Name: ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-02-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: 学ぶヒト多能性幹細胞からインシュリン分泌細胞への分化プロトコル。6段階の誘導分化により機能的なβ細胞様細胞を生成し、グルコース応答性インシュリン分泌を確認。糖尿病研究と再生医療への応用に貢献します。

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Ines Cherkaouiは、GARのDiabetes UK学生資格(BDA 18/0005934)の支援を受け、GARはWellcome TrustのInvestigator Award(212625/Z/18/Z)、UKRI MRCのプログラム助成金(MR/R022259/1)、Diabetes UKのプロジェクト助成金(BDA16/0005485)、CRCHUM(スタートアップファンド)、Innovation CanadaのJohn R. Evans Leader Award(CFI 42649)にも感謝しています。 プロジェクト助成金はNIH-NIDDK (R01DK135268)、チーム助成金はCIHR、JDRF (CIHR-IRSC:0682002550;JDRF 4-SRA-2023-1182-SN)です。カミーユ・ディオン氏とハリー・リーチ博士は、NIHRインペリアルBRC(生物医学研究センター)オルガノイド施設(ロンドン)でヒトiPS細胞の作製と培養を支援してくれました。

ヒト多能性幹細胞の膵臓β細胞への分化

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ヒトPS細胞の膵β細胞への分化が成功するかどうかは、選択したヒトPS細胞の日常的な培養と継代のあらゆる側面を最適化することにかかっています。これには、細胞株が正常な核型を持ち、マイコプラズマ感染が陰性であり、プラスミドまたはウイルスベクターゲノムがないことが含まれます。また、iPS細胞を用いる場合、まだリプログラミング中の最も早い継代をパイロット実験に用いることは避けることが重要です。これらの実験は、最高の分化ポテンシャルと最適な継代数を持つhPS細胞株を特定するために、小規模に実施する必要があります。
分化効率に影響を及ぼし得る他のパラメータには、使用される幹細胞培地の品質、コーティング密度、および継代数が含まれる10、12。このプロトコルは、関連するすべてのパラメータが最適化されるようにすることで、差別化の効率を最大化するように最適化されています10。
hPS細胞のβ細胞への分化をサポートするために、各段階で特定の製剤を用いた分化培地が使用されます。アクチビンAおよびWntアゴニストを分化培地中で使用し、決定的な内胚葉細胞への移行を開始します。原始的な腸管の段階では、KGFを培地に添加してβ細胞へのさらなる分化を促進し15、このKGFの包含は6日目から8日目まで維持され、Sui、Egliらによる元のプロトコルとは異なります10。膵臓前駆細胞の段階では、Pdx1転写因子の発現を増強するために、特定の培地組成が最適化されます。これは、骨形成タンパク質(BMP)経路を阻害する高濃度のレチノイン酸(RA)、KGF、およびLDN193189を使用することによって達成されます8。分化が内分泌段階に進行するにつれて、培養培地はノッチシグナル伝達をダウンレギュレートするように修飾されます。これは、γセクレターゼ阻害剤であるXXIを、T3(甲状腺ホルモン)、RA、およびアクチビン/BMP/TGF-β経路の阻害剤であるRepSoxとともに組み込むことによって達成されます8。この化合物の特定の組み合わせは、膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化を促進するために使用されます。最後に、直接分化プロセスを最適化するために、膵臓前駆細胞から内分泌前駆細胞への分化中にアフィジコリン(APH)が導入されます。このAPHの追加は、β細胞分化をさらに促進することを目的としており、Sui、Egliらによって提案された最初のプロトコルとは明確な変更を表しています10,11。
分化の過程では、細胞密度をモニタリングし、適切な分化を妨げる可能性があるため、過剰なコンフルエントを防ぐことが重要です。高密度培養は、高いOct4発現を維持し、決定的な内胚葉への分化を阻害します。最初の洗浄ステップでROCK阻害剤を除去することは、分化を開始し、hPS細胞の多能性状態を変化させるために不可欠です。インスリン遺伝子座にGFPを組み込んだMel1 INS-GFPなどの蛍光マーカーを使用すると、膵臓前駆細胞およびβ細胞段階での分化の進行の評価が容易になり、下流の実験に役立ちます14。
ヒト多能性幹細胞を膵β様細胞に分化させる現在のプロトコルは、異なるhPS細胞株間で効率にばらつきがあることを実証している10。さらに、得られたβ様細胞は、ヒトの膵島と比較して機能的未熟さを示し、細胞あたりのインスリン分泌が少ないことを示しています。この限界にさらに対処するために、分化の最終段階で膵島オルガノイドを動物モデルに移植することにより、β様細胞のin vivo成熟を達成することができます6,7。
これらの制限にもかかわらず、hPS細胞の膵β細胞への分化は、既存の方法と比較して大きな可能性を秘めています8,9,10。この技術により、グルコースに反応し、β細胞マーカー(Pdx1およびNkx6.1、図2を参照)を発現するβ細胞様細胞を大量に作製することができます。これは、ヒトの膵島の使用に関連する倫理的、技術的、およびソースの制限なしに行われます。さらに、この技術は、薬物検査や疾患モデリングのために患者固有のβ細胞を生成できるため、個別化医療に適用できる可能性があります4,6,7。この技術は、膵臓のβ細胞の喪失または機能不全を伴う糖尿病の治療にも将来的に応用される可能性があります4,6,7。

