ネイティブのクロマチン免疫沈降のヌクレオソーム密度解析ライブラリをシーケンスの生成

本手順の全体的な目的は、ヌクレオソーム密度の解析に向けたネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリを作製することです。この手法は、細胞集団におけるエピゲノムの特徴を単一ヌクレオソームレベルで明らかにすることや、不均一なクロマチンシグネチャーを連続的な要素へと分解することなど、エピジェネティクスにおける疑問を解決することができます。この技術の主な利点は、オープンクロマチン領域へ優先的にアクセスするというMNaseの特性を利用することで、MNaseアクセシビリティとヒストン修飾を組み合わせた測定値を生成できる点にあります。

一般的に、この手法に不慣れな方は、MNase消化を最適化できず苦労することがあります。本プロトコールは、テキストプロトコールに記載されている細胞調製から開始してください。1日目は、各細胞ペレットを37 °Cのウォーターバスで10秒間解凍します。

次に、細胞を氷上に移します。各細胞ペレットに、氷冷した1×溶解バッファーおよび1×PICを、最終濃度が20 µLあたり10,000細胞となるように直ちに追加します。気泡が入らないように注意しながら、ピペッティングで10回混ぜ合わせます。

氷上で作業を行い、得られた溶解物を96ウェルプレートの各ウェルに20 µLずつ分注します。プレートをプラスチックシールで覆い、氷上で20分間インキュベートします。プレートにMNaseとラベルを付け、ウェルの情報をテンプレートキーに記録します。

20分間の溶解が完了する直前に、MNase one酵素をMNase one希釈バッファーで最終濃度20 units/µLに希釈し、氷上で保持します。氷上にて、テキストプロトコルに記載されている通りにMNase one消化マスターミックスを調製します。その後、サンプルの各行につき20 µLのマスターミックスを、さらに5 µLの余剰分を加えて、96ウェルリザーバープレートに分注します。

ライセートのインキュベーション終了後、MNase消化プレートを氷から取り出します。マルチチャンネルピペットを用いて、各列のサンプルに20 µLのMNase 1回消化マスターミックスを加え、ピペッティングを10回繰り返して混ぜ合わせます。列が変わるごとにチップを交換してください。

その後、プレートを室温で正確に5分間インキュベートします。5分後に反応を停止させるため、マルチチャンネルピペットを使用して、各サンプルの列に250 µM EDTAを6 µLずつ加え、数回ピペッティングして混合します。列ごとに必ずチップを交換してください。

EDTAを添加した後、ピペットの設定を20 µLに変更し、前述と同様に10回混ぜて消化反応を完全に停止させます。最後に、MNase消化サンプルの一列ごとに6 µLの10X lysis bufferを加え、ピペッティングで10回上下に混ぜて十分に混合します。プレートをプラスチックシールで密閉し、氷上で15分間インキュベートします。

本文のプロトコルに従って、抗体ビーズ複合体プレートとプレクリアリングプレートを準備します。両方のプレートを200 ×gで10秒間遠心分離し、クイックスピンさせます。次に、抗体ビーズ複合体プレートをプレートマグネットに置き、溶液が透明になるまで15秒間待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを用いて上清を慎重に除去し、廃棄します。

次に、プレートをプレートマグネットから取り出し、氷上に保持します。プレクリアリング反応プレートをプレートマグネットに置き、ビーズが分離し溶液が透明になるまで15秒間待ちます。ビーズを乱さないように、ピペットを用いて上清を慎重に、氷上に保持した抗体ビーズ複合体プレートの対応するウェルへと転移させます。

ピペッティングにより15回上下に混ぜ、各ウェルを穏やかに混合します。プレートをアルミニウムプレートカバーでしっかりと密封し、回転台上において4°Cで一晩インキュベートします。インキュベート後、プレートに「IP Reaction」とラベルを貼り直します。

2日目は、ヒーティングミキサーを65°Cに設定し、低塩濃度洗浄バッファーと高塩濃度洗浄バッファーを氷上で準備します。IP反応プレートを200×gで10秒間クイックスピンします。IP反応プレートをプレートマグネットに設置し、溶液が透明になるまで15秒間待ちます。マルチチャンネルピペットを使用し、ビーズを乱さないように注意しながら、上清を慎重に除去して廃棄します。

