Name: ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: 学ぶネイティブChIP-seq法によるヌクレオソーム密度解析。MNase処理とヒストン修飾測定を組み合わせ、単一ヌクレオソームレベルでエピゲノム特徴を解明し、異質的クロマチンシグナチャを連続的要素に分解する。

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アダムローリーは健康の研究のカナダの協会からカナダ大学院奨学金によって支えられました。この作品はゲノム ブリティッシュ コロンビア州、カナダ研究所の健康研究 (機構 120589) カナダのエピジェネティクス、環境および健康研究コンソーシアム イニシアチブの一部としてからの助成金やテリー Fox 研究所プログラム サポートされています。プロジェクト助成金 #TFF-122869 取扱い、取扱いにテリー Fox 研究所新しい調査官賞 (グラント # 1039)

<ol><li>Simpson, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Positioning%3A+Occurrence%2C+Mechanisms%2C+and+Functional+Consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nucleic+Acid+Res.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Positioning: Occurrence, Mechanisms, and Functional Consequences.</a> Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 40, Issue C 143-184 (1991).</li>
<li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10458604">Twenty-five years of the nucleosome, fundmamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li>
<li>Schones, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+nucleosome+positioning+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of nucleosome positioning in the human genome.</a> Cell. 132 (5), 887-898 (2008).</li>
<li>Segal, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+code+for+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A genomic code for nucleosome positioning.</a> Nature. 442 (7104), 772-778 (2006).</li>
<li>Shiio, Y., Eisenman, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+sumoylation+is+associated+with+transcriptional+repression%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Histone sumoylation is associated with transcriptional repression.</a> PNAS. 100 (23), 13225-13230 (2003).</li>
<li>Li, L., Lorzadeh, A., Hirst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation%3A+An+emerging+vantage+point+for+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip.+Rev.+Syst.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation: An emerging vantage point for cancer biology.</a> Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 6 (1), 37-59 (2014).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+acetylation+mechanism+by+GCN5+histone+acetyltransferase%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Investigation of the acetylation mechanism by GCN5 histone acetyltransferase.</a> PLoS ONE. 7 (5), (2012).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+methylation+in+transcriptional+control%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Histone methylation in transcriptional control.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 12 (2), 198-209 (2002).</li>
<li>Brind'Amour, J., Liu, S., Hudson, M., Chen, C., Karimi, M. M., Lorincz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultra-low-input+native+ChIP-seq+protocol+for+genome-wide+profiling+of+rare+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">An ultra-low-input native ChIP-seq protocol for genome-wide profiling of rare cell populations.</a> Nat. Commun. 6, 6033(2015).</li>
<li>Lorzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleosome+Density+ChIP-Seq+Identifies+Distinct+Chromatin+Modification+Signatures+Associated+with+MNase+Accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Nucleosome Density ChIP-Seq Identifies Distinct Chromatin Modification Signatures Associated with MNase Accessibility.</a> Cell Rep. 17 (8), 2112-2124 (2016).</li>
<li>Noll, M., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Action+of+micrococcal+nuclease+on+chromatin+and+the+location+of+histone+H1%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1.</a> J. Mol. Biol. 109 (3), 393-404 (1977).</li>
<li>Skene, P. J., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+generating+high-resolution+maps+of+genome+wide+protein+binding%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A simple method for generating high-resolution maps of genome wide protein binding.</a> eLife. 4, 09225(2015).</li>