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、さまざまな細胞型に分化する独自の能力を有しており、ヒト膵臓β細胞の代替として有力な存在となっています1。これらのヒトPS細胞は、胚盤胞に由来する胚性幹細胞(hESC)2と、体細胞を直接リプログラミングして作製した人工多能性細胞(iPS細胞)3の2種類に分類されます。ヒトPS細胞をβ細胞に分化させる技術の開発は、基礎研究と臨床の両面で重要な意味を持ちます1,4。糖尿病は、世界中で4億>人が罹患している慢性疾患であり、膵臓β細胞の機能不全または喪失により、体が血糖を調節できないことに起因します5。移植用の膵島細胞の利用可能性が限られているため、糖尿病の細胞補充療法の開発が妨げられています2,4,6,7。ヒトPS細胞を用いてグルコース応答性インスリン分泌細胞を作製できることは、ヒト膵島の発生と機能を研究するための有用な細胞モデルとして有用です。また、制御された環境で糖尿病治療の潜在的な治療候補をテストするためにも使用できます。さらに、ヒトPS細胞は、患者と遺伝的に同一の膵島細胞を産生する可能性を秘めており、移植後の免疫拒絶反応のリスクを低減します2,4,7。
近年、hPS細胞の培養と分化プロトコルの改良が著しく進歩し、その結果、膵臓β細胞の作製に向けた分化プロセスの効率と再現性が向上しています8,9。
次のプロトコルは膵臓のβ細胞の指示された微分の必要な段階を概説する。これには、異なる時点での特定の細胞シグナル伝達経路の調節が含まれます。これは、Sui L. et al.10 (2018)によって開発された、膵臓β細胞へのhPS細胞の作製プロトコルに基づいています。最新の研究では、β細胞の分化を促進するためにアフィジコリン(APH)治療を使用することの重要性が強調されているため、プロトコルはSui L. et al.11 (2021)からの最近の更新に合わせて調整されました。現在のプロトコルには、プロセスの後期段階で培地にAPHを添加することが含まれています。さらに、初期のプロトコルと比較して、分化の初期段階で培地の組成に修正が加えられています。注目すべき変化は、6日目にケラチノサイト成長因子(KGF)が追加され、8日目まで続くことです。ケラチノサイト増殖因子(KGF)は6日目から8日目に導入されますが、これはKGFがステージ4培地に含まれていなかった最初のプロトコル10とはわずかに異なります。
β細胞様細胞を作製するための最初の重要なステップは、膵臓を含むさまざまな臓器の上皮内膜を生じさせる原始的な胚葉である最終内胚葉(DE)へのヒトPS細胞の分化です。DEの形成後、細胞は原始的な腸管に分化し、その後、後部前腸の運命が特定されます。その後、後部前腸は膵臓前駆細胞に発達し、内分泌細胞や外分泌細胞を含む膵臓のすべての細胞タイプに分化する可能性があります。プロセスの次の段階では、膵臓の内分泌前駆細胞が関与し、ランゲルハンス島に見られるホルモン分泌細胞が生じます。最終的に、分化プロセスは、完全に機能する膵臓β細胞様細胞を産生することにより、最終段階に達します9,10。このプロセスは複雑であり、分化の効率と特異性を改善するために、特異的な成長因子や細胞外マトリックス成分などの培養条件の最適化が必要になることが多いことに注意することが重要です9,10。さらに、in vitroでhPS細胞から機能的なβ細胞様細胞を作製することは依然として大きな課題です。現在進行中の研究は、分化プロトコルの改善と、得られたβ細胞の成熟と機能の強化に焦点を当てています9。
このプロトコルでは、細胞の生存率と多能性を維持するために、hPS細胞の培養および継代中の穏やかな細胞解離の使用が不可欠であり、膵β細胞への分化効率が大幅に向上します。さらに、各病期特異的培地は、Sui L.らによって開発されたプロトコルに従って細心の注意を払って最適化されており10 、ヒト膵島によく似たクラスターでインスリン分泌細胞の高収率を促進します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL TubeOne 微量遠心チューブ</td><td>Starlabs</td><td>S1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>6ウェル細胞培養プレート</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>165218</td><td></td></tr><tr><td>AggreWell 400 6ウェルプレート&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>34425</td><td></td></tr><tr><td>アンチグルカゴン&nbsp;</td><td>Sigma-aldrich</td><td>G2654-100UL</td><td></td></tr><tr><td>抗インスリン&nbsp;</td><td>ダコ</td><td>A0564</td><td></td></tr><tr><td>アンチNKX6.1</td>ノ<td>バスバイオロジカルズ</td><td>NBP1-49672SS</td><td></td></tr><tr><td>アンチPDX1&nbsp;</td><td>アブカム</td><td>ab84987</td><td></td></tr><tr><td>アブミコリン</td><td>シグマ - アルドリッチ</td><td>A4487</td><td></td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50X)、無血清&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン、脂肪酸フリー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803-100G</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3306</td><td></td></tr><tr><td>カルシウム/マグネシウムフリー D-PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>シクロパミン-KAAD</td><td>カルバイオケム</td><td>239804</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-グルコース、BioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>リン酸水素二ナトリウム、無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94046-100ML-DMEM</td><td></td></tr> <tr><td>と GlutaMAX 洗浄</td>用サー<td>モフィッシャー科学</td><td>10566016</td><td>培地 2: DMEM と GlutaMAX 1% PS.