ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

この手順の全体的な目標は、ヌクレオソーム密度解析用のネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリを生成することです。この手法は、細胞集団のエピゲノムの特徴を単一ヌクレオソームレベルで明らかにしたり、不均一なクロマチンシグネチャーをそれらの連続要素に分解したりするなど、エピジェネティクスの疑問に答えることができます。この手法の主な利点は、オープンクロマチン領域への優先アクセスのMNase特性を利用して、MNaseアクセシビリティとヒストン修飾を組み合わせた測定を生成することです。

一般的に、この方法を初めて使用する人は、最適なMNase消化を得ることができないため、苦労します。このプロトコルは、テキストプロトコルに記載されているように、細胞調製から開始します。初日には、各細胞ペレットを摂氏37度の水浴で10秒間解凍します。

次に、細胞を氷に移します。各細胞ペレットに、氷冷したone-X溶解バッファーとone-X PICを直ちに加え、最終濃度を20マイクロリットルあたり10,000細胞にします。ピペッティングで上下に動かして10回

氷上で作業し、得られたライセートのウェルあたり20マイクロリットルを96ウェルプレートに分注します。プレートをプラスチックシールで覆い、氷上で20分間インキュベートします。プレートにMNaseのラベルを付け、ウェルをテンプレートキーに記録します。

20分間の溶解が完了する直前に、MNase one酵素をMNase one希釈バッファーで最終濃度20単位/マイクロリットルまで希釈し、氷上に保ちます。氷上で作業し、テキストプロトコルで説明されているように、MNase one digestion master mixを調製します。次に、サンプルの各列ごとに20マイクロリットルのマスターミックスと5マイクロリットルの追加容量を96ウェルリザーバープレートに分注します。

ライセートのインキュベーションが終了したら、MNase消化プレートを氷から取り出します。マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルの各列に20マイクロリットルのMNnase 1つの分解マスターミックスを加え、ピペッティングで10回上下して混合します。行間のヒントを変更します。

次に、プレートを室温で正確に5分間インキュベートします。5分後に反応を停止するには、マルチチャンネルピペットを使用して、サンプルの各列に6マイクロリットルの250マイクロモルEDTAを追加し、数回上下に混合します。行間でヒントを変更してください。

EDTA添加後、ピペットの設定を20マイクロリットルに切り替え、以前と同様に10回混合して、消化反応が完全に停止するようにします。最後に、MNase消化サンプルの各列に6マイクロリットルの10X溶解バッファーを加え、ピペッティングで10回上下してよく混合します。プレートをプラスチックシールで覆い、氷上で15分間インキュベートします。

抗体ビーズ複合体プレートとプレクリアプレートを、テキストプロトコールに記載されているように調製します。200倍Gで10秒間遠心分離することにより、両方のプレートをクイックスピンし、次に、抗体ビーズ複合体プレートをプレートマグネットに置き、溶液が透明になるまで15秒待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。

次に、プレートをプレートマグネットから取り外し、氷の上に保ちます。プレクリア反応プレートをプレートマグネットに置き、ビーズが分離して溶液が透明になるまで15秒待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを使用して、上清を氷上に保持された抗体ビーズ複合体プレートの対応するウェルに慎重に移します。

ピペッティングで15回上下させて、各ウェルを穏やかに混合します。プレートをアルミニウムプレートカバーでしっかりと密封し、回転するプラットフォーム上で摂氏4度で一晩インキュベートします。インキュベーション後、プレートのIP Reactionを再ラベルします。

2日目は、ヒーティングミキサーを摂氏65度に設定し、氷の上に低塩ウォッシュバッファーと高塩ウォッシュバッファーを準備します。IP反応プレートを200倍Gで10秒間クイックスピンし、IP反応プレートをプレート磁石に置き、溶液が透明になるまで15秒待ちます。マルチチャンネルピペットを使用して、ビーズを乱さずに、上清を慎重に取り除き、廃棄します。