<li>Brogaard, K., Xi, L., Wang, J. -P., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+map+of+nucleosome+positions+in+yeast+at+base-pair+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A map of nucleosome positions in yeast at base-pair resolution.</a> Nature. , (2012).</li>
<li>Cui, K., Zhao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+approaches+to+determining+nucleosome+occupancy+in+metazoans+using+MNase-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide approaches to determining nucleosome occupancy in metazoans using MNase-Seq.</a> Methods Mol. Biol. 833, 413-419 (2012).</li>
<li>Mieczkowski, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MNase+titration+reveals+differences+between+nucleosome+occupancy+and+chromatin+accessibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">MNase titration reveals differences between nucleosome occupancy and chromatin accessibility.</a> Nat. Commun. 7, 11485(2016).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+Specific+Cell+Population+by+Fluorescence+Activated+Cell+Sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22JOVE%22%5BJournal%5D)">Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS).</a> JOVE. (41), (2010).</li>
<li>Rohland, N., Reich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cost-effective%2C+high-throughput+DNA+sequencing+libraries+for+multiplexed+target+capture%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Cost-effective, high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture.</a> Genome Res. 22 (5), 939-946 (2012).</li>
<li>Zheng, Y., Josefowicz, S. Z., Kas, A., Chu, T. T., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+Foxp3+target+genes+in+developing+and+mature+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of Foxp3 target genes in developing and mature regulatory T cells.</a> Nature. 445 (7130), 936-940 (2007).</li>
<li>Krishnakumar, R., Gamble, M. J., Frizzell, K. M., Berrocal, J. G., Kininis, M., Kraus, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+Binding+of+PARP-1+and+Histone+H1+at+Promoters+Specifies+Transcriptional+Outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reciprocal Binding of PARP-1 and Histone H1 at Promoters Specifies Transcriptional Outcomes.</a> Science. 319 (5864), 819-821 (2008).</li>
<li>Mendenhall, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus-specific+editing+of+histone+modifications+at+endogenous+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Locus-specific editing of histone modifications at endogenous enhancers.</a> Nat. Biotechnol. 31 (12), 1133-1136 (2013).</li>
<li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li>
<li>Reference Epigenome Standards - IHEC. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/">http://ihec-epigenomes.org/research/reference-epigenome-standards/</a> (2017).</li>
<li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Combinations+of+Lineage-Determining+Transcription+Factors+Prime+cis-Regulatory+Elements+Required+for+Macrophage+and+B+Cell+Identities%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Simple Combinations of Lineage-Determining Transcription Factors Prime cis-Regulatory Elements Required for Macrophage and B Cell Identities.</a> Mol. Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li>
<li>Feng, J., Liu, T., Qin, B., Zhang, Y., Liu, X. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+ChIP-seq+enrichment+using+MACS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Identifying ChIP-seq enrichment using MACS.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1728-1740 (2012).</li>
<li>Fraley, C., Raftery, A. E. <a target="_blank" href="https://www.stat.washington.edu/raftery/Research/PDF/fraley1999.pdf">MCLUST: Software for Model-Based Cluster Analysis.</a> J. Classif. 16 (2), 297-306 (1999).</li>
</ol>