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM/F-12 (ダルベッコ改変イーグル培地/栄養混合物 F-12)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>エプレディ スーパーフロスト プラス 接着スライド</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>VWR</td><td>20821.33</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270098</td><td></td></tr><tr><td>ガンマセクレターゼ阻害剤 XX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>J64904</td><td></td></tr><tr><td>ゲルトレックス LDEV-フリー 還元成長因子 ベースメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>A1413302</td><td>ゲルトレックスを 1:1 を冷たい DMEM/F-12 培地に 1:1 で希釈し、最終希釈率 1:100 にします。</td></tr><tr><td>ヤギ抗モルモット, Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21435</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗モルモット, Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150187</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体, Alexa Fluor 633</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗ウサギIgG二次抗体, Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11011</td><td></td></tr><tr><td>ヘパリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>HEPES バッファー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342, 三塩酸塩</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>ヒト FGF-7 (KGF) 組換えタンパク質</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>PHG0094</td><td></td></tr><tr><td>塩化水素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>295426</td><td></td></tr><tr><td>ImmEdge疎水性バリアPAPペン</td><td>寒天AGG4582</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LDN193189</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0559-5MG</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272-500G</td><td></td></tr><tr><td>OCT化合物 118 mL</td><td>寒天AGR1180</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS錠剤、リン酸緩衝生理食塩水、フィッシャーバイオ試薬</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (PS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック、</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトEGFタンパク質</td><td>R&D Systems</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>長方形カバーガラス、22回;50 mm</td><td>VWR</td><td>631-0137</td><td></td></tr><tr><td>RepSox (塩酸塩)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72394</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement&nbsp;&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>61870036</td><td>洗浄用メディウム 1: RPMI 1640 と GlutaMAX 1% PS.</td></tr><tr><td>Shandon Immu-mount</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>9990402</td><td></td></tr><tr><td>重炭酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6014-500G</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>リン酸二水素ナトリウム 無水</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7558-80-7</td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff 内胚葉&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5110</td><td></td></tr><tr><td>StemFlex Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3349401</td><td>StemFlex Supplement を 4°C で一晩解凍します。C、サプリメントボトルの残留液体をStemFlex基礎培地に移します。</td></tr><tr><td>Stemolecule All-Trans Retinoic Acid</td><td>Reprocell</td><td>04-0021&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>甲状腺トルモン 3 (T3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液、0.4%</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypL 発現酵素 (1X)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287-500ML</td><td></td></tr><tr><td>懸濁培養用超低接着プレート</td> サー<td>モフィッシャーサイエンティフィック</td><td>38071</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 (二塩酸塩)&nbsp;</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr><tr><td>硫酸亜鉛</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>Z4750</td><td></td></tr></tbody></table>の

