培養昆虫細胞における一過性発現および組換えタンパク質の細胞内局在

この手順の全体的な目標は、タンパク質機能の解明やタンパク質の細胞内輸送を強化するために、市販の昆虫細胞内で蛍光タグ付きタンパク質を発現させることです。この方法は、タンパク質の機能、タンパク質相互作用、および/または細胞内タンパク質の局在化に関する主要な細胞生物学および生化学に基づく質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、バキュロウイルスの発現に関連する有害な影響なしに、コンストラクトを生細胞で機能的に評価するタンパク質を迅速に生成および発現させることができることであり、したがってスループットが向上する。

この方法は、昆虫タンパク質の研究に洞察を与えることができますが、タンパク質の機能や細胞局在の研究が望まれる任意のシステムにも適用できます。昆虫細胞の培養とトランスフェクションの手順を実演するのは、私の研究室の技術者であるDanni LeRoyです。この手順を開始するには、凍結したSF9およびTni細胞のストックバイアルをマイナス80°Cの冷凍庫から取り出し、37°Cの水浴で解凍します。

解凍後、バイアルを70%エタノールで除染し、氷の上に置きます。バイアルや組織培養フラスコを開く必要があるすべての細胞操作は、無菌状態を維持するために層流フード内で行う必要があります。新しいT25フラスコに4ミリリットルの無血清昆虫培地を追加し、別のT25フラスコに4ミリリットルのTNM-FH培地を追加します。

解凍したTni細胞1ミリリットルを無血清昆虫培地でフラスコに移し、解凍したSF9細胞1ミリリットルをTNM-FH培地でフラスコに移します。フラスコを摂氏28度の非加湿インキュベーターに入れ、細胞を30〜45分間付着させます。播種培地を5ミリリットルの適切な培地と交換します。

そして、フラスコを摂氏28度の非加湿インキュベーターに戻します。細胞のコンフルエンスを毎日モニタリングします。これらの代表的な画像に示すように、細胞が90%のコンフルエント度に達したときに細胞を継代します。

コンフルエントセルが入ったフラスコを傾けて、培地が細胞単層から離れた1つの角に向かって流れるようにし、滅菌済みの5ミリリットル血清ピペットを使用して、細胞を乱さずに培地を慎重に取り出します。Tni細胞の場合は、新しい滅菌5ミリリットル血清ピペットを使用して、4ミリリットルの無血清昆虫培地をコンフルエント単層に穏やかに加えます。ピペットの先端をフラスコを横切って動かし、ゆっくりと灌漑して、フラスコの底にゆるく付着した細胞を取り除きます。

細胞が適切に剥離しているかどうかを確認するには、すべての培地を取り出し、フラスコを裏返して、フラスコの底が透明であることを確認します。より密着するSF9細胞の場合は、4ミリリットルの新鮮なTNM-FH培地を追加し、細胞スクレーパーを使用して付着した細胞を取り除きます。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、細胞の凝集を穏やかに混合し、減らします。

細胞を剥離した後、各細胞と培地混合物の約0.1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。別の0.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに、各細胞と培地の混合物10マイクロリットルを10マイクロリットルのトリパンブルーに加えます。セルカウンターチャンバースライドをパッケージから取り出し、計数スライドの両側に10マイクロリットルのセル培地トリパンブルー混合物を追加します。

スライドを自動セルカウンターに挿入し、細胞密度と生存率を測定します。6番目の細胞の約1〜1.5倍を6番目の細胞に移し、新鮮な培地でT25フラスコに移します。フラスコに細胞株、日付、使用した培地、添加した細胞の数、および継代番号をラベル付けします。

フラスコを摂氏28度のインキュベーターに最大72時間置きます。昆虫細胞トランスフェクションの手順も、層流フード内で実行する必要があります。T25フラスコに、適切な昆虫細胞培地に6番目のTniまたはSF9細胞の1倍までの1倍を播種します。

このデモンストレーションではTni細胞を使用しています。細胞を摂氏18度で72時間、コンフルエントになるまで増殖させます。72時間後、古い培地を取り出して廃棄し、前に示すように4ミリリットルの新鮮な無血清昆虫培地でTni細胞を取り除きます。

この手順の最も難しい側面は、トランスフェクション中にガラス底皿に付着した細胞の適切な密度を得ることです。各皿に10の5番目のセルを7倍以上追加しないでください。自動セルカウンターを用いて細胞密度を推定した後、チューブを反転させて細胞懸濁液を完全かつ穏やかに混合し、35mmガラス底の個々の皿に5番目の細胞に約7倍の10を加えます。