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

クロマチンの修飾とヌクレオソームの転写調節における配置の組合せの性質を考えると、これらの機能の同時測定を可能にするメソッドは、エピジェネティック制御に新たな洞察を提供する可能性が高いです。ここで示される ndChIP seq プロトコルは、ヒストン修飾とまれな一次電池9,10ヌクレオソーム密度の同時尋問をできるように最適化ネイティブ チップ seq プロトコルです。ndChIP seq クロマチンの酵素の消化力を利用して、ペアエンド大量並列シーケンスとガウス混合分布モデルに結合された場合、単一ヌクレオソーム レベル調査のヒストンの修正をできるようにと、集団内の不均一性によるエピゲノム プロファイルのデコンボリューション。このプロトコルを使用して、境界、ChromHMM10,24によって定義されている特定のクロマチン状態に関連付けられているを読むペアエンドによって決まります、免疫沈澱フラグメント サイズの独自のディストリビューションを以前報告しています。
NdChIP seq ライブラリの品質は、抗体の特異性と感度、最適な MNase 消化条件の chromatin の品質など複数の要因に依存します。使用される抗体の特異性は、成功 ndChIP seq ライブラリの生産に重要です。理想的な抗体は、他のエピトープを持つ小さな交差反応と関心のエピトープに対して高い親和性を示しています。好みの抗体の高い親和性と磁気ビーズを選択することも重要です。
MNase 消化はこのプロトコルで重要かつ時間と濃度感受性反応です。したがって、複数のサンプルを処理するときは、各反応が時間の同量の培養です重要です (手順 2.2 参照)。Chromatin の品質は、低信号対雑音比の最適 MNase 消化プロファイルとライブラリの結果 ndChIP シーケンス断片化クロマチン リードの結果が大きく影響する別の要因です。低次のサンプルは、細胞の生存率やホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織はこのプロトコルの推奨されませんようクロマチンの低下します。
クロマチン抽出の間に写真の付加を低減 (すなわち、ランダム) クロマチンの断片化と保持の整合性ヒストンの尾を望ましくないです。そのため、PIC を使用する換散バッファーおよび免疫沈降バッファーの直前に追加する必要があります。実行可能なセルを選択し、フローサイトメトリー、を介して選択するセル間細胞は細胞数の推定値の精度と細胞の生存率を向上する低流量で並べ替えられます。換散バッファーに直接セルを並べ替えを避けます。シース バッファーは換散バッファーを希釈して MNase に細胞膜の有効透過を防ぐことができます。細胞または有機体の種類に応じて MNase の滴定は最適な消化を取得する必要があります。
哺乳動物細胞 ndChIP seq 広いマークおよび入力のため狭いマークおよび 1 億対読み取り (5000 万フラグメント) のため 5000 万対読み取り (2500 万フラグメント) の最小のシーケンスの深さが必要です。ガウス混合分布アルゴリズムは、この勧告の大幅下深度化されているライブラリには最適な実行されません。ndChIP seq ないモノラルまたはディ ヌクレオソームの支配のプロモーターにモノラルとディ ヌクレオソーム フラグメントの長さの配分値の間少し分離とプロモーターにより分類されます。したがって、これらのプロモーターは、その後の分析で削除する必要があります。予測分布の信頼性を向上し、MNase 消化と図書館建設の技術的な変動を識別する生物の複製を生成できます。
ネイティブ チップ seq プロトコルの以前のイテレーションとは異なり ndChIP seq はヌクレオソーム密度を統合するフラグメント サイズのポスト免疫沈降法を用いたクロマチン構造とヒストンの修正の組合せの効果を調査するための手段を提供します。MNase アクセシビリティ、ヒストン変更の測定によって決定されます。NdChIP seq の初代培養細胞や組織への応用はエピジェネティック制御の統合的な性質に新しい洞察力を提供し、集団内での不均一性によるエピジェネティックな署名の識別を許可します。

