蒸発低減文化条件は、マイクロタイタープレートに多細胞スフェロイド形成の再現性を高め

この手順の全体的な目標は、384ウェルプレートの液体オーバーレイ技術を使用して、均一なスフェロイド形成のスケーラビリティと再現性を向上させることです。この技術の主な利点は、複数のプレートからの過剰な培地再操作を減らし、それによってスフェロイド形成の再現性を向上させることです。私たちは、節足動物のスクリーニング試験のための3次元スフェロイドの培養法を開発・検証しており、多細胞培養のプレートにおけるエッジ効果を評価する研究を行いました。

今日は、研究室のポスターであるSonaと一緒に手順を実演します。この手順は、ゼロポイント7、5グラムの低融点アガロースを重み付けすることから始め、フェノールレッドおよび血清なしの100ミリリットルのマッコイの5a培地に加えます。溶液を電子レンジで加熱し、1〜2分ごとに渦巻いてアガロースを完全に溶解します。

次に、溶液をオートクレーブして滅菌します。オートクレーブ処理したアガロースを約70°Cまで冷却した後、層流ボックス内の500ミリリットルのゼロポイント2 2マイクロメートルボトルトップフィルターでろ過します。次に、溶液全体を一度に使用しない場合は、分注します。

このすぐに使用できるアガロース溶液は、冷蔵室または摂氏4度の冷蔵庫で最大4週間無菌的に保管してください。フローボックスで作業する場合は、プラスチックまたは金属製の先端を持つ分注カセットをコンビ試薬ディスペンサーに取り付けます。チューブウェイトを70%エタノールの容器に入れ、カセットをプライミングします。

次に、チューブウェイトをPBSの容器に移し、再度プライミングします。次に、ろ過したアガロース溶液の貯蔵アリコートを電子レンジで加熱して溶かします。分注カセットをアガロース溶液でプライミングし、384ウェル組織培養処理されたマイクロプレートを15マイクロリットルのろ過済みアガロース溶液でコーティングするプロトコルを開始します。

プレート内のアガロースを15〜20分間冷ましてから、ビデオの次のセクションで説明するように細胞を播種するか、摂氏4度で直射日光を避けて保存します。最後に、ディスペンシングカセットをクリーニングするには、チューブウェイトを摂氏70〜80度の滅菌水に入れ、ディスペンサーのプライムボタンを押します。これにより、カセットチップとチューブに残っているアガロースが除去されます。

次の細胞播種プロセスは、無菌条件下で層流ボックス内で実行する必要があります。まず、必要な数のアガロースコーティングされた384ウェル組織培養処理マイクロプレートを冷蔵保存から取り出し、室温で15分間平衡化します。それまでの間、70%エタノールと滅菌PBSを含む標準的なチューブ分注カセットをプライミングすることにより、細胞観察用のコンビ試薬ディスペンサーを準備します。

次に、ディスペンサーの手動設定ボタンを使用して、見る量を必要なマイクロリットルに調整し、ディスペンス速度を中型に調整します。組換え細胞解離酵素を使用して、付着したヒト結腸直腸癌HCT116細胞を組織培養フラスコから除去します。滅菌ビーカーで、50マイクロリットルの完全増殖培地中のウェルあたり1ミリリットルあたり10〜4番目の細胞の密度の2.5倍の細胞を含む細胞懸濁液ストックを作成します。

複数の384ウェルプレートを播種する場合は、マグネチックスターラーを使用して、ビーカーの底に沈殿しないようにします。ディスペンサーを使用して、2500個のセルを384ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートを室温で30分間休ませます。

その間、蒸発を減少させる環境マイクロプレートの蓋を取り、5ミリリットルのピペットを使用して、4ミリリットルの5パーセントジメチルスルホキシドを左側のトラフに分注し、ゆっくりと上下にスイープします。右側のトラフでこのプロセスを繰り返します。サイドトラフに加えられた液体が蓋の中央で合流し、ガス交換のための隙間を残さないようにしてください。

液体を添加しすぎると、蓋の外側に浸透し、続いて384組織培養プレートの外側のウェルに入ります。30分経過後、顕微鏡で細胞を検査します。プレートを30分間休ませると、細胞はウェル底に完全に落ち着き、互いに接近することができ、これはウェルごとに単一のスフェロイドを形成するために重要です。

