Name: 魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: 学ぶ成人tg(fli:EGFP)ゼブラフィッシュ網膜血管の解剖プロトコル。蛍光顕微鏡とレーザー走査共焦点顕微鏡を用いて、新血管形成や構造変化に関連する長期的血管病態を迅速に評価する方法です。糖尿病網膜症などの微小血管合併症の研究に応用できます。

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著者は、ゼブラフィッシュ飼育およびテクニカル サポートのためのカトリン ・ Bennewitz とマレーネ ・ Hausner を感謝したいです。著者は、生物医学と医療技術のマンハイム (DFG INST 91027/9-1) コア施設ライブ細胞イメージング マンハイム中心部での対応をご了承ください。本研究は、ドイツ研究振興協会によって支えられた (国際研究訓練グループ 1874/1"DIAMICOM"プロジェクトの SP5 と SP9;プロジェクト B1 と共同研究センター SFB/TR23 プロジェクト Z5 共同研究センター SFB1118)。

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著者が明らかに何もありません。

低酸素状態における網膜促進のモデルを示し、分岐ポイント数の増加血管新生血管面積のもやし、ゼブラフィッシュ20の intercapillary の距離を減少します。これらの調査結果は、後で糖尿病性網膜症の主要な調査結果は VEGF の発現に強くリンクしている低酸素媒介促進として、ゼブラフィッシュは糖尿病血管合併症21に影響を受けやすいという考えをサポートします。高血糖によるゼブラフィッシュの網膜の変化は、血管の厚みが増加につながるが、22のパターン全体を維持します。交互にブドウ糖液 30 日間浸漬も IPL と INL23の厚さを減少させます。血管の代謝の支持者としてゼブラフィッシュにおけるグルコース代謝物の直接の影響も既に示されていた。その他血管 hyperbranching メチルグリオキサール24と孵化ゼブラフィッシュ胚の体幹の血管系のみられました。現時点では、糖尿病網膜症のすべての重要な基準を提供する動物のモデルはありません。初期の変化が多いが、増殖糖尿病網膜症への進行は25を行方不明します。我々 は低酸素媒介促進または高血糖による変化を今まで見ているだけ、ゼブラフィッシュはまたこの定義に落ちる。現在の調査結果は、ゼブラフィッシュは高血糖による血管の変化を受けやすい動物モデルとして潜在的増殖性糖尿病網膜症への進行を示すかもしれないという考えをサポートします。強度、高血糖を介した効果への露出によって右実験モデルがゼブラフィッシュの網膜の特定の領域に虚血につながるし、増殖糖尿病網膜症の主な基準として促進を促進します。ただし、ゼブラフィッシュは、長期微小血管病態をモデリングの分野で比較的新しいプレーヤーは、ゼブラフィッシュの今後の糖尿病モデルはさらに情報を提供し、他のモデルとその病態を尊重し、その重要性を明らかにします。たとえば、tg(fli:EGFP) ラインに赤い標識赤血球 tg(gata1a:DsRed) ゼブラフィッシュのクロスは将来のゼブラフィッシュ モデルの予測因子として蛇行を示す潜在的な眼内の出血を同時に視覚化する使用ことがラオスへの進行。
網膜の血管は、アーケードの連続に進行する、ので intervascular 距離、分岐ポイントの数および血管面積の評価は、中心光動脈から距離に関連しています。血管評価パラメーターのバイアスを避けるためには、オリエンテーションのポイントが必要です。IOC はこのような構造、関連性の高い直接空間的近接性血管活動の区域はあるので。一貫性のある評価網膜スキャンは IOC に一定の距離を持つ複数の長方形の画像のセクションに分割して必要があります。網膜全体を分析する必要があります、画像は数値的対称的に分散します。ゼブラフィッシュの網膜は、ハイとローの毛細血管密度と領域を示しています、イメージのセクションの等しくない配分は付加的なバイアスにつながることができます。
<img alt="Figure 12" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig12.jpg"> 
