Name: G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: 学ぶG2-seq法によるゲノム後半複製領域の同定。フローサイトメトリーと深層シーケンスを組み合わせ、酵母細胞から細胞周期に応じたDNAを抽出・解析し、DNA複製動態とゲノム不安定性の理解を深めます。

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この仕事は a. b. に NIH GM117446 助成金によって支えられました。

1 のセルの準備の流れ Cytometry の並べ替え
<ol><li>文化一晩成長後 5 x 106 1.5 mL あたり7セルを 10 倍の密度に達するような YEPD 液 8 mL を含む 15 mL の試験管を接種する (注 1 の議論」を参照)。</li>
	<li>酵母 (1,400 × g、室温、4 ° C で) 5 分 15 mL スクリュー キャップ遠心管でスピンダウン、1.5 mL 70% エタノールで 1.6 の mL および microfuge の管に転送この座っている部屋の温度で 1 時間または氷 (少なくとも 3 h をさせる細胞を再懸濁します4 ° C で不明確に保存されることができます) (議論点 (2) を参照)。</li>
	<li>1 分の microfuge (14,000 x g、4 ° C) で酵母をスピン、1 分の 1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2、スピン ・ ダウン (14,000 x g, 4 ° C) で再懸濁します、上清を吸引、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 で再懸濁します、0.25 mg/mL 50 ° c または一晩熱ブロックまたは水浴で 37 ° C で 1 h RNAse ソリューションを含みます。</li>
	<li>50 μ L, プロテイナーゼ K 溶液 (20 mg/mL 10 mM Tris pH 7.5、2 mM CaCl2、ボリューム グリセリン 50% の重量で再停止される) を追加し、50 ° C で 1 時間インキュベート</li>
	<li>Cells (14,000 × g, 4 ° C) スピンダウン、1 mL 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 細胞を再懸濁します、スピン ・ ダウン (14,000 x g、4 ° C)、真空上清を吸引、クエン酸ナトリウム 50 mM で再停止される 1 mL 1 μ M 緑核酸ひずみで再懸濁します、pH 7.2 室温で 1 時間暗闇の中で孵化、2 x 2 の超音波 s 各 (出力 2 ワット)。</li>
</ol>2. 細胞選別
<ol><li>図 1のように各細胞周期の段階から、少なくとも 160 万単相細胞を収集フェーズ G1、S、"初期 G2 は、"、「後半 G2」は、DNA 内容に従ってセルを並べ替えるセルの並べ替えアイコンを使用して、(議論点 (3) を参照)。</li>
	<li>Microfuge の管にセルを転送およびスピン ・ ダウンで 4 ° C、および microfuge 14,000 x g で 20 分間細胞と真空上清を吸引 (ペレットは、無期限に-20 ° C で凍結保存ことができます; ポイント (4) の議論を参照)。</li>
</ol>3. DNA の抽出とシーケンシング ライブラリの準備
注: 次の手順に基づいて酵母ゲノム DNA 抽出キットで「議定書 I」(材料の表を参照してください).
<ol><li>酵母細胞壁溶解酵素細胞壁や酵母細胞壁溶解酵素の 5 μ L を消化、ボルテックス、によって再懸濁します、37 ° C、40-60 分インキュベートすることができる独自のバッファー「消化バッファー」の 120 μ L を追加します。</li>
	<li>「換散バッファー、」洗剤と渦 10-20 s ハードを含む独自のバッファーの 120 μ L を追加します。</li>
	<li>250 μ L のクロロホルムを追加 - 徹底的にミックス 1 分。</li>
	<li>2 分間および microfuge の最高速度で回転します。</li>
	<li>DNA 結合列と、および microfuge の最高速度で 1 分間遠心上清をロードします。</li>
	<li>「DNA 洗浄バッファーの「エタノール、および、および microfuge の最大の速度で 1 分間遠心を含む独自バッファー 300 μ l を追加します。流れを破棄 DNA 洗浄バッファーの 300 μ L を追加し、洗浄プロセスを繰り返します。</li>
	<li>新鮮なおよび microfuge の管にスピン列を転送、水 (ない TE) の 60 μ L を追加 - 1-3 分待って、10 の遠心分離機、DNA を溶出します。</li>
	<li>された dsDNA 高感度バッファーで希釈 1: 200 と、指定された規格の 10 μ L を用いた校正、蛍光光度計で測定蛍光 dsDNA 高感度試薬の 195 μ L DNA の 5 μ L を追加することによって濃度を測定します。10 と 50 ng の DNA 収量の間期待します。</li>
	<li>超音波 (ピーク事件電源 450、デューティー比 30%、サイクル/バースト 200、治療時間 60 秒、水レベル 6) 250-350 bp の断片を DNA を破壊します。</li>
	<li>DNA サンプル調製キットを使用してライブラリを準備し、高速モードで DNA シーケンス楽器でシーケンス処理するそれ (少なくとも 1000 万 50 bp シングル エンド ヒット) (議論注 (5) を参照)。</li>
</ol>4. データ ・ レプリケーションの世代シーケンスの解析のプロファイルします。
<ol><li>Gsnap12を用いた出芽酵母sacCer3 ゲノム シーケンスを配置 (ディスカッション注 (6) を参照)。</li>
	<li>塩基あたりを読む Bedtools の"genomeCoverageBed"ソフトウェア13を使用して深さを決定します。</li>
	<li>存在する場合、読み取りの深さで artefactual スパイクを削除 (ディスカッション注 (7) を参照)。</li>
	<li>滑らかな読む深さ r"runMean"関数を使用してウィンドウをスライド 20 kb で中央分離帯を用いた染色体によってパッケージ"caTools"(ディスカッション注 (8) 参照)。</li>
	<li>プロットは完全にレプリケートされた読み取りの深さ (ディスカッション注 (9) を参照) の割合として S 段階、初期 G2 後半 G2 で深さを読みます。</li>
</ol>