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

Optimized Protocol for Generating Functional Pancreatic Insulin-secreting Cells from Human Pluripotent Stem Cells

ヒト多能性幹細胞(hPSC)は、あらゆる種類の細胞に分化できるため、ヒト膵臓β細胞の優れた代替供給源となっています。ヒトPS細胞は、胚盤胞由来の胚性幹細胞(hESC)と、リプログラミングプロセスを用いて体細胞から直接作製した人工多能性細胞(iPS細胞)のいずれかです。ここでは、hPS細胞の分化とその後のインスリン産生膵細胞の生成前の最適な培養および継代条件を概説するために、ビデオベースのプロトコルを紹介します。この方法論は、ヒトPS細胞が最終内胚葉(DE)、原始腸管、後部前腸運命、膵前駆細胞、膵臓内分泌前駆細胞、そして最終的に膵β細胞に分化する、β細胞指向性分化の6段階のプロセスに従います。この分化法は、ヒト膵臓β細胞を生成するのに27日かかることは注目に値します。インスリン分泌の可能性は、免疫染色とグルコース刺激インスリン分泌を含む2つの実験を通じて評価されました。

この論文で説明するプロトコールは、hPS細胞からβ様細胞を分化するための非常に効率的なアプローチを提供します10。このプロセスでは、拡張が容易な2D培養システムを利用しており、学習分化、小規模なプロジェクトや実験室、iPS細胞株の分化の可能性を評価するためのパイロットテストなど、さまざまな実験環境での使用が可能です。
グルコースの恒常性に関する洞察を得るためには、膵島で分化したβ細胞の機能特性を特徴付けることが不可欠です。これは通常、β細胞マーカーやインスリン発現の免疫染色、および低グルコース濃度と高グルコース濃度に応答して膵島機能をテストするグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイなどのさまざまな実験によって達成されます12,13。β細胞は、Nkx2-2、Pdx1、Nkx6-1、Neurod1などの特徴的な遺伝子を持っており、これらはβ細胞の同一性の確立と維持に重要である9。免疫染色技術は、組織切片内のタンパク質の発現と局在を調べるために有用です。β細胞マーカーの免疫染色は、主要な膵臓系譜マーカーの発現レベルを評価することができ、分化プロセスの忠実度と特定のアプリケーションへの最適化に関する洞察を提供します9,12。
本研究では、Mel1 InsGFP/w(Mel1 INS-GFP)14 hES細胞レポーター株を用いて、ヒトの天然膵島に見られる細胞に類似したβ細胞を含む、異なる細胞型からなるクラスターを分化しました。このホワイトペーパーの 図2 は、微分プロセスの効率と精度に関する重要な発見を示しています。結果は、膵臓系統内のインスリン発現細胞の高濃縮を示しており、これらの細胞はグルコース刺激インスリン分泌を示します。これは、分化過程を通じて機能的なβ様細胞の作製に成功したことを示しています。
分化した細胞を低グルコース濃度と高グルコース濃度で刺激したところ、GSISの結果、Mel1細胞由来のクラスターは、グルコースに対するインスリン分泌応答において膵島と同様に機能することが示されました。Mel1由来のクラスターは、低グルコース濃度と比較して、高グルコース濃度に反応して100倍多くのインスリンを分泌することがわかりました。具体的には、インスリン含量は、3.3mMの低グルコースで0.003±0.002%、16.7mMの高グルコースで0.236±0.197%であった。
Mel1 INS-GFP ヒトESCに由来するクラスターは、GSISアッセイに加えて、その組成と機能を決定するためにさらに分析されました。具体的には、β細胞シグネチャー遺伝子の発現と、クラスター内の異なる細胞型の存在を調べました。その結果、このプロセスから得られた膵臓系統はインスリン陽性細胞に富んでおり、ヒトES細胞のβ細胞様細胞への分化プロセスにおいて高いレベルの成功率を示していることが示されました。さらに、β細胞のアイデンティティの確立と維持に重要なNkx6.1やPdx1などのシグネチャー遺伝子の発現を調べました。解析の結果、細胞の約25%と40%がそれぞれNkx6.1とPdx1を発現していることが明らかになり、クラスターに分化したβ様細胞が含まれているという追加の証拠が得られました(クラスターあたりの平均Nkx6.1+細胞は24.9%±6.2%、n=9クラスター、Pdx1+細胞は40.2%±6.2%、n=9、SEM、 図2)。さらに、クラスターには、全細胞集団の約15%を占めるグルカゴン陽性細胞など、他の細胞タイプが含まれていました。