プレートをプレートマグネットから取り外し、氷上に置きます。IP反応プレートの各サンプルの行に、氷冷した低塩洗浄バッファーを150 µL加え、ビーズを完全に再懸濁させるため、ゆっくりとピペッティングを10回行います。IP反応プレートを再びプレートマグネットに戻し、先ほどと同様に上清を除去します。

次に、プレートを再び氷上に置き、洗浄ステップを繰り返し、計2回洗浄します。氷上で、IP反応プレートの各サンプル列に高塩濃度洗浄バッファーを150 µLずつ加えます。ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜ合わせ、ビーズを完全に再懸濁させます。

前述と同様に上清を除去した後、IP反応プレートを氷上に置き、その横に新しい96ウェルプレートを用意してあらかじめ冷やしておきます。IP反応プレートの各行のサンプルに、150 µLの高塩濃度洗浄バッファーを加え、ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜてビーズを完全に再懸濁させます。再懸濁後、各行のサンプルを、あらかじめ冷やしておいた新しい96ウェルプレートの対応する行に転移させます。

古いプレートを廃棄します。新しいIP反応プレートをプレートマグネットの上に置き、前回と同様に上清を廃棄します。プレートは室温で保持してください。

IP反応プレートの各サンプル行に、ChIP溶出バッファーを30 microliters加え、ピペッティングで10回ゆっくりと混ぜ合わせます。気泡が形成されないように注意してください。プレートをPCRカバーで密封し、加熱ミキサーを用いて65 degrees Celsiusで1 1/2時間、攪拌速度1, 350 RPMでインキュベートします。

1時間30分のインキュベーション後、IP反応プレートを4°Cで200 ×g、1分間遠心分離します。次に、IP反応プレートをプレートマグネット上に配置し、溶液が透明になるまで待ちます。マルチチャンネルピペットを使用し、ビーズを乱さないように注意しながら、上清20 µLを新しい96ウェルプレートに転送します。この際、行ごとに新しいチップを使用してください。

プレートに「IP Reaction」とラベルを貼り、室温で保持します。テキストプロトコルに従い、タンパク質消化を行い、続いてライブラリ作製に進みます。ここでは、ライブラリ作成前の、最適、消化不足、および過剰消化なMNase消化クロマチンの代表的な結果を示します。

最適に消化されたプロファイルでは、単一ヌクレオソームの断片サイズが支配的であり、かつ過剰消化されていないため、高次ヌクレオソーム断片の回収が可能です。クロマチンの消化が不十分な場合は、IP試料から作製されたシーケンシングライブラリーのプロファイルにもそれが現れます。qPCRによるライブラリーのバリデーションでは、ポジティブおよびネガティブターゲットについて、インプットライブラリーに対するIPライブラリーの濃縮倍率を評価しました。

さらに、qPCRで評価したフォールド濃縮度が高いライブラリーのアライメント済みリードをゲノムブラウザで確認し、インプットライブラリーと比較して視覚的に検出可能な濃縮が認められるかを確認する必要があります。成功したヌクレオソーム密度ChIP-seqライブラリーでは、レプリケート間で高い相関が認められ、アライメント済みリードの大部分がMACS2で同定された濃縮ピーク内に存在します。この手法に習熟し、適切に実施すれば、2日間で完了させることができます。

このビデオを視聴することで、ヌクレオソーム密度解析のためのネイティブクロマチン免疫沈降シーケンシングライブラリの作製方法について深く理解することができます。本手順を実施する際は、クロマチンが最適に消化されていることを確認し、目的のエピトープに対して高い親和性を持ち、他のエピトープとの交差反応性がほとんどないか、全くない抗体のみを使用することが重要です。本手順の後、MNaseアクセシビリティの計算モデリングを行うことで、細胞集団内の不均一性に起因するエピジェネティックシグネチャーなどの疑問を解消することが可能です。

本手法は、ヌクレオソームの位置と局所的な密度の組み合わせによる影響、およびヒストンサブユニットの翻訳後修飾に関する知見を提供し、ヒトやマウス、初代細胞、凍結組織などのあらゆる系に適用することが可能です。