<ol><li>Fragkos, M., Ganier, O., Coulombe, P., Mechali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+replication+origin+activation+in+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA replication origin activation in space and time.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16, 360-374 (2015).</li>
<li>Santocanale, C., Diffley, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Mec1-+and+Rad53-dependent+checkpoint+controls+late-firing+origins+of+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A Mec1- and Rad53-dependent checkpoint controls late-firing origins of DNA replication.</a> Nature. 395, 615-618 (1998).</li>
<li>Brewer, B. J., Fangman, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+replication+fork+barrier+at+the+3%27+end+of+yeast+ribosomal+RNA+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A replication fork barrier at the 3' end of yeast ribosomal RNA genes.</a> Cell. 55, 637-643 (1988).</li>
<li>Raghuraman, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+dynamics+of+the+yeast+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Replication dynamics of the yeast genome.</a> Science. 294, 115-121 (2001).</li>
<li>Muller, C. A., Nieduszynski, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+replication+timing+reveals+global+and+local+regulation+of+replication+origin+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Conservation of replication timing reveals global and local regulation of replication origin activity.</a> Genome Res. 22, 1953-1962 (2012).</li>
<li>Koren, A., Soifer, I., Barkai, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRC1-dependent+scaling+of+the+budding+yeast+DNA+replication+timing+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">MRC1-dependent scaling of the budding yeast DNA replication timing program.</a> Genome Res. 20, 781-790 (2010).</li>
<li>Lang, G. I., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+rates+across+budding+yeast+chromosome+VI+are+correlated+with+replication+timing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol+Evol%22%5BJournal%5D)">Mutation rates across budding yeast chromosome VI are correlated with replication timing.</a> Genome Biol Evol. 3, 799-811 (2011).</li>
<li>Durkin, S. G., Glover, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+fragile+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromosome fragile sites.</a> Annu Rev Genet. 41, 169-192 (2007).</li>
<li>Dillon, L. W., Burrow, A. A., Wang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+instability+at+chromosomal+fragile+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">DNA instability at chromosomal fragile sites in cancer.</a> Curr Genomics. 11, 326-337 (2010).</li>
<li>Widrow, R. J., Hansen, R. S., Kawame, H., Gartler, S. M., Laird, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Very+late+DNA+replication+in+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Very late DNA replication in the human cell cycle.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 11246-11250 (1998).</li>
<li>Foss, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIR2+suppresses+replication+gaps+and+genome+instability+by+balancing+replication+between+repetitive+and+unique+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">SIR2 suppresses replication gaps and genome instability by balancing replication between repetitive and unique sequences.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 552-557 (2017).</li>
<li>Wu, T. D., Reeder, J., Lawrence, M., Becker, G., Brauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GMAP+and+GSNAP+for+Genomic+Sequence+Alignment%3A+Enhancements+to+Speed%2C+Accuracy%2C+and+Functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">GMAP and GSNAP for Genomic Sequence Alignment: Enhancements to Speed, Accuracy, and Functionality.</a> Methods Mol Biol. 1418, 283-334 (2016).</li>
<li>Quinlan, A. R., Hall, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BEDTools%3A+a+flexible+suite+of+utilities+for+comparing+genomic+features%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features.</a> Bioinformatics. 26, 841-842 (2010).</li>
<li>Langmead, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aligning+short+sequencing+reads+with+Bowtie%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Aligning short sequencing reads with Bowtie.</a> Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 11, Unit 11 17(2010).</li>
<li>Li, H., Durbin, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+accurate+short+read+alignment+with+Burrows-Wheeler+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform.</a> Bioinformatics. 25, 1754-1760 (2009).</li>
<li>Kellis, M., Birren, B. W., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proof+and+evolutionary+analysis+of+ancient+genome+duplication+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Proof and evolutionary analysis of ancient genome duplication in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 428, 617-624 (2004).</li>
<li>Goodwin, S., McPherson, J. D., McCombie, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+of+age%3A+ten+years+of+next-generation+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies.</a> Nat Rev Genet. 17, 333-351 (2016).</li>
</ol>