細胞を摂氏28度で20〜25分間接着させます。トランスフェクションごとに、滅菌済みの1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに、FBSを含まない0.1ミリリットルの無血清昆虫培地に2マイクログラムのプラスミドDNAを加えます。別のチューブで、8マイクロリットルのトランスフェクション試薬と0.1ミリリットルの無血清昆虫培地を混合します。

次に、目的のプラスミドDNAを含むチューブに溶液を移します。軽くボルテックスし、室温で20〜30分間インキュベートします。次に、プラスミドトランスフェクション混合物を0.8ミリリットルの無血清昆虫培地で希釈し、総容量を1ミリリットルにします。

付着した細胞を含むガラス皿から培地を慎重に取り出します。付着した細胞を希釈したプラスミドトランスフェクション培地で重ね合わせます。細胞を摂氏28度で5時間インキュベートします。

5時間後、トランスフェクション培地を取り出して廃棄し、細胞が剥がれないように注意しながら、1ミリリットルの無血清昆虫培地で細胞をやさしく洗浄します。2ミリリットルの新鮮な無血清昆虫細胞培地を加え、摂氏28度で48〜72時間インキュベートします。昆虫細胞のトランスフェクション後48〜72時間後、細胞を1ミリリットルのIPL-41昆虫培地で一度洗浄し、次に2ミリリットルのIPL-41で覆ってイメージングします。

培地にHoechst生細胞染色試薬を4滴加え、摂氏28度で20〜25分間インキュベートします。35ミリメートルディッシュを自己密閉型レーザー走査型共焦点顕微鏡に入れます。多くのガラス皿が市販されていますが、それらが顕微鏡のステージに適合することが重要であり、どのガラス器具が細胞接着に最も適合するかを経験的に判断する必要があるかもしれません。

Hoechst、EGFP、mCherryの観察条件に合わせて顕微鏡を調整します。Hoechstの励起と発光には359ナノメートルと461ナノメートル、EGFPの励起と発光には489ナノメートルと510ナノメートル。

また、mCherryの励起と発光には580ナノメートルと610ナノメートル。10倍対物レンズを使用して、初期スキャンを行い、蛍光発現を確認します。その後、60倍位相差水浸対物レンズを使用してスキャンモードに切り替えます。

レーザー出力、検出器感度、スキャン速度、Z軸深度、デジタルズームを調整して、画像のコントラストと解像度を最適化します。1.5倍のデジタルズームで細胞を画像化し、合計90倍の増幅を行います。生データをTIFF画像ファイルとして保存してエクスポートし、後で分析します。

Tni細胞に示されたプラスミドをトランスフェクトし、組換えタンパク質の発現を共焦点蛍光顕微鏡を用いて可視化しました。組換えBtDrip1-EGFPのトランスフェクションと発現の成功は、細胞表面の緑色蛍光の存在によって明らかです。BtDrip2バージョン1のEGFPをトランスフェクションした細胞は、BtDrip2バージョン1の細胞内発現を示す緑色蛍光を示します。

同様に、PIB DmSPR-mCherryまたはPIB PLA2G15-mCherryをトランスフェクションした細胞は、それぞれのキメラの発現を示す赤色の蛍光を示します。マージされた画像では、オレンジ色または黄色の領域はEGFPとmCherryの両方の発現を示しており、タンパク質が同じ細胞内構造内に共局在していることを示唆しています。PIB BtDrip1-EGFPとPIB DmSPR-mCherryをダブルトランスフェクションした細胞の重ね合わせは、細胞表面におけるBtDrip1-EGFPとDmSPR-mCherryの共局在を示唆しています。

BtDrip2バージョン1のEGFPとPIB DmSPR-mCherryをダブルトランスフェクトした細胞は、緑と赤の蛍光シグナルの共局在をほとんど示さず、BtDrip2バージョン1の細胞内発現を確認しています。対照的に、PIB BtDrip2バージョン1のEGFPとPIB PLA2G15-mCherryリソソームマーカーの共発現は、細胞質の緑色と赤色の蛍光シグナルに有意な重複をもたらしました。このことは、BtDrip2が細胞間リソソームへのトラフィックであることを強く示唆しています。

このビデオを見れば、培養昆虫細胞内で蛍光タンパク質キメラを発現する方法を十分に理解できるはずです。このシステムは、タンパク質合成における迅速なベクター構築を提供し、ウイルスベースの発現システムの課題を回避し、細胞内輸送タンパク質を観察するための堅牢な手段を提供します。