播種したプレートを4回で15分間遠心分離しますG.スピン後、384組織培養プレートの液体リザーバーを滅菌水で満たし、通常のプレートの蓋を液体で満たされた環境蓋と交換します。プレートを湿度95%、CO25、酸素20%の摂氏37度のロータリーインキュベーターに置き、細胞を多細胞腫瘍スフェロイドまたはMCTSに4日間凝集させます。湿度レベルが急激に下がらないように、その後の数日間はインキュベーターのドアを長時間開けないでください。

NCTS形成後4日目に、自動マイクロプレートウォッシャーディスペンサーを使用して、各ウェルに30マイクロリットルの予熱培地を追加します。MCTSをインキュベーターに戻し、実験に必要なサイズになるまでMCTSを成長させます。3日ごとに、媒体を交換するために、ワッシャーマニホールドのZ高さを経験的に調整し、ディスペンス速度とウォッシュマニホールドがウェルに移動する速度を最低速度で設定して、ウェル内の乱流を最小限に抑えます。

ウェルあたり30マイクロリットルの培地を吸引し、30マイクロリットルの新鮮な予熱培地と交換します。その後、細胞をインキュベーターに戻します。開口数16の4つのX空気物体を使用したハイコンテント自動イメージングシステムでMCTSをイメージングします。

イメージングソフトウェアを使用して、露光時間を11ミリ秒に、ビニングを4 x 4に設定します。zスタックの数と間隔、およびピクセルビニングを必要に応じて調整し、実験で各ウェルのMCTS全体をキャプチャします。2D画像を段階的に処理して、MCTSの面積、長軸と短軸、周囲長、および堅牢性を測定します。

具体的な手順については、付属のm-codeとテキストのreadmeファイルを参照してください。ルーチンの潜在的な適用性を判断するために、7日齢のMCTSを、異なる濃度の抗がん剤、パクリタキセル、PTX、ビンクリスチン、VCR、オキサリプラチン、OXA、ドキシルビシン、DOX、および5種類のフルルラシル、5-FUを3つの異なる濃度で4日間治療した。MCTS の画像を次に示します。

これらの画像を解析して、薬物処理されたMCTSの面積、長軸と短軸、周囲長、および固さを対照群であるCTLと比較して決定しました。長軸と短軸は、幾何学的な体積を計算するために使用されました。薬物治療後、MCTSの面積と体積の濃度依存的な減少がみられました。

ビンクリスチンの1ミリリットルあたりゼロポイント1マイクログラムとミリリットルあたりゼロポイント4マイクログラムのドキシルビシンと5フルオロウラシルはMCTS面積の増加をもたらしましたが、ボリュームはポイントゼロゼロ1ミリリットルあたり1マイクログラムのビンクリスチンの後にのみ大幅に増加しました。MCTS周囲長は、Packlitaxel、Doxyrubicin、およびFive Fleurouracilの濃度が最も高い場合にのみ有意に異なり、MCTSサイズに完全に影響を与えました。ゼロポイント2 5マイクログラム/ミリリットルおよびゼロポイントゼロ6マイクログラム/ミリリットルおよびドキシルビシンおよび5フルユーロウラシルを1ミリリットルあたり100マイクログラムでパックリタキセルおよびビンクリスチンで処理すると、固体性が大幅に減少し、MCTSの完全または部分的な崩壊が示された。

まとめると、これらのデータは、潜在的な抗がん剤の調査におけるこの方法の有用性を示しています。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2時間で完了します。この手順を試みる際には、すべての細胞株が特定の3D培養方法に適しているわけではなく、異なる細胞株がスフェロイドを形成し、スフェロイドの形状、サイズ、組織学、および増殖速度に違いが見られることに注意することが重要です。

私たちが開発した刺激ルーチンは、特に断面積の測定に明確に定義された境界を持たない部分的に崩壊した薬物処理されたスフェロイドにおいて、スフェロイドサイズの効果的な評価を可能にします。このビデオを見た後、ここにある改造は追加の機器や消耗品を必要とせず、節足動物スクリーニングラボで日常的に実装できるという事実を十分に理解できるはずです。