著者が明らかに何もありません。

一方、この手法は堅牢で、比較的まっすぐな前方、特に注意は次に捧げられるべき。
(1) 以来、文化は接種後必要な密度だけ 4 h に到達した後収穫される場合細胞周期の分布に相違が顕在ログ段階に達する前に少なくとも 12 時間の文化が成長するを推奨します。我々 の仮定では比較的安定した平衡に達した細胞周期の分布はより飽和させた文化は、最近では新鮮な媒体に転送されているときにまだ流動的で配布よりも「本物の」ログ位相分布を表します。
(2) 固定する前にセルを回転の代わりに細胞は、酵母の培養にエタノールの最終濃度が 70%、100% エタノールを直接追加しても修正できます。細胞は合成またはリッチ (YEPD) 培地で育てることができます。
(3) 細胞周期の段階は、530 nm の発光領域の関数としてプロットのセル番号で並べ替えの可視化します。我々 は S と G2 と G1 と S の間の変曲点が S 段階の輪郭を描くため堅牢なランドマークとなる、我々 は初期と後期の G2 を...

真核生物ゲノムのレプリケーションは、レプリケーションでは、レプリケーションからフォーク (Fragkosら2015年1文献) 両方の方向で進むの起源と呼ばれる複数の個別サイトで開始されます。起源が異なるタイミングと、焼成の効率とレプリケーション元のアクティビティを監視し、この変化の原因を解明するいくつかの手法が開発されました。個々 の原点の活動は、単一座礁させた DNA2、アクティブな起源の周りのフォームのレベルから推論できるまたは特定の複製中間体3を監視する第 2 ゲルの電気泳動を使用して、どちらで検出できます。放射性プローブ。起源は、前者の特定の知られていたシーケンスに制限され、これらの手法の両方はより簡単に出芽酵母よりも哺乳類セルので適用されます。マイクロ アレイの出現により、世界的に焼成の起源を評価することが可能になりました。これは最初重い同位体と DNA の分類、中含まれている軽い同位体に G1 ブロックから細胞を放出、重・軽ハイブリッド DNA ゲノム4の形成を監視によって行われました。高スループット シーケンスの導入許可同様ゲノムは、高価な同位体ラベリングの要件なしで活動を起源の監視します。細胞は、DNA の内容によると流れの cytometer のディープ シーケンスを受ける DNA ソートされます。シーケンスのカバレッジが S 期にわたって 2 倍に 1 x から進むにつれて、ので相対的なレプリケーションのタイミングは G1 あるいは G25,6S 期細胞の読み取りの深さを比較することによって評価できます。特に酵母に適用これらのテクニックは、dna 塩基配列、クロマチン構造と DNA 複製タンパク質起源タイミングと効率の規制方法のより深い理解につながった。
細胞増殖の中に遺伝情報の忠実な伝達には、DNA の複製の起源で行われるの唯一の成功の開始だけでなく、複製フォークが満たすために発生するレプリケーションが正常に完了が必要です。レプリケーションの開始のようなレプリケーションの完了のタイミングは、残りの細胞周期の後半でもレプリケートされていない特定の領域にゲノム間で異なります。このような領域は特にアクティブな複製の起源から遠いかシーケンスやクロマチン構造の DNA ポリメラーゼを阻害する場合があります。後期地域をレプリケートする染色体の破損および高い突然変異率と関連付けられ、がんと老化7,8,9に関与している壊れやすいサイトとして自分自身のマニフェストことができます。しかし、ゲノムの安定性の維持に DNA の複製が正しく完了の重要性にもかかわらずこれが起こる場所と方法の理解が遅れてレプリケーション開始。後半レプリケーションは病気に関連付けられている個々 の遺伝子の中で、たとえば、qPCR10場所の解明と後半のレプリケーションを欠けている原因の基礎となるグローバル研究検討されています。ここで我々 は"G2 seq"高スループット シーケンスのゲノム複製の完了に光を当てるとフローサイトメトリーを組み合わせる我々 として酵母の11を参照手法について述べる。軽微な変更は、このプロトコルは DNA 量順の流れをすることができます任意のセルに合わせることができます。

