G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

細胞周期の段階に従ってフローソーティングされた細胞からDNAをディープシーケンシングするこの手順の全体的な目標は、細胞周期の非常に遅い時期に複製するゲノムの領域を特定することです。この方法は、ゲノムのどの領域がDNA複製を完了するのに困難であり、したがってゲノム再配列に対して特に脆弱であるかなど、DNA複製分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、実験的な観点からは非常に単純であるにもかかわらず、ゲノム複製のダイナミクスについて驚くほど豊富な視点を提供できることです。

まず、8ミリリットルのYEPDが入った15ミリリットルの試験管に、目的の酵母細胞を接種します。合成培地またはリッチ培地が許容されます。細胞を一晩で少なくとも12時間培養し、実際の対数期の分布中に細胞を収集します。

翌日、培養物が1ミリリットルあたり500万から1500万個の細胞の密度になったら、細胞をスピンダウンし、1.5ミリリットルの70%エタノールに再懸濁します。次に、懸濁液を1.6ミリリットルのマイクロフュージチューブに移し、細胞を室温で1時間または氷上で少なくとも3時間インキュベートします。接種後、細胞をスピンダウンし、1ミリリットルのクエン酸ナトリウムに再懸濁します。

最後に、細胞を2回簡単に超音波処理します。次に、遠心分離サイクルを繰り返し、RNaseを含むクエン酸ナトリウム1ミリリットルに酵母を再懸濁します。RNaseを50°Cの酵母と1時間または37°Cで一晩、ヒートブロックまたはウォーターバスで

RNase処理後、50マイクロリットルのプロテイナーゼK溶液を混合物に加え、摂氏50度で1時間反応を続けます。次に、細胞をスピンダウンし、細胞を1ミリリットルのクエン酸ナトリウムに再懸濁します。次に、細胞を遠心分離し、真空を使用して上清を吸引します。

次に、薄暗い場所で、緑色の核酸染色で細胞を1ミリリットルのクエン酸ナトリウムに再懸濁します。次に、室温で1時間、暗闇の中で酵母でインキュベートします。続行するには、530ナノメートルの発光データを使用してセルソーターを使用して細胞をカウントします。

DNA含有量に応じて、細胞周期期、G1 S、初期G2、および後期G2に選別します。各フェーズから少なくとも160万個の一倍体細胞を収集します。細胞を選別した直後に、20分間スピンダウンします。上清を吸引し、ペレットを摂氏マイナス20度で凍結して保管します。

この手順で最も重要なステップは、細胞を採取した後、すぐにスピンダウンすることであり、選別後、最も長い時間はかかることがわかりました。この抽出は、酵母ゲノムDNA抽出キットに基づいています。まず、120マイクロリットルの消化緩衝液と5マイクロリットルの酵母溶解酵素を追加します。

次に、ボルテックスを使用して細胞を反応混合物にブレンドし、混合物を摂氏37度で40〜60分間インキュベートします。次に、120マイクロリットルの溶解バッファーを添加し、混合物を高速で10〜20秒間ボルテックスします。次に、250マイクロリットルのクロロホルムを加え、1分間チューブの内容物を完全に混合します。

次に、チューブを最大速度で2分間スピンダウンします。次に、上清をDNA結合カラムに移します。上清をカラム内で1分間の最大速度遠心分離サイクルで遠心します。

カラムメンブレンでDNAを洗浄するには、カラムを新しいコレクションチューブに移し、300マイクロリットルのDNA洗浄バッファーを適用します。その後、遠心分離を最高速度で1分間繰り返します。この洗浄手順をもう一度繰り返します。

DNAを採取するには、スピンカラムを新しいチューブに移します。60マイクロリットルの水を加えて、1〜3分待ちます。次に、カラムを最高速度で 10 秒間遠心分離し、溶出された DNA を含む水を分離します。

次に、5〜195マイクロリットルの二本鎖DNA高感度緩衝液含有試薬を1〜200濃度で追加します。次に、サンプルの蛍光を測定して収率を計算します。10〜50ナノグラムのDNAを収集することを期待してください。

次に、超音波処理を使用して、DNAを250〜350塩基対の断片に分割します。次に、標準キットを使用してDNAライブラリを調製し、少なくとも1,000万の50塩基対のシングルエンドリードを使用してシーケンシングします。記載された手順を用いて、出芽酵母における後期複製部位を同定した。

正常細胞を、脱アセチル化酵素タンパク質であるSir2を欠損した細胞と比較しました。生データには、主にTY要素の存在による大きなスパイクが含まれていました。これらのスパイクは、各サンプルの赤の深さの中央値の 2.5 倍に読み取り深度を制限することで除去しました。

次に、スパイク除去されたデータを 20 kb のスライディングウィンドウで平滑化しました。最後に、データを正規化し、G1のレベルに対する比率としてプロットしました。完全に複製されていないセルは 0.5 に表示され、完全に複製されたセルは 1 に表示されます。この7番染色体からのデータでは、Sir2変異体に既知の後期複製領域の証拠がありました。

このビデオを見れば、DNA複製を最後に完了し、したがってDNA切断や遅延複製に関連するその他の問題に対して特に脆弱なゲノムの領域を特定する方法について十分に理解できるはずです。