填します。この実験を成功させるには、IFCコントローラに適切にロードするために、IFCチップが適切に充填されていることが不可欠です。チップの底から青いフィルムをはがし、チップをIFCコントローラーにロードします。IFC コントローラー画面で、 [load mix] を選択し、 [Run](実行) を選択します。完了したら、チップを排出し、チップの底に青いフィルムを再度シールします。チップを実行するには、まずマイクロ流体qPCRコンピュータ上のデータ収集ソフトウェアを選択します。開始したら、新しい実行を選択します。イジェクトを選択し、チップをロードします。テキストプロトコルの説明に従ってソフトウェアを設定したら、[実行の開始]を選択します。反応には約90分かかります。データ解析を開始するには、リアルタイムPCR解析ソフトウェアを開き、ファイルを選択し、実験フォルダを開いて探し、chip run dot b m one fileを選択します。解析ビュー、結果テーブル、ヒートマップビューをクリックします。x でマークされたボックスは、しきい値検出レベルを下回っているか、増幅曲線が不良です。サンプルに名前を付けます。サンプルセットアップに移動し、新しいSBS 96を選択します。マッピングをクリックし、96ウェルサンプルプレートのレイアウトに従ってサンプルレイアウトを選択します。スプレッドシートソフトウェアからサンプルレイアウトデザインをコピーして貼り付けます。貼り付けたレイアウトをサンプル名として定義します。同じ手順でアッセイに名前を付けます。検出器のセットアップにプライマー名を入力し、貼り付けたレイアウトを検出器名として定義します。分析ビューをクリックして分析します。ファイルを選択し、エクスポートして、ヒートマップの結果として保存します。フローサイトメトリーを用いて、広く発現しているILCマーカーに基づいて肝臓のILC集団を選別し、3つの異なる集団を定義しました。適切にロードされたシングルセルのマルチプレックス遺伝子発現チップは、直線と列で表示され、各反応チャンバーが満たされ、同じ寸法で表示されるはずです。不適切にロードされたチップには、空のラインと反応チャンバーの列、および曲げラインがあります。このフルオレセインアミダイトの図は、適切にロードされたチップの図で、数サイクル後に現れる反応チャンバーの明るさの違いを示しています。増幅シグナルのある反応チャンバーは、増幅シグナルがない、または増幅信号が少ない反応チャンバーよりも明るく見えます。適切な細胞選別、事前増幅、およびローディングを行った後、ILC集団は、成体、野生型マウスの肝臓における遺伝子発現について不均一であるように見えました。左側は修正なしのヒートマップです。右側は、サンプルとアッセイ名の定義後に取得された修正ヒートマップです。オンラインソフトウェアを使用して、細胞特異的な遺伝子発現シグネチャーと細胞集団の関係を同定しました。各行は遺伝子を表し、各行は同じ細胞を表し、3つの細胞集団は青、赤、緑で表されます。マスターすれば、このテクニックは適切に実行すれば9時間で完了します。この手順を試行する際は、細胞とプライマーの分布についてプレートの向きを注意深く追跡することが重要です。その開発後、この技術は、研究者が細胞集団の希少で特異的な分子シグネチャを探求する道を開きました。このビデオを見た後、適切な細胞ソーティング、事前増幅、およびローディング後に、多くの単一細胞で同時に複数の遺伝子発現を評価する方法について十分に理解できるはずです。

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Genetics

遺伝学

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