<table><tbody><tr><td>YeaStarゲノムDNAキット</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-323</td><td></td></tr><tr><td>1 &micro;M SYTOX Green</td><td>ThermoFisher</td><td>57020</td><td>50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2</td></tr><tr><td>50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNase 溶液 (0.25 mg/mL)</td> <td>Sigma</td><td>R6513</td><td>0.25 mg/mL RNaseA 50 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.2 に再懸濁し、RNase 溶液を初回使用前に 10 分間煮沸し、その後は -20°C で保存します。</td></tr><tr><td>プロテイナーゼK溶液(20 mg / mL)</td><td>ThermoFisher / Invitrogen</td><td>25530-015</td>を<td>10 mM Tris、pH 7.5、2 mM CaCl2、50%グリセロールに再懸濁し、-20°Cで保存します。C</td></tr><tr><td>Model 50 Sonic Dismembrator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB50A220</td><td></td></tr><tr><td>BD Biosciences FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td>644832</td><td></td></tr><tr><td>Zymo-spin III カラム</td><td>Zymo Research</td><td>C1005</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td><td>ThermoFisher</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 3.0 Fluorometer</td><td>ThermoFisher</td><td>Q33216</td><td></td></tr><tr><td>CovarisモデルLE220焦点超音波装置</td><td>Covaris</td><td>500219</td><td></td></tr><tr><td>イルミナTruSeq DNA LTサンプル調製キット</td><td>イルミナ</td><td>15026486</td><td></td></tr><tr><td>イルミナHiSeq 2500機器</td><td>イルミナ</td><td>SY&ndash;401&ndash;2501</td><td></td></tr><tr><td>gsnap アライメントソフトウェア</td><td>オープンソースソフトウェア / Genentech</td><td></td><td>http://research-pub.gene.com/gmap</td></tr></tbody></table>

g2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

G2-seq: A High Throughput Sequencing-based Technique for Identifying Late Replicating Regions of the Genome

多数の技術は、細胞周期の S 期で DNA 複製の進行状況を追跡する開発されています。これらの技術のほとんどは、場所の解明とゲノム重複ではなく、その完了の開始時期に向かって指示されています。しかし、我々 はこれらの地域の染色体の破損や、突然変異レベルが上昇に苦しむので、レプリケーションを完了する最後はゲノムの領域を理解し、彼らは病気と高齢化に関連付けられていることが重要です。ここで我々 は我々 が代わりにレプリケーションを完了する最後のゲノムのこれらの領域を識別するために複製開始反応を監視するために使用されている技術を拡張する方法について説明します。このアプローチは、フローサイトメトリーと高スループット シーケンスの組み合わせに基づいています。このレポートは、この手法の酵母への応用に焦点を当て、アプローチは DNA の内容によると流れの cytometer で並べ替えることができます任意のセルで使用できます。

我々 は出芽酵母における後半の複製サイトを識別するために上記の手順を使用しています。人工染色体の知られている遅い複製領域を使用してこの方法をテストを正確かつ信頼性の高い技術を証明しました。我々 の結果も示しているレプリケーションのタイムリーな完了の生物学的重要性染色体 7、我々 は G2 seq 結果に基づいて後期複製として識別、後期複製領域が失われたことを示すことによって約散布地域11同等より頻繁制御します。
G2 seq と結果の具体的な例を図 2に示します。私たちと仮定したが欠けている Sir2 と呼ばれる蛋白質脱アセチル化酵素を細胞で特に遅くレプリケートされたゲノムの領域でしょう。図 2 aは、(赤) (青) 野生型とsir2データ分析の進行を示しています。(上...

フローサイトメトリーとゲノムの後半の複製領域を識別する高スループット シーケンスを結合する手法について述べる。

G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

Numerous techniques have been developed to follow the progress of DNA replication through the S phase of the cell cycle. Most of these techniques have ...

細胞周期のフェーズに基づいてフローソートされた細胞からDNAのディープシーケンシングを行う本手順の全体的な目的は、細胞周期の極めて後期に複製されるゲノム領域を特定することです。この手法は、ゲノムのどの領域がDNA複製の完了に困難を抱えており、その結果、ゲノム再編成に対して特に脆弱であるかなど、DNA複製分野における重要な疑問への回答に寄与します。この技術の主な利点は、実験的な観点からは非常にシンプルであるにもかかわらず、ゲノム複製のダイナミクスに関する驚くほど豊富な知見を得られることです。まず、8 mLのYEPDを含む15 mL試験管に、目的の酵母細胞を接種します。合成培地または富栄養培地のいずれでも構いません。細胞を少なくとも12時間、一晩培養し、対数増殖期の分布にある状態で回収します。翌日、培養細胞の密度が1 mLあたり500万から1,500万個に達したら、細胞を遠心分離して回収し、1.5 mLの70% ethanolで再懸濁します。次に、懸濁液を1.6 mLマイクロ遠心チューブに移し、室温で1時間、または氷上で少なくとも3時間インキュベートします。接種後、細胞を遠心分離して回収し、1 mLのクエン酸ナトリウムで再懸濁します。最後に、細胞を短時間、2回ソニケーションします。その後、遠心分離サイクルを繰り返し、RNaseを含む1 mLのクエン酸ナトリウム溶液で酵母を再懸濁します。ヒートブロックまたはウォーターバスを用いて、50 °Cで1時間、または37 °Cで一晩、RNaseを酵母と反応させます。RNase処理後、混合物に50 µLのプロテイナーゼK溶液を加え、50 °Cで1時間反応させます。次に、細胞をスピンダウンし、1 mLのクエン酸ナトリウムに再懸濁します。その後、細胞を遠心分離し、真空吸引で上清を除去します。次に、薄暗い場所で、緑色の核酸染色剤を含むクエン酸ナトリウム 1 mL に細胞を再懸濁します。その後、酵母を室温の暗所で 1 時間インキュベートします。次に、530 nm の放出データを用いて、セルソーターで細胞数をカウントします。DNA量に基づき、細胞周期の各相（G1期、S期、初期G2期、後期G2期）に分取します。各相から少なくとも160万個の半数体細胞を回収してください。細胞分取後速やかに、20分間遠心分離を行います。上清を吸引除去し、ペレットを-20 °Cで凍結保存してください。本手順において最も重要なステップは、細胞回収後、遅くともソート後1時間以内に速やかに細胞を遠心分離することであることが分かりました。この抽出は、酵母ゲノムDNA抽出キットに基づいています。まず、120 µLのダイジェスチョンバッファーと5 µLの酵母溶解酵素を添加することから始めてください。次に、ボルテックスミキサーを用いて細胞を反応混合液に混ぜ合わせ、37 °Cで40〜60分間インキュベートします。続いて、ライシスバッファーを120 µL加え、高速で10〜20秒間ボルテックスします。その後、クロロホルムを250 µL加え、チューブの内容物を1分間十分に混合します。次に、チューブを最大速度で2分間遠心分離します。その後、上清をDNA結合カラムに移します。1分間の最大速度での遠心分離サイクルを用いて、上清をカラムに通します。カラム膜上のDNAを洗浄するため、カラムを新しい回収チューブに移し、300 µLのDNA洗浄バッファーを加えます。その後、最大速度で1分間、再度遠心分離を行います。この洗浄工程をもう一度繰り返します。DNAを回収するために、スピンカラムを新しいチューブに移します。60 µLの水を加え、1〜3分間待ちます。その後、カラムを最大速度で10秒間遠心分離し、溶出されたDNAを含む水を単離します。次に、1:200の濃度で試薬を含むdsDNA high-sensitivity bufferを5〜195 µL加えます。その後、サンプルの蛍光強度を測定して収量を算出します。通常、10〜50 ngのDNAが回収されます。次に、超音波処理を用いてDNAを250から350 base pairsの断片に断片化します。その後、標準的なキットを用いてDNAライブラリを調製し、少なくとも10 millionの50 base pairsシングルエンドリードを用いてシーケンシングを行います。この手順は、出芽酵母における後期複製部位を同定するために用いられました。正常細胞を、脱アセチル化酵素であるSir2を欠損した細胞と比較しました。生データには、主にTYエレメントの存在に起因する大きなスパイクが含まれていました。これらのスパイクは、各サンプルのリード深度の中央値の2.5倍でリード深度をキャップすることで除去しました。その後、スパイクを除去したデータを20 kbのスライディングウィンドウで平滑化しました。最後に、データを正規化し、G1期のレベルに対する比率としてプロットしました。完全に複製されていない細胞は0.5に、完全に複製された細胞は1に表示されます。この第7染色体のデータでは、Sir2変異体における既知の後期複製領域の証拠が認められました。このビデオを視聴することで、ゲノムの中でDNA複製が最後に完了する領域、すなわち、複製遅延に伴うDNA断片化やその他の問題に対して特に脆弱な領域を特定する方法について、十分に理解していただけるはずです。

