有害な効果の低圧プラズマ滅菌を使用して住んでいる携帯顕微鏡枯草菌胞子の生存に調査

この一連の連続した方法の全体的な目標は、時間分解共焦点蛍光顕微鏡法と走査型電子顕微鏡を使用して、低圧プラズマ処理後に蘇生する枯草菌胞子のDNA修復における活力パラメータを視覚化および監視することです。私たちの方法は、微生物の不活化と滅菌の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。これは、枯草菌胞子などの生物学的指標に対する低圧プラズマ処理の有害な影響を分析するのに役立ちます。

私たちの技術の主な利点は、低圧プラズマ処理の有害な影響を確認するために、ビュー決定、走査型電子顕微鏡、および時間結果蛍光顕微鏡を使用したDNA修復のモニタリングなど、いくつかの方法を組み合わせることです。胞子生産を行うには、適切な抗生物質を添加したそれぞれの枯草菌株の5ミリリットルの一晩培養物を200ミリリットルの倍強度液体シェーファー胞子形成培地に移し、培養物の95%以上が胞子形成されるまで、摂氏37度で少なくとも72時間以上激しい曝気で培養します。15ミリリットルのチューブ内で胞子を3000Gで15分間遠心分離して採取し、滅菌蒸留H2Oを用いて洗浄工程を繰り返してサンプルを精製します。

フェイスコントラストミスクロスコピーで純度と発芽状態を確認し、胞子懸濁液が99%を超える相の明るい胞子で構成され、栄養細胞、発芽胞子、細胞破片がないことを確認します。LB寒天に50マイクロリットルの10倍段階希釈液をめっきしてCFUを計算し、プレートを摂氏37度で一晩インキュベートすることにより、胞子の力価を決定します。CFUの測定後、濃縮するか滅菌水を使用してサンプルを希釈することにより、サンプルを1ミリリットルあたり10〜9番目の胞子に調整します。

滅菌された顕微鏡スライドまたは丸い25mmカバースリップの形でサンプルキャリアを、ノズルと整列した電動エアロゾル噴霧ユニット内に配置します。胞子培養物をノズル流体入口に移し、1.3バールの圧力で0.15秒で噴霧を開始します。噴霧された胞子懸濁液は、微細なスライド上に薄膜を形成し、数秒以内に急速に乾燥して、均一に分布した胞子単層を形成します。

処理したサンプル担体は、室温の滅菌容器に保管してください。プラズマシステムのすべての表面を洗浄してウォームアップするには、500ワットのアルゴンプラズマを使用して5パスカルでシステムを開始します。前処理により、チャンバーの通気中に窒素、酸素、水などの周囲空気からの分子の付着が減少します。

チャンバーを通気した後、反応器容器の中央にあるガラスラックにサンプルを慎重に置きます。チャンバーを閉じて排気します。その後、所望のプロセスガスを使用してチャンバーを満たし、システム内の圧力を5パスカルに調整します。

その後、プラズマプロセスを開始します。定義された処理時間が経過したら、電源とガスの供給をオフにし、サンプルホルダーからサンプルが飛んでこないようにシステムを慎重に換気します。換気後、サンプルを取り出し、滅菌容器に保管してください。

プラズマ処理されていないコントロールの場合、最も長く印加されたプラズマ時間に相当するプロセスガスの存在下でのみ、サンプルを真空にさらします。オートクレーブ処理した10%ポリ酢酸ビニルまたはPVAの溶液を調製し、500マイクロリットルを使用してサンプル担体を慎重に覆います。それらを4時間風乾させた後、滅菌鉗子を使用して、胞子サンプルが含まれている乾燥PVA層を剥がし、2ミリリットルの反応チューブに移します。

チューブに1ミリリットルの滅菌水を加え、ボルテックスしてPVA層を溶解し、発芽可能な胞子の95%以上を回収します。滅菌水を使用して、サンプルを96ウェルプレートで1〜10で連続希釈します。各希釈液の50マイクロリットルをLB寒天に播種し、摂氏37度で一晩インキュベートした後、コロニーの数をカウントし、ミリリットルあたりのCFUを決定します。