真核生物のゲノムは、146 の塩基対の DNA1,2に囲まれた 4 つのヒストン蛋白質 (例えばH2A、H2B、H3、および H4) の 2 つのコピーを含むヌクレオソーム構造を繰り返しを介してクロマチンにパッケージされています。クロマチン改造複合体遺伝子プロモーターの境界内のヌクレオソームの位置を制御し、dna の転写因子、RNA ポリメラーゼ機械3、アクセシビリティを変更することにより遺伝子発現の調節に関与 4。
ヌクレオソームのヒストンのアミノ ターミナル尾はアセチル化、メチル化、リン酸化、ユビキチン化、sumo 化、化、および特定のアミノ酸5の水酸化反応を含む種々 の共有結合修飾を受ける,6,7,8します。 位置とこれらの変更の度転写7のアクティベーションを許可する分子複合体のクロマチン構造と制御アクセスに影響を与えるクロマチンの状態を決定します。ヌクレオソームの密度とヒストン修正9の同時測定を可能にするネイティブ チップ アプローチを開発私たちことを考えると両方のヌクレオソーム密度とヒストン修飾は、遺伝子転写のローカル制御の役割を果たす、 10。
ネイティブ チップ seq エンドヌクレアーゼ球菌ヌクレアーゼの本来の状態、核11,12ヌクレオソームの13の配置をマップに活用されているプロパティ内でそのままクロマチンを消化する (MNase) の活用します。,14,15. ヌクレオソーム密度チップ seq (ndChIP-seq) MNase アクセシビリティを組み合わせてヒストン修正10測定を生成するクロマチン領域を開く MNase の優先的なアクセスのプロパティを活用します。ndChIP seq は珍しい初代培養細胞、組織および培養細胞におけるヒストン修飾のプロファイリングに最適です。ここでは、フラグメント サイズのポスト免疫沈降、ペアエンドに境界を読むによって決定を統合する前述の分析フレーム作業10に適したシーケンス データセットの生成を可能にする詳細なプロトコルを提案します。同時にヒストン修正測定 MNase アクセシビリティを調査します。以前は、このプロトコルの 10,000 の主な臍帯血への応用派生 CD34+細胞とヒト胚性幹細胞はこれらの内のクロマチン構造とヒストン修飾関係のユニークな携帯型10 明らかに.ヌクレオソーム アクセシビリティとヒストン修飾を同時に測定する能力を与え、ndChIP seq は単一ヌクレオソーム レベルで細胞のエピゲノム機能を明らかにし、解決に異種の署名が可能です、構成要素。NdChIP seq によって異種の細胞集団の探査の例は H3K4me3、アクティブなマークと H3K27me3、抑圧的なマークの両方が現在10二価プロモーターの調査です。

<table><tbody><tr><td>1M Tris-HCl &ndash;pH 7.5</td><td>Thermo Scientific</td><td>15567-027</td><td></td></tr><tr><td>1M Tris-HCl &ndash;pH 8</td><td>Thermo Scientific</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>0.5M EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma</td><td>1001385276</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>1001412354</td><td></td></tr> デ<tr><td>オキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma</td><td>1001437582</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Thermo Scientific</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウム-重炭酸塩</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>V-bottom 96 ウェルプレート (AB 1400)</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1400-L</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P2 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P10 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F144802</td><td></td></tr><tr><td>Gilson P20 pipetman</td><td>Mandel</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>ギルソンP100ピペトマン</td><td>マン</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>ギルソンP200ピペトマン</td><td>マンマンデル</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>ギルソンP1000ピペットマン</td><td>マン</td><td>F123603</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0247S</td><td></td></tr><tr><td>サーモミキサーC (ヒーティングブロックミキサー)</td><td>エッペンドルフ</td><td>5382000023</td><td></td></tr><tr><td>マルチ 12チャンネル ピペット P20</td><td>レイニン</td><td>17013803</td><td></td></tr><tr><td>マルチ 12チャンネル ピペット P200</td><td>レイニン</td><td>17013805</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml LoBindチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>0.5 ml LoBindチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22431005</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックプレートカバー</td><td>エッジ バイオ</td><td>48461</td><td></td></tr><tr><td>PCR カバー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MSD-1001</td><td></td></tr><tr><td>アルミニウムプレートカバー</td><td>バイオ・ラッド</td><td>MSF-1001</td><td></td></tr><tr><td>溶出バッファー (EB バッファー)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>1M DTT</td><td>Sigma</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフ 5810R 遠心分離機&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>22625004</td><td></td></tr><tr><td>超純水</td><td>Thermo Scientific</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>プロテインG ダイナビーズ</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>プロテインA ダイナビーズ</td><td>Thermo Scientific</td><td>10001D</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤 カクテル</td><td>Calbiochem</td><td>539134</td><td></td></tr><tr><td>回転プラットフォーム</td><td>マンデル</td><td>1b109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>プレートマグネット</td><td>Alpaqua</td><td>2523</td><td></td></tr><tr><td>ドーム型 12 キャップストリップ</td><td>Bio Rad</td><td>TCS1201</td><td></td></tr><tr><td>Buffer G2</td><td>Qiagen</td><td>1014636</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Qiagen</td><td>19155</td><td></td></tr><tr><td>チューブマグネット (DynaMag-2)</td><td>Thermo Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>チューブマグネット (DynaMag-2)</td><td>LabCore</td><td>730-006</td><td></td></tr><tr><td>V字型プラスチックリザーバー</td><td>マンデル</td><td>S0100A</td><td></td></tr><tr><td>ボルテックス</td><td>マンデル</td><td>C1801</td><td></td></tr><tr><td>ミニフージ</td><td>メトラー・トレド</td><td>XS2035</td><td></td></tr><tr><td>分析スケール</td><td>マンデル</td><td>LB109-12052010</td><td></td></tr><tr><td>クイックライゲーション反応バッファー、5X</td><td>NEB</td><td>B6058S</td><td></td></tr><tr><td>DNAポリメラーゼI、ラージ(クレノウ)フラグメント</td><td>NEB</td><td>M0210S</td><td></td></tr><tr><td>Klenow Fragment (3'-5' exo)</td><td>NEB</td><td>M0212S</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0203S</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>NEB</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>デオキシヌクレオチド溶液混合物、10mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>dATP 溶液 10mM</td><td>NEB</td><td>N0440S</td><td></td></tr><tr><td>Quick T4 DNA Ligase</td><td>NEB</td><td>M0202T</td><td></td></tr><tr><td>アデノシン 5'-三リン酸 (ATP)、25mM</td><td>NEB</td><td>P0756S</td><td></td></tr><tr><td>DNA ポリメラーゼ</td><td>Thermo Scientific</td><td>F549L</td><td></td></tr><tr><td>NEBuffer 2 NEB</td><td></td><td>B7002S</td><td></td></tr><tr><td>ハンクの緩衝塩溶液</td><td>Thermo Scientific</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>A3160702</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝液生理食塩水&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me3</td><td>細胞シグナル伝達</td><td>9751S</td><td></td></tr><tr><td>H3K4me1</td><td>Diagenode</td><td>C15410037</td><td></td></tr><tr><td>H3K27me3</td><td>Diagenode</td><td>pAb-069-050</td><td></td></tr><tr><td>H3K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>H3K9me3</td><td>Diagenode</td><td>C15410056</td><td></td></tr><tr><td>SeraMag&nbsp; 超常磁性ビーズ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