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感染した細胞のゲノムDNAからレトロウイルス統合部位を増幅し、増幅されたウイルス-宿主ジャンクションを配列決定し、次にこれらの配列を参照ゲノムにマッピングするためのプロトコルを記述します。また、BEDToolsを使用して、さまざまなゲノムアノテーションに対する統合部位の分布を定量化する手法についても説明します。...

レトロウイルス統合サイトの増幅、次世代シーケンシング、およびゲノムDNAのマッピング

&gt;jove_content&lt;ここでは、細胞の単離からシーケンシング結果の基本解析まで、ゲノムワイドな哺乳類の複製タイミングをマッピングするための比較的迅速でシンプルなアプローチについて説明します。代表的な複製プログラムのゲノムマップは、プロトコルに従って提供されます。...

DNA含有量測定法による哺乳類の複製タイミングのゲノムワイドな決意

この原稿では、上流および下流のベクター - 宿主接合DNAを同時に解析できる双方向インテグレーションサイトアッセイの実験手順とソフトウェア解析について説明します。双方向PCR産物は、任意の下流の配列決定プラットフォームに使用することができる。得られたデータは、統合されたDNA標的の高スループット、定量的比較に有用である。...

双方向レトロウイルスの統合サイトPCRの方法論と定量的データ解析ワークフロー

ゲル seq の両方 DNA と RNA-seq 単純なハイドロゲル デバイスを用いた 100-1000 細胞からごくわずかな追加コストでライブラリを同時に準備することも可能。 にします。対ライブラリを生成する生物のプロトコルと同様に、デバイス作製のための詳細なアプローチを提案する.

ゲル-seq: DNA および RNA のゲルのマトリックスを使用しての同時配列ライブラリの準備の方法

遺伝子および調節配列の物理的な相互作用の同定が困難な染色体構造をキャプチャする方法によって促進されています。これは 4 C seq プロトコルを修正は PCR テンプレートが過大に増幅を最小限に抑えることによって PCR バイアスを軽減、追加制限の酵素のダイジェスト ステップを組み込むことによって読み取りの mappability...

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

ここでは、哺乳動物細胞由来のRNA:タンパク質(RNP)複合体の内因性RNA結合部位または「フットプリント」を濃縮するプロトコルを提示する。このアプローチは、RNPサブユニットの2つの免疫沈殿を伴い、したがって、並行してRNA免疫沈殿(RIPiT)と呼ばれています。...

ランデムにおけるRNA免疫沈殿によるRNAタンパク質複合体の足跡の同定、シーケンシング(RIPiT-Seq)

ここでは、2次元ゲル電気泳動を使用して、病原性の構造が取りやすいリピートによる複製進行を解析する手順について概説します。...

SV40ベースのヒトエピソーム内での構造性DNAリピートを介した複製の電気泳動解析

ハイスループット、自動化され、タバコプロトプラストの生産と変換方法について説明します。ロボットシステムは、非モデル作物に翻訳可能であるべきであるBY-2システムモデルにおける大規模並列遺伝子発現と発見を可能にします。...

ハイスループットプロトプラスト単離と変革のためのロボットプラットフォーム

学ぶG2-seq法によるゲノム後半複製領域の同定。フローサイトメトリーと深層シーケンスを組み合わせ、酵母細胞から細胞周期に応じたDNAを抽出・解析し、DNA複製動態とゲノム不安定性の理解を深めます。

G2-seq: 高スループットシーケンスベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

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G2-seq: 高スループット シーケンス ベースを識別する方法後半ゲノムの領域を複製します。

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