培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

本手順の全体的な目的は、市販の昆虫細胞内で目的のタンパク質に蛍光タグを付けて発現させ、タンパク質の機能や細胞内輸送の解明を促進することです。この手法は、タンパク質の機能性、タンパク質間相互作用、または細胞内でのタンパク質の局在に関する、細胞生物学および生化学に基づいた重要な問いへの回答に役立ちます。本手法の主な利点は、コンストラクトを迅速に作製でき、バキュロウイルス発現に伴う有害な影響を受けることなく、生細胞内で発現タンパク質の機能を評価できるため、スループットを向上させられる点にあります。

この手法は昆虫タンパク質の研究に知見をもたらすだけでなく、タンパク質の機能や細胞内局在の研究を目的とするあらゆる系に適用可能です。昆虫細胞の培養およびトランスフェクションの手順については、私の研究室の技術者であるDanni LeRoyが実演します。まず、-80 °Cのフリーザーから凍結保存されたSF9細胞およびTni細胞のストックバイアルを取り出し、37 °Cの恒温水槽で融解させます。

解凍後、バイアルを70%エタノールで除菌し、氷上に置きます。バイアルや組織培養フラスコを開封する必要があるすべての細胞操作は、無菌状態を維持するためにラミナーフローフード内で行ってください。新しいT25フラスコに無血清昆虫培地を4 mL加え、別のT25フラスコにTNM-FH培地を4 mL加えます。

解凍したTni細胞 1 mLを無血清昆虫培地が入ったフラスコに、解凍したSF9細胞 1 mLをTNM-FH培地が入ったフラスコにそれぞれ移します。フラスコを 28 °C の非加湿インキュベーターに入れ、30～45分間静置して細胞を接着させます。その後、播種培地を 5 mL の適切な培地と交換します。

その後、フラスコを28 °Cの非加湿インキュベーターに戻します。細胞のコンフルエンスを毎日モニターしてください。これらの代表的な画像に示されるように、コンフルエンスが90%に達した時点で細胞を継代します。

コンフルエントになった細胞が入ったフラスコを傾け、培地を細胞単層から離れた隅に集め、滅菌済みの5 mLセロロジカルピペットを使用して、細胞を乱さないように注意しながら培地を除去します。Tni細胞の場合、新しい滅菌済みの5 mLセロロジカルピペットを使用して、コンフルエントな単層上に4 mLの無血清昆虫培地を静かに加えます。ピペットチップをフラスコ内で動かし、ゆっくりと洗浄して、フラスコ底面に弱く付着している細胞を除去します。

細胞が十分に剥離しているかを確認するため、培地をすべて取り除き、フラスコを逆さまにして底面がきれいであることを確認します。より強く接着するSF9細胞の場合は、新鮮なTNM-FH培地を4 mL加え、セルスクレイパーを用いて接着した細胞を剥離させます。5 mLのセロロジカルピペットを用いて穏やかに混ぜ、細胞の凝集を解消してください。

細胞を剥離させた後、細胞と培地の混合液を約0.1 mLずつ、1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。別の0.5 mLマイクロ遠心チューブに、細胞と培地の混合液10 µLとトリパンブルー10 µLを加えます。細胞計数用チャンバースライドを包装から取り出し、細胞・培地・トリパンブルーの混合液10 µLを計数スライドの両側に加えます。

スライドを自動細胞計数器に挿入し、細胞密度と生存率を測定します。約1～1.5 × 10⁶ 個の細胞を、新鮮な培地が入ったT25フラスコに移します。フラスコに、細胞株、日付、使用した培地、添加細胞数、および継代数を記載してください。

フラスコを28 °Cのインキュベーターに最大72時間置きます。昆虫細胞のトランスフェクションの手順は、ラミナーフローフード内で行う必要があります。T25フラスコに、適切な昆虫細胞培地を用いて、最大1 × 10⁶個のTni細胞またはSF9細胞を播種します。

このデモンストレーションではTni細胞を使用します。細胞を18 °Cで72時間、コンフルエントになるまで培養します。72時間後、古くなった培地を除去して廃棄し、先に示した通り、4 mLの新鮮な無血清昆虫培地を用いてTni細胞を剥離させます。

この手順で最も困難な点は、トランスフェクション時にガラス底ディッシュに付着させる細胞の適切な密度を得ることです。各ディッシュに添加する細胞数は7 × 10⁵個以下としてください。自動細胞計数装置を用いて細胞密度を推定した後、チューブを反転させて細胞懸濁液を十分に、かつ穏やかに混ぜ合わせ、個々の35 mmガラス底ディッシュに約7 × 10⁵個の細胞を添加します。

