共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

この方法の全体的な目標は、共焦点顕微鏡を使用してマクロファージの細胞外トラップを視覚化および研究する方法を実証することです。この方法は、感染やその他の免疫刺激に対する反応など、炎症分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、好中球の細胞外トラップの研究に使用されてきた確立された方法の修正版であることです。

この手順を実演するのは、Roleen Sharmaです。テキストプロトコルに従って、気管支肺胞洗浄液(BAL)によってヒトおよびマウスから肺マクロファージを取得した後、トリパンブルーと血球計算盤を使用して、BAL溶液上で生存細胞数を実行します。500マイクロリットルの培養培地中の10〜5番目のマクロファージを1〜4回ピペットで24ウェルプレートのウェルのカバースリップにピペットで移動し、細胞を摂氏37度で一晩インキュベートして細胞が接着します。

培地を取り出し、PBSを使用して細胞を一度洗浄します。次に、2%パラホルムアルデヒド-過ヨウ素酸塩-リジン、またはPLP固定液を添加し、サンプルを10分間インキュベートします。PBSを使用して細胞を短時間洗浄した後、PBSに0.2%TWEEN 20を加え、細胞を20分間インキュベートします。

次に、細胞をブロックするために、PBSで希釈した5%BSAに10%チキン血清を加え、サンプルを室温で30分間インキュベートします。次に、ブロック溶液を1〜100濃度の一次および同位体制御抗体に置き換え、細胞を室温で1時間インキュベートします。インキュベーション後、PBSを使用して細胞を洗浄してから、対応する二次抗体を添加します。

その後、サンプルを室温で40分間インキュベートします。PBSで細胞を洗浄した後、DAPIベースの封入剤でサンプルをマウントし、共焦点顕微鏡でサンプルを可視化します。FFPEサンプルを抗原賦活化溶液で前処理するには、スライドを60°Cで60分間オーブン乾燥させます。

次に、スライドをキシレン溶液に30分間移し、次にサンプルを室温で70%エタノールに5分間移します。水道水でスライドをすすぎた後、耐熱ラップに包み、Tris-EDTAのpH9.0の圧力鍋に10分間入れて、より高い抗原賦活化を行います。サンプルを20分間冷却し、水道水に移します。

その後、ロッカーに5分間置きます。水道水の洗浄を繰り返してから、ロッカーのPBSでスライドを一度洗います。サンプルをブロックするには、10%チキン血清を5%BSA PBSに添加し、室温で30分間インキュベートします。

次に、マクロファージの細胞外トラップ(MET)を定義するには、1%BSA PBSに1〜100希釈の一次抗体を加え、スライドを摂氏4度で16時間インキュベートします。PBSを使用して、サンプルをロッカーで2回、それぞれ5分間洗浄します。対応する蛍光二次抗体を1%BSA PBSに添加し、スライドを室温で40分間インキュベートします。

PBS洗浄後、DAPI封入用剤を使用してクロマチンを染色し、サンプルをマウントします。倒立顕微鏡に取り付けられた共焦点レーザースキャニングヘッドを使用して、20X 0.1 NAの空気対物レンズと40X 1.0 NAのオイル対物レンズを使用して蛍光画像を撮影します。512 x 512 ピクセルの単一平面の画像を取得するには、[Line Sequential Leveling] ボタンをクリックします。

セクションごとに少なくとも 10 個の視野を取得し、分析と各結果のデータを取得します。微量遠心チューブで切片を染色するには、関連する一次抗体を200マイクロリットルの容量で添加し、サンプルを摂氏4度で16時間インキュベートします。切片をPBSで10分間3回洗浄した後、適切な二次抗体を添加し、サンプルを室温で1時間インキュベートします。

DAPIを使用して肺切片を溶液中で染色し、サンプルを20分間インキュベートしてから、PBSの顕微鏡スライドの切片にカバースリップを追加します。405ナノメートル、440ナノメートル、473ナノメートル、543ナノメートル、635ナノメートルのレーザーを搭載した40X 1.3 NA対物レンズを備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して、画像を撮影し、厚さ0.54ミクロンの3D Zスタックを最適なZセクショニングで記録します。最後に、テキストプロトコルに従って画像を分析します。

BALサンプル中のMETsの例を以下に示します。最初に検出可能な特徴は、この初期段階のMETに見られるように、細胞の端への核の動きであり、これはほぼ球形をしています。これに続いて、このより成熟したMETに見られるように、H3Citや顆粒状プロテアーゼなどの他の共発現メディエーターと細胞外クロマチンが続きます。

前段のMETが左上、後段のMETはこれより下が中央に向かっています。この図に肺組織METsが示されています。肺の構造を定義するために肺が液体で膨らむと、METは肺胞壁に押し付けられます。

METの形態は、組織がどの平面で切断されたかによっても異なります。肺組織サンプルに使用される標準切片の厚さは4〜5ミクロンです。組織切片が厚いほど、複数の画像を撮影でき、METsを3Dで見ることができます。

ここでは、マウスの肺組織を25〜35ミクロンの切片に切断した3D画像の一例を示します。この技術を習得すると、適切に実行されれば、2日間の染色とイメージングで行うことができます。この手順を試みるときは、洗濯に優しくすることを覚えておくことが重要です。

この手順に続いて、ザイモグラフィーなどの他の方法を実行して、プロテアーゼ発現などの追加の質問に答えることができます。開発後、この技術は炎症性マクロファージ応答の研究への道を開く可能性があります。このビデオを見れば、共焦点顕微鏡を使用してMETsを可視化する方法を十分に理解できるはずです。

PLPでの作業は危険な場合があり、この手順を実行するときは常に手袋の着用や目の保護具などの予防措置を講じる必要があることを忘れないでください。