図 12: 網膜血管可視化の読み出しと血管パラメーターの例提示します。Intervascular 距離 (赤色の二重矢印) 内部の光の近くの測定円 (IOC) (A)の。3 分岐ポイント (赤丸) 付近の IOC (B)。発芽容器(C)を示す拡大エリア (赤箱) ゼブラフィッシュ網膜血管の可視化。血管径測定中心動脈 (白十字) から一定の距離 (白い二重の矢印) (D)。血管密度は容器 (斜めの赤い線) をオーバーレイすることにより網膜領域の割合(E)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig12large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Intervascular の距離を測定するには、(図 12 a、白い二重の矢印) の標準として IOC に一定の距離を設定し、IOC に平行架空の横線 (図 12 a、白い水平線) を描画する 1 つ必要があります。この行追加し、数学的平均の容器間の距離 intervascular の距離に相当します。容器を分割し、1 つ以上の血管内腔が起源のポイントから続行するたびに、各イメージ内分岐ポイントがカウントされます。毛細血管との間の横のつながりも含まれます。分析と一貫性を保ってし、カウントし、不要な変動を減らすために全体の実験を通してこれらの規則への分岐ポイントを決定することが重要です。血管発芽図 12に示すようは、網膜の血管系に及ぼす影響を評価する各画像に数えることができる別のパラメーターです。血管新生もやし中心動脈、IOC と網膜の外側の部分の近くにフォーカスのアーケードのような連続をしないでください。特定の血管を評価する向きのポイントは、必要常に設定された距離マーク測定スポット。網膜の内側中心動脈の起源は、主茎血管 (図 12D、クロス白) のような指導を提供します。網膜全体のエリアのパーセンテージとして血管 (図 12E、斜めの赤い線) によって占有される領域は血管密度と直接無血管領域に関連していません。
1 つのサンプルの完全な共焦点スキャンは、小さな毛細血管 hypersprouting の可視化を許可するように複数の高精細画像の構成必要があります。時間とここに費やされるリソースを最適化するため、自動耕耘手順は、すべてのタイルの一般的なスキャンの深さと使用ください。網膜の不均一なマウントは大きく共焦点顕微鏡で血管をスキャンする時間を増やすことができます。1 つは (図 13B、白いボックス) に血管の層が、GCL の部分的な包含をだけスキャンしたい最適なアプローチで必要があります。後短すぎるフラット マウントを達成するためにカットと同様に切り捨て、視神経の余分な長さを残しては、不均一な実装につながります。
<img alt="Figure 13" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig13.jpg"> 
図 13: HE 染色と大人のゼブラフィッシュの網膜における蛍光の比較。GCL (A)上記フォーカスした網膜血管系の。網膜血管系 (ホワイト ボックス) 緑 EGFP 信号や強い蛍光((B))を示す網膜の層を示します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig13large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
ゼブラフィッシュの網膜血管の適切な準備は、事前研修を必要未熟な dissectors と強く様々 な準備の結果小さなサンプル サイズ、技法の主な制限です。Tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ目の準備は、血管系の状態に高速の洞察力を与える、技術では経験豊富な研究員の網膜あたりの作業時間の約 20 分まだ利用します。解剖顕微鏡の下ですべての網膜血管の準備手順を行う必要があり、dissectors に滞在する必要不注意なステップは、容器破損を引き起こすことができる潜在的に全体の時間を集中しています。切開は、準備から長期の不在が容器の整合性を維持するためのバイナリの可能性を低減、定期的に練習する必要があります。