発芽実験では、厚さ1mmの1.5LB寒天パッドを700マイクロリットルの培地で煮沸し、滅菌顕微鏡ペトリディッシュにピペットで移します。10分後、滅菌メスを使用して8ミリメートル×8ミリメートル×1ミリメートルのLB寒天パッドを切り取り、イメージングチャンバーにすでに取り付けられている25ミリメートルのガラスカバースリップに載っている胞子単層の上に寒天を慎重に移します。寒天投入法は、2つの特定の機能を組み合わせたものです。

レーザー顕微鏡検査中に光学面内のサンプルを安定させ、細胞の横方向の動きを制限します。発芽エッセイに使用するだけでなく、この方法は他の微生物や真核細胞にも適用できます。サンプルを寒天で覆った後、ガラスカバースリップをイメージングチャンバーにすばやく移します。

イメージングプロセス全体を通して、サンプルを加熱ステージで摂氏37度に保ちます。各条件に対して少なくとも3つの生物学的複製を使用します。自動共焦点レーザースキャンと明視野顕微鏡によるサンプルのイメージングに続いて、2.6%のレーザー出力でタイムラプスシリーズを記録し、共焦点開口を5 aer単位、サンプル周波数を0から5時間まで30秒あたり1フレームに設定します。

高線量の単色光を適用すると、レーザー顕微鏡検査中の胞子の発芽を完全に阻害する可能性があります。したがって、レーザー強度を使用し、1つのフレームを取得する間隔を長くします。胞子の凝集、胞子の多層分布、粉塵粒子による汚染の場合、プラズマ処理のブロッキングやシャドーイングが発生し、シャドーイングした胞子の発芽が発生する可能性があります。

走査型電子顕微鏡法を実行するには、胞子単分子膜を金パラジウムでスパッタコードした後、inlan二次電子検出器を含む5キロボルトの加速電圧で操作された電界放出SEMでサンプルを画像化し、トポグラフィーのコントラストを明らかにします。このグラフに示すように、枯草菌の胞子をプラズマ処理すると、血漿処理の期間が長くなると生存率が低下します。これらのSEM画像は、特徴的な縦方向の隆起状構造を明らかにしており、これは処理されたすべての胞子と未処理の胞子で常に見えます。

30秒までのプラズマ処理は、対照と比較して胞子表面の形態の有意な変化を誘発しません。プラズマ処理の期間が長くなると、表面はより粒状になり、120秒または240秒間処理された胞子に小さな亀裂や亀裂が観察されます。これらの時間分解共焦点レーザー走査型顕微鏡実験では、真空をコントロールとして処理したほとんどすべての胞子が発芽し、個々の細胞がかなり均一な長さの棒状の細胞形態を発達

対照的に、プラズマで15秒間処理された胞子は、すでに75±4パーセント未満の発芽能力の低下を示しています。さらに、細胞は広範囲に長い棒状に成長するか、小さなままで胞子のコートにくっつきます。30 秒間の血漿処理後、胞子の 25 プラスマイナス 6% のみが発芽し、栄養細胞の成長が著しく遅れ、長さが異なります。

この手順を試みる際には、位相差顕微鏡を使用して胞子単層の品質を確認し、胞子が重なったり発芽したりしていないことを確認することが重要です。その開発後、画像安定化のための寒天パッド法は、プラズマ滅菌と生細胞顕微鏡の研究者に道を開きました。このビデオを見れば、スライドガラス上に胞子単分子膜を調製する方法、胞子不活性化のためのプラズマ処理を使用した使用の決定方法、生細胞顕微鏡と走査型電子顕微鏡の実施方法について理解を深めることができます。

エチレンオキシドやガンマ線などの他の除染方法とは対照的に、プラズマ滅菌は、ほぼすべての種類の表面で多数の不要な微生物を減らすための効率的で安全なアプローチです。