これらの細胞は典型的には、ランゲルハンス島原産のアルファ細胞に見られ、細胞組成の点でヒトの膵島によく似ていることが示唆されている。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig01.jpg"> 図1:ヒトPS細胞の膵β細胞への分化 。 (A)最終内胚葉誘導、原始腸管形成、後部前腸運命決定、膵前駆細胞生成、膵内分泌前駆細胞形成、そして膵β細胞分化の6つの連続した段階を含む、hPS細胞の膵β細胞への in vitro 指向分化の模式図。膵臓のβ細胞分化は、ヒト膵島発生の重要な段階を利用し、特定の時期に特定の細胞シグナル伝達経路を調節します。B27:B-27サプリメント;Ri:rho関連プロテインキナーゼ阻害剤またはROCK阻害剤;T3:甲状腺ホルモン;KGF:ヒトKGF/FGF-7タンパク質;RepSox:アクチビン/リンパ節/TGF-β経路阻害剤;ALK5を阻害します。RA:レチノイン酸;ZS:硫酸亜鉛;UFH:未分画ヘパリン;XX:γ-セクレターゼ阻害剤XX;APH:アフィジコリン;EGF:上皮成長因子;LDN:BMP阻害剤III、LDN-212854;シクロ:シクロパミン-KAAD。(B)多能性幹細胞から膵β細胞への分化のさまざまな段階で撮影された細胞形態の画像。1枚目の画像は、分化初日のヒト多能性幹細胞(HPSCの単層)です。(C)11日目、細胞は膵臓前駆細胞期にあります。100μmのスケールバー。 (D)12日目に、膵臓前駆細胞段階で細胞が解離した後、6ウェルプレートのマイクロウェルにクラスターが形成されます。(E)13日目に、クラスターは低付着の6ウェルプレートにあります。100μmのスケールバー。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65530/65530fig02.jpg"> 図2:分化したMel1 InsGFP/w hES細胞レポーターライン14から得られたクラスターを、β細胞成熟マーカーを発現するインスリン産生細胞の存在を評価しました。 (A)クラスターの免疫蛍光画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してクライオモールド切片(5 μm)からキャプチャされ、グルカゴン産生細胞(約15%)(n=9クラスター、 約18,000細胞、SEM)。(B)クラスターの免疫蛍光画像は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を使用してクライオモールド切片(5 μm)から取得され、膵臓β細胞マーカーNkx6.1(n = 9クラスター、約18,000細胞)と共発現するインスリン産生細胞が優勢であることが示されました。(C)マーカーの免疫染色用に特別に設計されたImageJセルカウンターマクロを使用して、インスリン陽性、グルカゴン陽性、およびβ細胞マーカーNkx6.1陽性細胞、およびβ細胞マーカーPdx1陽性細胞の割合を測定しました。(D)Mel1 InsGFP/w hESC由来クラスターのグルコース刺激インスリン分泌を評価したところ、分化したクラスター(n=9、SEM)の高グルコース刺激(16.7mMグルコース)に応答して100倍の増加を示しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/65530fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>
表1:指向性分化のための培地組成の要約。 この表は、グルコース刺激インスリン分泌バッファーとともに、幹細胞マトリックスおよび培地上での指向性分化の各日/段階に使用される培地組成の概要を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65530/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

この記事はセルのようなβ細胞の指示された微分そして機能分析のためのプロトコルを示す。インスリン産生膵細胞を作製する前のヒト多能性幹細胞の最適な培養条件と継代について記述します。6段階の分化は、決定的な内胚葉の形成から、グルコースに反応してインスリンを分泌する機能的なβ細胞様細胞へと進行します。

Human pluripotent stem cells (hPSCs) can differentiate into any kind of cell, making them an excellent alternative source of human pancreatic ...

