マウスにおけるヒト化骨髄微小環境のバイオエンジニアリングとライブイメージングによるそれらの可視化

本手法の目的は、ヒト細胞キャリアスキャフォールドをマウスに移植してヒト化骨髄ニッチを構築し、移植体内のヒト細胞の挙動をライブイメージングすることである。この手法は、骨髄のさまざまな構成要素を再現し、単一細胞レベルの解像度でライブイメージングできるため、ヒト造血分野における重要な疑問を解決するのに役立つ。このシステムの大きな利点の一つはその汎用性にあり、異なるニッチ構成要素を単独で、あるいは組み合わせて移植することが可能である。

この手法は、腫瘍転移や薬剤スクリーニング研究など、他の研究分野にも応用できる可能性があります。適切な無菌操作を用いて、まず滅菌済みゼラチンスポンジを同程度の大きさの24個の断片に切断します。ゼラチン足場をエタノールに浸漬した後、PBSに浸漬することで再構成します。

次に、各スキャフォールドを滅菌ティッシュで軽く叩いて余分な液体を取り除き、超低接着24ウェルプレートの各ウェルにスキャフォールドを移します。インスリン用注射器を用いて、50 µLの培地に懸濁させた1×10⁵〜1×10⁶個のストローマ細胞を各スキャフォールドに慎重に注入し、プレートを細胞培養インキュベーターに入れます。細胞をスキャフォールドに注入する際は、スキャフォールドから液が漏れていないことを確認してください。

1時間後、各ウェルに3 mLの新鮮な細胞培養培地を満たし、スキャホールドをインキュベーターに戻します。24時間後、1 × 10⁵個の造血細胞をスキャホールドに注入し、続いてインキュベーションとさらなる培地の添加を行い、先ほど示した通りに24時間インキュベートします。リコンビナントヒト骨形態形成タンパク質2担持スキャホールドを作製する場合、再構成したスキャホールドをU底96ウェルプレートの各ウェルに配置し、各スキャホールドに5 µLのリコンビナントヒト骨形態形成タンパク質2を加えます。

次に、スキャフォールドに20 µLのトロンビンと20 µLのフィブリノゲンを滴下して覆います。バイオエンジニアリングされたスキャフォールドを外科的に移植するために、まず実験用マウスの背中の手術部位を剃毛し、希釈したクロルヘキシジンを浸した綿棒を用いて、露出した皮膚表面を各方向に3回ずつ清浄します。次に、滅菌鉗子とメスを用いて皮膚に0.5〜0.7 cmの前後方向の切開を行い、皮下組織の下に鉗子を挿入してポケットを作成します。

スキャフォールドをポケットの深部に挿入し、切開部を外科用接着剤で閉鎖します。摘出まで、植え込まれたスキャフォールドを8～24週間育成させます。蛍光物質を静脈投与し、動物を安楽死させた後、先ほど示した方法で皮膚を滅菌し、元の植え込み部位に近い動物の背面に縦方向の皮膚切開を加えます。

足場材を移植した皮下ポケットから皮膚を慎重に剥離し、ピンセットで足場材を優しく掴んで、構造を回収するために足場材周囲の残留膜および組織を慎重に切除します。速乾性の接着剤を使用して、足場材を35 x 10 mLのペトリ皿に固定します。骨形態形成タンパク質2（BMP-2）足場材の場合、プレートにPBSを満たす前に、顕微鏡下でサージカルマイクロドリルを使用し、骨表面を薄くすることで、蛍光色素の可視化と高解像度画像のキャプチャを可能にします。

骨の厚さはスキャフォールドごとに異なることが一般的であり、表面を破損させないことが重要であるため、ドリリング工程では特に注意してください。ディッシュに室温のPBSを満たします。バイオエンジニアリングで作製したスキャフォールドの2光子顕微鏡イメージングを行うには、スキャフォールドを共焦点顕微鏡のステージ上に配置し、20倍 1.0 NAの水浸レンズを選択してください。

次に、イメージングソフトウェアの取得モードで、「show manual tools（手動ツールを表示）」ボックスを選択します。レーザーメニューで2光子レーザーをオンにし、レーザーをウォームアップさせて安定させます。レーザーの準備ができたら、イメージングセットアップメニューでチャンネルモードを有効にし、「switch track every frame（フレームごとにトラックを切り替える）」を選択します。

光路メニューで「non descanned」およびメインビームスプリッターに「MBS 760 plus」を選択します。4つのnon descanned検出器を有効にし、構成を概略図の通りに設定します。チャンネルメニューで、レーザー波長を890 nanometersに、出力を50%に設定します。各チャンネルのゲインマスターを500から600に、デジタルオフセットを0に、デジタルゲインを15に設定します。

取得モードにおいて、組織を損傷させず、また蛍光色素を退色させることなく高解像度画像を得るために適切なパラメータを設定します。次に、画像の初期スキャン用にズームを1に設定します。すべてのパラメータ設定が完了したら、レンズを生理食塩水に触れるまで下げ、ランプを光源としてレンズのピントを手動で合わせます。

次にZ-stackメニューを起動し、最初のlast関数を選択します。2枚の連続するスライス間の必要な間隔を設定し、liveを選択してサンプルのライブスキャン画像を撮影します。その際、最適な露光量を得るために、必要に応じてデジタルゲインとデジタルオフセットを調整してください。複数のチャンネルを同時に可視化するには、split関数を選択します。

ステージメニューのライブモードで画像をスキャンし、骨腔の位置などの関心領域（ROI）をマークします。サンプルのスキャンが完了したら、最初の関心領域に移動し、ライブモードの「set first」および「set last」機能を使用して、関心領域周辺の3D Zスタックの上端と下端を設定します。次にセンター（C）を設定し、「start experiment」ボタンをクリックして、関心領域のZスタック画像取得を開始します。

取得が完了したら、画像を指定のフォルダに保存し、次の関心領域をスキャンします。これらの代表的な画像では、移植から8週間後の免疫不全NSGマウスから回収した異なるスキャフォールドの肉眼的形態を観察することができます。ヒト血管内皮細胞との共播種によりスキャフォールドの血管新生が促進され、組換えヒト骨形成タンパク質2の添加により骨形成が誘導されます。

生体2光子顕微鏡で観察したこれらのスキャフォールドでは、スキャフォールド内に血管が存在すること、およびヒト造血細胞がスキャフォールド実質に長期的に生着していることが明らかになっています。ヒト血管内皮細胞および間葉系ストローマ細胞を播種したスキャフォールドでは、ヒト血管内皮細胞がスキャフォールド内での血管形成に関与していることが示されており、その結果、マウスとヒトのキメラ血管系が構築されています。骨組織の形成は2光子顕微鏡で可視化でき、また、骨髄の内骨膜組織に酷似した内骨膜組織内のヒト化血管系における空腔形成も確認できます。

さらに、リコンビナントヒト骨形成タンパク質2担持スキャフォールドにおいて、スキャフォールド内の組織形態は脂肪組織を伴う成熟骨髄に類似しており、ヒト間葉系ストローマ細胞が脂肪組織の形成にも寄与していることが示唆されます。このビデオを視聴することで、すべてのバイオエンジニアリングおよび主要なマウススキャフォールドについて十分な理解を深めることができるはずです。常に無菌環境を維持し、スキャフォールドの取り扱いには細心の注意を払ってください。

組織のヒト・マウス・キメラなどの、本手法に関連する制限事項に留意してください。イメージング後のサンプルは、スキャホールドを消化して生細胞を回収できるため、さらなる研究に使用できることを覚えておいてください。