(チップ seq) 実験的プロトコルとガウス混合分布解析手法 (ヌクレオソーム密度チップ seq; ndChIP seq) の生成を可能にする互換性のある配列変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降を提案します。ヒストン修飾ゲノムとミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティの結合された測定。ヌクレオソームの位置と局所密度と翻訳後修飾ヒストン亜単位のローカル転写状態を規制するコンサートで行動します。NdChIP シーケンスによって生成されたヒストン修飾とヌクレオソーム アクセシビリティの組合せ測定は、これらの機能の同時の尋問のためことができます。NdChIP seq 方法論ベースのチップ seq プロトコルを架橋にアクセスできない一次電池の小さな数字に適用されます。NdChIP seq 一緒に取られて、珍しい主細胞内 RNA 転写を制御する共有メカニズムへの新しい洞察を取得するローカル ヌクレオソーム密度とヒストン修飾の組み合わせでの測定が可能。 にします。

提案するミクロコッカスヌクレアーゼ (MNase) のアクセシビリティを統合ヌクレオソーム密度チップ seq 解析フレームワークに適したシーケンス データセットの生成 (チップ seq) 方法論をシーケンス変更されたネイティブ クロマチン免疫沈降ヒストン修正測定。

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

本手順の全体的な目的は、ヌクレオソーム密度の解析に向けたネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリを作製することです。この手法は、細胞集団におけるエピゲノムの特徴を単一ヌクレオソームレベルで明らかにすることや、不均一なクロマチンシグネチャーを連続的な要素へと分解することなど、エピジェネティクスにおける疑問を解決することができます。この技術の主な利点は、オープンクロマチン領域へ優先的にアクセスするというMNaseの特性を利用することで、MNaseアクセシビリティとヒストン修飾を組み合わせた測定値を生成できる点にあります。一般的に、この手法に不慣れな方は、MNase消化を最適化できず苦労することがあります。本プロトコールは、テキストプロトコールに記載されている細胞調製から開始してください。1日目は、各細胞ペレットを37 °Cのウォーターバスで10秒間解凍します。次に、細胞を氷上に移します。各細胞ペレットに、氷冷した1×溶解バッファーおよび1×PICを、最終濃度が20 µLあたり10,000細胞となるように直ちに追加します。気泡が入らないように注意しながら、ピペッティングで10回混ぜ合わせます。氷上で作業を行い、得られた溶解物を96ウェルプレートの各ウェルに20 µLずつ分注します。プレートをプラスチックシールで覆い、氷上で20分間インキュベートします。プレートにMNaseとラベルを付け、ウェルの情報をテンプレートキーに記録します。20分間の溶解が完了する直前に、MNase one酵素をMNase one希釈バッファーで最終濃度20 units/µLに希釈し、氷上で保持します。氷上にて、テキストプロトコルに記載されている通りにMNase one消化マスターミックスを調製します。その後、サンプルの各行につき20 µLのマスターミックスを、さらに5 µLの余剰分を加えて、96ウェルリザーバープレートに分注します。ライセートのインキュベーション終了後、MNase消化プレートを氷から取り出します。マルチチャンネルピペットを用いて、各列のサンプルに20 µLのMNase 1回消化マスターミックスを加え、ピペッティングを10回繰り返して混ぜ合わせます。列が変わるごとにチップを交換してください。その後、プレートを室温で正確に5分間インキュベートします。5分後に反応を停止させるため、マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルの列に250 µM EDTAを6 µLずつ加え、数回ピペッティングして混合します。列ごとに必ずチップを交換してください。EDTAを添加した後、ピペットの設定を20 µLに変更し、前述と同様に10回混ぜて消化反応を完全に停止させます。最後に、MNase消化サンプルの一列ごとに6 µLの10X lysis bufferを加え、ピペッティングで10回上下に混ぜて十分に混合します。プレートをプラスチックシールで密閉し、氷上で15分間インキュベートします。本文のプロトコルに従って、抗体ビーズ複合体プレートとプレクリアリングプレートを準備します。両方のプレートを200 ×gで10秒間遠心分離し、クイックスピンさせます。次に、抗体ビーズ複合体プレートをプレートマグネットに置き、溶液が透明になるまで15秒間待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを用いて上清を慎重に除去し、廃棄します。次に、プレートをプレートマグネットから取り出し、氷上に保持します。プレクリアリング反応プレートをプレートマグネットに置き、ビーズが分離し溶液が透明になるまで15秒間待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを用いて上清を慎重に、氷上に保持した抗体ビーズ複合体プレートの対応するウェルへと転移させます。