プレートをプレートマグネットから外し、氷の上に置きます。IP反応プレートの各サンプル列に、150マイクロリットルの氷冷低塩洗浄バッファーを加え、10回ゆっくりと上下に混合してビーズを完全に再懸濁します。IP反応プレートをプレートマグネットに戻し、前回と同様に上清を取り除きます。

次に、プレートを氷の上に戻し、洗浄手順を合計2回繰り返します。氷上で作業し、150マイクロリットルの高塩洗浄バッファーをIP反応プレートの各サンプル列に加えます。ピペッティングを10回上下させてサンプルをゆっくりと混合し、ビーズを完全に再懸濁します。

前回と同様に上清を除去した後、IP反応プレートを氷の上に置き、その横に新しい96ウェルプレートを予冷します。IP反応プレートの各サンプル列に、150マイクロリットルの高塩洗浄バッファーを加え、ピペッティングで上下させてビーズを完全に再懸濁してゆっくりと10回混合します。再懸濁後、サンプルの各列を、事前に冷却した新しい96ウェルプレートの対応する列に移します。

古いプレートを捨てます。新しいIP反応プレートをプレートマグネットに置き、前回と同様に上清を捨てます。プレートは室温に保ちます。

IP反応プレートの各サンプル列に、30マイクロリットルのChIP溶出バッファーを加え、ピペッティングで10回上下してゆっくりと混合します。気泡の発生防止にご注意ください。プレートをPCRカバーでシールし、摂氏65度の加熱ミキサーで1,350RPMの混合速度で1時間半インキュベー

1時間半のインキュベーション後、IP反応プレートをGの200倍で4°Cで1分間スピンダウンします。次に、IP反応プレートをプレート磁石に置き、溶液が透明になるのを待ちます。マルチチャンネルピペットを使用して、ビーズを乱さずに、20マイクロリットルの上清を新しい96ウェルプレートに慎重に移し、列ごとに新しいチップを使用します。

プレートにIP Reactionをラベル付けし、室温に保ちます。タンパク質消化に進み、続いてテキストプロトコルに記載されているようにライブラリを構築します。ここに示されているのは、ライブラリ生成前の最適なMNase消化クロマチン、消化不足クロマチン、および過剰消化されたクロマチンの代表的な結果です。

最適に消化されたプロファイルは、単一のヌクレオソームフラグメントサイズによって支配されますが、高次ヌクレオソームフラグメントの回収を可能にするために過剰に消化されません。クロマチンの消化が最適でないことは、IP材料から生成されたシーケンシングライブラリのプロファイルにも明らかです。qPCRによるライブラリの検証のために、インプットライブラリに対するIPライブラリのフォールドエンリッチメントを正と負のターゲットについて評価しました。

さらに、ゲノムブラウザで高qPCR評価フォールドエンリッチメントを評価したライブラリのアラインメントリードを検査すると、インプットライブラリと比較して視覚的に検出可能なエンリッチメントが明らかになるはずです。ヌクレオソーム密度のChIPシーケンシングが成功すると、MACS2で同定された濃縮ピーク内に、アラインメントされたリードのかなりの部分と相関性の高い反復が含まれます。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば2日で完了します。

このビデオを見れば、ヌクレオソーム密度解析用のネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリの作製方法について十分に理解できるはずです。この手順を試みる際には、クロマチンが最適に消化されていることを確認し、目的のエピトープと高い親和性を示し、他のエピトープとの交差反応性をほとんどまたはまったく示さない抗体のみを使用することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、MNaseアクセシビリティの計算モデリングを実行して、細胞集団内の不均一性によるエピジェネティックなシグネチャなどの質問に答えることができます。

この方法は、ヌクレオソームの位置と局所密度の組み合わせ効果、およびそれらのヒストンサブユニットの翻訳後修飾に関する洞察を提供し、ヒトやマウス、初代細胞、凍結組織などのあらゆるシステムに適用できます。