G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

細胞周期のフェーズに基づいてフローソートされた細胞からDNAのディープシーケンシングを行う本手順の全体的な目的は、細胞周期の極めて後期に複製されるゲノム領域を特定することです。この手法は、ゲノムのどの領域がDNA複製の完了に困難を抱えており、その結果、ゲノム再編成に対して特に脆弱であるかなど、DNA複製分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、実験的な観点からは非常にシンプルであるにもかかわらず、ゲノム複製のダイナミクスに関する驚くほど豊富な知見を得られることです。

まず、8 mLのYEPDを含む15 mL試験管に、目的の酵母細胞を接種します。合成培地または富栄養培地のいずれでも構いません。細胞を少なくとも12時間、一晩培養し、対数増殖期の分布にある状態で回収します。

翌日、培養細胞の密度が1 mLあたり500万から1,500万個に達したら、細胞を遠心分離して回収し、1.5 mLの70% ethanolで再懸濁します。次に、懸濁液を1.6 mLマイクロ遠心チューブに移し、室温で1時間、または氷上で少なくとも3時間インキュベートします。接種後、細胞を遠心分離して回収し、1 mLのクエン酸ナトリウムで再懸濁します。

最後に、細胞を短時間、2回ソニケーションします。その後、遠心分離サイクルを繰り返し、RNaseを含む1 mLのクエン酸ナトリウム溶液で酵母を再懸濁します。ヒートブロックまたはウォーターバスを用いて、50 °Cで1時間、または37 °Cで一晩、RNaseを酵母と反応させます。

RNase処理後、混合物に50 µLのプロテイナーゼK溶液を加え、50 °Cで1時間反応させます。次に、細胞をスピンダウンし、1 mLのクエン酸ナトリウムに再懸濁します。その後、細胞を遠心分離し、真空吸引で上清を除去します。

次に、薄暗い場所で、緑色の核酸染色剤を含むクエン酸ナトリウム 1 mL に細胞を再懸濁します。その後、酵母を室温の暗所で 1 時間インキュベートします。次に、530 nm の放出データを用いて、セルソーターで細胞数をカウントします。

DNA量に基づき、細胞周期の各相（G1期、S期、初期G2期、後期G2期）に分取します。各相から少なくとも160万個の半数体細胞を回収してください。細胞分取後速やかに、20分間遠心分離を行います。上清を吸引除去し、ペレットを-20 °Cで凍結保存してください。

本手順において最も重要なステップは、細胞回収後、遅くともソート後1時間以内に速やかに細胞を遠心分離することであることが分かりました。この抽出は、酵母ゲノムDNA抽出キットに基づいています。まず、120 µLのダイジェスチョンバッファーと5 µLの酵母溶解酵素を添加することから始めてください。

次に、ボルテックスミキサーを用いて細胞を反応混合液に混ぜ合わせ、37 °Cで40〜60分間インキュベートします。続いて、ライシスバッファーを120 µL加え、高速で10〜20秒間ボルテックスします。その後、クロロホルムを250 µL加え、チューブの内容物を1分間十分に混合します。

次に、チューブを最大速度で2分間遠心分離します。その後、上清をDNA結合カラムに移します。1分間の最大速度での遠心分離サイクルを用いて、上清をカラムに通します。

カラム膜上のDNAを洗浄するため、カラムを新しい回収チューブに移し、300 µLのDNA洗浄バッファーを加えます。その後、最大速度で1分間、再度遠心分離を行います。この洗浄工程をもう一度繰り返します。

DNAを回収するために、スピンカラムを新しいチューブに移します。60 µLの水を加え、1〜3分間待ちます。その後、カラムを最大速度で10秒間遠心分離し、溶出されたDNAを含む水を単離します。

次に、1:200の濃度で試薬を含むdsDNA high-sensitivity bufferを5〜195 µL加えます。その後、サンプルの蛍光強度を測定して収量を算出します。通常、10〜50 ngのDNAが回収されます。

次に、超音波処理を用いてDNAを250から350 base pairsの断片に断片化します。その後、標準的なキットを用いてDNAライブラリを調製し、少なくとも10 millionの50 base pairsシングルエンドリードを用いてシーケンシングを行います。この手順は、出芽酵母における後期複製部位を同定するために用いられました。

正常細胞を、脱アセチル化酵素であるSir2を欠損した細胞と比較しました。生データには、主にTYエレメントの存在に起因する大きなスパイクが含まれていました。これらのスパイクは、各サンプルのリード深度の中央値の2.5倍でリード深度をキャップすることで除去しました。

その後、スパイクを除去したデータを20 kbのスライディングウィンドウで平滑化しました。最後に、データを正規化し、G1期のレベルに対する比率としてプロットしました。完全に複製されていない細胞は0.5に、完全に複製された細胞は1に表示されます。この第7染色体のデータでは、Sir2変異体における既知の後期複製領域の証拠が認められました。

このビデオを視聴することで、ゲノムの中でDNA複製が最後に完了する領域、すなわち、複製遅延に伴うDNA断片化やその他の問題に対して特に脆弱な領域を特定する方法について、十分に理解していただけるはずです。