多能性幹細胞をヒトベータ細胞に変換するための分化プロセスにおいて、高い一貫した効率を達成することは、注目すべき課題です。この課題は、実験者がプロトコルに従う精度と一貫性に影響されます。さらに、各実験で得られたベータ細胞の量は非常に多様であり、複数の実験でベータ細胞の機能が低下する可能性があります。糖尿病における高レプチンベータ細胞研究の文脈では、死体アイレットドナーの利用可能性は非常に限られています。その結果、幹細胞分化ベータ細胞の使用は、インスリン分泌細胞の無制限かつ豊富な供給を提供します。ベータ細胞の分化は、私たちの分野における極めて重要な進歩であり、多くの利点をもたらします。これにより、ベータ細胞の発生と機能を調べることができ、糖尿病の原因とベータ細胞の機能不全をより深く理解することができます。この手法を糖尿病の遺伝学に着目した研究に役立てることを目指しています。私たちの主な目的は、ベータ細胞とアイレット機能に影響を与える可能性のある特定の遺伝子の突然変異に焦点を当てることです。従ってこのプロトコルは興味の突然変異の前有効な幹細胞から得られる人間のアイレットへのアクセスを促進する。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

現在の研究では、ヒト胚性幹細胞の膵臓の分化誘導の指示分化のアプローチについて説明します。大きな意義のインスリン発現する細胞に膵臓の前駆細胞由来のヒト胚性幹細胞の発見、その内皮細胞の共培養を仲介する成熟である。...

監督分化アプローチで細胞を産生する膵臓インスリンにヒト胚性幹細胞の内皮細胞の共培養を仲介する成熟

ここでは、下流のアプリケーション、さらに分化の改善のための胚体内胚葉に向けてコミットしている分化したヒト胚性幹細胞を精製するための方法を説明します。...

ヒト胚性幹細胞から生成された内胚葉細胞の精製のための迅速かつ効率的な方法

ここでは、in vitroで NKX6-1 +膵臓前駆細胞にヒト胚性幹細胞を区別するために4段階のプロトコルを記述します。このプロトコルは、ヒト多能性幹細胞株の多様に適用することができます。...

NKX6-1への多能性幹細胞の効率的分化<sup&gt; +</sup&gt;膵臓前駆細胞

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

分離したフローティング e10.5 膵前駆細胞と関連付けられて間充織から 3 D マウス pancreatoids...

マウス膵臓前駆細胞の in Vitroからスキャフォールド フリー、三次元のインスリンを表現する Pancreatoids の生成

ここでは、膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+にひと多能性幹細胞 (hPSCs) を区別するために詳細なプロトコルを提案 (PDX1+) の非植民地型単層成長に基づいて膵臓系譜の生成のためのセル単一細胞を分離しました。このメソッドは、同種 hPSC...

効率的な世代の膵臓・十二指腸ホメオ蛋白質 1+後部の前腸・膵前駆細胞接着培養における hPSCs から

このプロトコルは、ヒト歯髄幹細胞(hDpSC)を...

インビトロ 膵臓系統に向けたヒト歯髄幹細胞の誘導

本プロトコルは、平面単層におけるヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する膵臓前駆細胞におけるPDX1およびNKX6.1転写因子の共発現を増加させるための増強された方法を記載する。これは、新鮮なマトリックスを補充し、細胞密度を操作し、内胚葉細胞を解離することによって達成される。...

2D培養系におけるヒト多能性幹細胞の膵臓ベータ細胞前駆体への分化

幹細胞の膵島細胞への分化は、従来の糖尿病治療や疾患モデリングに代わるソリューションを提供します。市販の分化キットと以前に検証された方法を組み合わせて、インスリン分泌性幹細胞由来の膵島を皿で産生するのに役立つ詳細な幹細胞培養プロトコルについて説明します。...

ヒト多能性幹細胞のインスリン産生膵島クラスターへの分化

私たちは、免疫不全マウスへのヒト幹細胞由来膵幹細胞膵島の筋肉内移植のための低侵襲プロトコルを提供し、 生体内...

マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

学ぶヒト多能性幹細胞からインシュリン分泌細胞への分化プロトコル。6段階の誘導分化により機能的なβ細胞様細胞を生成し、グルコース応答性インシュリン分泌を確認。糖尿病研究と再生医療への応用に貢献します。

ヒト多能性幹細胞から機能的な膵臓インシュリン分泌細胞を生成するための最適化されたプロトコル

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