細胞を28 °Cで20〜25分間静置し、接着させます。各トランスフェクションにつき、滅菌済みの1.5 mLマイクロ遠心チューブに、FBS不含の無血清昆虫培地0.1 mLとプラスミドDNA 2 µgを加えます。別のチューブで、トランスフェクション試薬8 µLと無血清昆虫培地0.1 mLを混合します。

その後、溶液を目的のプラスミドDNAが入ったチューブに移します。軽くボルテックスし、室温で20〜30分間インキュベートします。次に、プラスミド導入混合液を0.8 mLの無血清昆虫培地で希釈し、全量を1 mLにします。

細胞が付着しているガラスディッシュから培地を慎重に取り除きます。希釈したプラスミド導入用培地を付着細胞に重層します。細胞を28 °Cで5時間インキュベートします。

5時間後、トランスフェクション培地を除去して廃棄し、細胞が剥がれないように注意しながら、1 mLの無血清昆虫細胞培地で穏やかに洗浄します。2 mLの新鮮な無血清昆虫細胞培地を加え、28 °Cで48〜72時間インキュベートします。昆虫細胞のトランスフェクションから48〜72時間後、細胞を1 mLのIPL-41昆虫細胞培地で1回洗浄し、その後、イメージングのために2 mLのIPL-41で満たします。

Hoechst生細胞染色試薬を4滴培地に加え、28 °Cで20〜25分間インキュベートします。35 mmディッシュを密閉型の共焦点レーザー走査顕微鏡に設置します。市販のガラスディッシュは数多く販売されていますが、顕微鏡ステージに適合していることが重要であり、細胞付着に最も適したガラス器具を経験的に決定する必要がある場合があります。

Hoechst、EGFP、およびmCherryの観察条件に合わせて顕微鏡を調整します。Hoechstの励起波長は359 nanometers、蛍光波長は461 nanometersに設定します。EGFPの励起波長は489 nanometers、蛍光波長は510 nanometersに設定します。

mCherryの励起および蛍光波長として580 nmおよび610 nmを設定します。10倍対物レンズを用いて初回スキャンを行い、蛍光発現を確認します。その後、60倍位相差水浸対物レンズに切り替えてスキャンモードを実行します。

画像のコントラストと解像度を最適化するために、レーザー出力、検出器の感度、スキャン速度、Z軸深度、およびデジタルズームを調整します。合計90倍の拡大となるよう、1.5倍のデジタルズームで細胞を撮影します。後の解析のため、生データをTIFF画像ファイルとして保存し、エクスポートします。

Tni細胞に指示したプラスミドをトランスフェクションし、組換えタンパク質の発現を共焦点蛍光顕微鏡を用いて可視化した。BtDrip1-EGFPのトランスフェクションおよび発現の成功は、細胞表面に緑色蛍光が認められることで確認できる。BtDrip2 version one EGFPをトランスフェクションした細胞では内部に緑色蛍光が認められ、BtDrip2 version oneが細胞内で発現していることが示された。

同様に、PIB DmSPR-mCherryまたはPIB PLA2G15-mCherryをトランスフェクションした細胞は赤色蛍光を示し、それぞれのキメラタンパク質が発現していることがわかります。マージ画像において、オレンジ色または黄色の領域はEGFPとmCherryの両方が発現していることを示しており、これらのタンパク質が同一の細胞内構造に共局在していることが示唆されます。PIB BtDrip1-EGFPとPIB DmSPR-mCherryをダブルトランスフェクションした細胞のオーバーレイ画像は、BtDrip1-EGFPとDmSPR-mCherryが細胞表面に共局在していることを示唆しています。

BtDrip2 version one EGFPとPIB DmSPR-mCherryを二重トランスフェクションした細胞では、緑色と赤色の蛍光信号の共局在がほとんど見られず、BtDrip2 version oneが細胞内に発現していることが確認された。対照的に、PIB BtDrip2 version one EGFPとリソソームマーカーであるPIB PLA2G15-mCherryを共発現させたところ、細胞質の緑色および赤色蛍光信号に顕著な重なりが認められた。このことは、BtDrip2が細胞内リソソームへ輸送されることを強く示唆している。

このビデオを視聴することで、培養昆虫細胞内で蛍光タンパク質キメラを発現させる方法について深く理解することができます。このシステムは、タンパク質合成における迅速なベクター構築を可能にし、ウイルスベースの発現システムに伴う課題を回避し、細胞内輸送タンパク質を観察するための堅牢な手段を提供します。