ピペッティングにより15回上下に混ぜ、各ウェルを穏やかに混合します。プレートをアルミニウムプレートカバーでしっかりと密封し、回転台上において4°Cで一晩インキュベートします。インキュベート後、プレートに「IP Reaction」とラベルを貼り直します。2日目は、ヒーティングミキサーを65°Cに設定し、低塩濃度洗浄バッファーと高塩濃度洗浄バッファーを氷上で準備します。IP反応プレートを200×gで10秒間クイックスピンします。IP反応プレートをプレートマグネットに設置し、溶液が透明になるまで15秒間待ちます。マルチチャンネルピペットを使用し、ビーズを乱さないように注意しながら、上清を慎重に除去して廃棄します。プレートをプレートマグネットから取り外し、氷上に置きます。IP反応プレートの各サンプルの行に、氷冷した低塩洗浄バッファーを150 µL加え、ビーズを完全に再懸濁させるため、ゆっくりとピペッティングを10回行います。IP反応プレートを再びプレートマグネットに戻し、先ほどと同様に上清を除去します。次に、プレートを再び氷上に置き、洗浄ステップを繰り返し、計2回洗浄します。氷上で、IP反応プレートの各サンプル列に高塩濃度洗浄バッファーを150 µLずつ加えます。ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜ合わせ、ビーズを完全に再懸濁させます。前述と同様に上清を除去した後、IP反応プレートを氷上に置き、その横に新しい96ウェルプレートを用意してあらかじめ冷やしておきます。IP反応プレートの各行のサンプルに、150 µLの高塩濃度洗浄バッファーを加え、ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜてビーズを完全に再懸濁させます。再懸濁後、各行のサンプルを、あらかじめ冷やしておいた新しい96ウェルプレートの対応する行に転移させます。古いプレートを廃棄します。新しいIP反応プレートをプレートマグネットの上に置き、前回と同様に上清を廃棄します。プレートは室温で保持してください。IP反応プレートの各サンプル行に、ChIP溶出バッファーを30 microliters加え、ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜ合わせます。気泡が形成されないように注意してください。プレートをPCRカバーで密封し、加熱ミキサーを用いて65 degrees Celsiusで1 1/2時間、攪拌速度1, 350 RPMでインキュベートします。1時間30分のインキュベーション後、IP反応プレートを4°Cで200 ×g、1分間遠心分離します。次に、IP反応プレートをプレートマグネット上に配置し、溶液が透明になるまで待ちます。マルチチャンネルピペットを使用し、ビーズを乱さないように注意しながら、上清20 µLを新しい96ウェルプレートに転送します。この際、行ごとに新しいチップを使用してください。プレートに「IP Reaction」とラベルを貼り、室温で保持します。テキストプロトコルに従い、タンパク質消化を行い、続いてライブラリ作製に進みます。ここでは、ライブラリ作成前の、最適、消化不足、および過剰消化なMNase消化クロマチンの代表的な結果を示します。最適に消化されたプロファイルでは、単一ヌクレオソームの断片サイズが支配的であり、かつ過剰消化されていないため、高次ヌクレオソーム断片の回収が可能です。クロマチンの消化が不十分な場合は、IP試料から作製されたシーケンシングライブラリーのプロファイルにもそれが現れます。qPCRによるライブラリーのバリデーションでは、ポジティブおよびネガティブターゲットについて、インプットライブラリーに対するIPライブラリーの濃縮倍率を評価しました。さらに、qPCRで評価したフォールド濃縮度が高いライブラリーのアライメント済みリードをゲノムブラウザで確認し、インプットライブラリーと比較して視覚的に検出可能な濃縮が認められるかを確認する必要があります。成功したヌクレオソーム密度ChIP-seqライブラリーでは、レプリケート間で高い相関が認められ、アライメント済みリードの大部分がMACS2で同定された濃縮ピーク内に存在します。この手法に習熟し、適切に実施すれば、2日間で完了させることができます。このビデオを視聴することで、ヌクレオソーム密度解析のためのネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリの作製方法について深く理解することができます。本手順を実施する際は、クロマチンが最適に消化されていることを確認し、目的のエピトープに対して高い親和性を持ち、他のエピトープとの交差反応性がほとんどないか、全くない抗体のみを使用することが重要です。本手順の後、MNaseアクセシビリティの計算モデリングを行うことで、細胞集団内の不均一性に起因するエピジェネティックシグネチャーなどの疑問を解消することが可能です。本手法は、ヌクレオソームの位置と局所的な密度の組み合わせによる影響、およびヒストンサブユニットの翻訳後修飾に関する知見を提供し、ヒトやマウス、初代細胞、凍結組織などのあらゆる系に適用することが可能です。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

このビデオでは、タンパク質結合クロマチンフラグメントの選択的免疫沈降を介して、オリゴデンドロサイト前駆細胞のゲノムDNAの特定の領域上のタンパク質結合部位を特定するクロマチン免疫沈降技術を示しています。この方法は、遺伝子調節に関与する転写因子を含む、いくつかの調節タンパク質の相互作用を研究するのに役立ちます。...

ゲノムDNA上の標的タンパク質結合部位を同定するためのクロマチン免疫沈降法

クロマチン免疫沈降法と超高スループットシーケンシング（チップ-SEQ）の組み合わせは、所定の組織または細胞株におけるタンパク質-DNA相互作用を特定し、マッピングすることができます。概説としては、例えば、転写因子TCF7L2の経験を使用して、その後の配列決定のための高品質のChIPテンプレートを生成する方法である。...

ハイスループットシーケンシングのための高品質クロマチン免疫沈降DNAテンプレート（チップ-SEQ）の生成

ネイティブ組み合わせると高解像度質量分析とクロマチン免疫沈降を架橋することにより、ChroPアプローチはヒストン修飾、変異体及び機能的に異なるクロマチンドメインで相乗非histonicタンパク質の複合プロテオミクスアーキテクチャを分析することができます。...

ChroPアプローチは、クロマチンの遺伝子座特異的プロテオームの風景を分析するために、チップと質量分析を組み合わせ

&gt;jove_contentvivoタンパク質-DNA相互作用をマッピングする方法は、ゲノム研究のあらゆる側面において重要になりつつありますが、それらは手間がかかり、費用がかかり、時間がかかります。ここでは、限られた量の細胞とin...

万HeLa細胞でエピジェネティックプロファイルを生成するためのChIP-seqの実験の自動化

ここでは、クロマチン免疫沈降 (チップ) と低豊富な鶏胚サンプルからグローバル エピゲノム プロファイルを生成するチップ seq...

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

ヒストン 3 リジン 79 ジメチル化 (H3K79me2) - 内にあるヒストン マークのクロマチン免疫沈降 (チップ) の胎生期および生後の脳組織から神経前駆細胞の培養を特定し効果的かつ再現可能な手法を提案しますヒストン 3...

3 ヒストンのリジン 79 ジメチル化マークのクロマチン免疫沈降に続いて神経前駆細胞の分離と培養

ここでは、最適化された高スループット チップ シーケンス プロトコルと冷凍腫瘍組織や細胞からゲノム...

腫瘍組織に高スループット チップ シーケンスを用いたクロマチン状態のゲノム マッピングの統合プラットフォーム

ここの褐色脂肪組織 (BAT) マウスから分離した高スループット DNA シーケンス (チップ seq) 続いて効率的なクロマチン免疫沈降 (チップ)...

マウスの褐色脂肪組織のクロマチン免疫沈降

本論文では、ChIP液体ハンドラプラットフォームを用いた特定のヒストン修飾(H3K27ac)に関連するDNA領域の半自動マイクロスケールのChIP-Seqプロトコルについて説明し、続いてタグメンテーションを用いたライブラリ調製について述べている。この手順には、品質と量の目的に対する制御評価が含まれており、他のヒストン修飾または転写因子に採用することができます。...

大規模エピジェネティック研究のための半自動化されたChIP-Seq法

タンパク質関連新生DNAの濃縮およびシーケンス(eSPAN)は、2本の複製DNA鎖におけるクロマチン関連タンパク質の相対的な存在比を検出するために開発され、クロマチン複製およびその結合過程に関する分子的知見を明らかにしました。このプロトコルは、酵母およびマウスの胚性幹細胞(ES)細胞におけるeSPAN手技を記述しています。...

タンパク質関連新生DNA法の濃縮およびシーケンスによる複製DNA鎖におけるタンパク質の鎖特異的解析

私たちは、ユークロマチン、ヘテロクロマチン、RNAP...

高密度核環境下のクロマチン調査のための多ラベル単分子局在顕微鏡プロトコル

学ぶネイティブChIP-seq法によるヌクレオソーム密度解析。MNase処理とヒストン修飾測定を組み合わせ、単一ヌクレオソームレベルでエピゲノム特徴を解明し、異質的クロマチンシグナチャを連続的要素に分解する。

ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

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