人間と齧歯動物の組織で検証される抗体の数が少ない、ゼブラフィッシュ使用しているさらに、免疫組織染色 (IHC) による追加読み出しはまだ限られています。実験者 IHC に興味を持って、新しいターゲットを操作するときに特にゼブラフィッシュ特異抗体を検索するお勧めします。また、眼の血管系以外のセルの研究に有用である追加ゼブラフィッシュ記者ラインを使用することをお勧めします。ただし、この戦略は時間がかかる、複数トランスジェニック記者を運ぶ大人ゼブラフィッシュ ラインを生成する数ヶ月かかるので。
それにもかかわらず、ゼブラフィッシュは利点のユニークな配列を引き起こします。彼らは比較的小さく、容易に再現します。彼らが大人の段階に急激に拡大する、その胚創薬スクリーニングに最適です。フィールドを容易に成長しているより多くの文献にアクセスできるなっています。急速なスピードと transgene 蛍光レポーター ラインの豊富さで遺伝子のノックアウトを生成する能力を持つゼブラフィッシュのための選択は、選択した研究の質問によってだけ抑制されます。

糖尿病は、機能不全のインスリン分泌やインスリンを分泌する組織の不十分な応答から生じる高血糖によって定義される代謝性疾患です。WHO の推計に 4 億 2200 万大人 2014年1の糖尿病と住んでいた、世界中の糖尿病の有病率は糖尿病で重要な研究分野の一つを作る 20352日まで人口の 8-10% に増加すると予想、次の十年。慢性的な高血糖との生活は、糖尿病網膜症、腎症、多発性神経障害などの長期の微小血管合併症に します。管理とこれらの合併症の予防が困難である場合確かに、糖尿病透析2につながる、末期腎臓病 (ESRD) の最も頻繁な原因になっているし、糖尿病は中年の大人3の失明の主要な原因。
糖尿病性の網膜の微小血管障害の初期の原因が特定のリスク要因 (例えば、高血圧、高脂血症) と同様、慢性的な高血糖、代謝の変化、血管内皮、周皮細胞脱落につながると無細胞性血管袖になる毛細血管回帰。結果網膜虚血、血管新生、増殖糖尿病網膜症 (ラオス)4の開発を促進血管透過性の亢進の原因です。糖尿病網膜症は、糖尿病網膜症の視力を脅かす、白い欧州コホート研究 UKADS 研究5の 12% で確かめた中一般に、糖尿病患者の 37% で検出されました。現在の治療のみさらに合併症を防ぐことができ、既に損傷を完全に復元することができません。による汎網膜光凝固、血糖コントロールに加えて増殖糖尿病網膜症 (ラオス) の標準的な治療法ですが、同様に隣接する健康な組織に影響を与えます。抗 VEGF 介入がレーザー治療6、7、しかし、最終的には、特殊な目標とされた療法に代わるものとして有望な結果を示すし、視力低下のリスクがある患者の数の増加を管理する新しい薬が必要があります。
糖尿病網膜症の確立された動物研究モデルは人間の病態生理学のあらゆる側面を共有しません。科学的な研究の質問の特定の要件に対応する正しい種の活用は、実験のセットアップの最も相当な部品の一つです。ゼブラフィッシュ胚 (動脈分布) 発達障害研究ですでに広く使用されて morpholinos や CRISPR/Cas9 テクニック8を介して特定の遺伝子をノックダウンまたはノックアウトする最適な実用的な背景を提供しています。これらのメソッドは、病気の進行と感受性9の特定のメカニズムに洞察力を生成する大規模なゲノムワイド関連研究 (GWAS) によって識別された遺伝子を調査するゼブラフィッシュで容易に利用することができます。短い世代時間、大量の子孫、簡単と低コスト処理、および成長の分析サポートは、特に代謝性疾患をモデル化するための大きな可能性を与え、ゼブラフィッシュ モデルの妥当性を増加しています。ゼブラフィッシュの生物学的メカニズムの保全は、薬理学的治療開発のための基礎として示されています。たとえば、抗糖尿病薬メトホルミンとコレステロール値下げるシンバスタチンのキャンプ/デキサメタゾンによる高い PEPCK 式と高コレステロール食餌による高コレステロール血症の10モデルの条件を「治療」に示されている,11,12. この前進される代謝メカニズムを包括的な洞察はゼブラフィッシュの糖尿病モデル、実験を通しての数の増加によってさらにサポートされているよう: グルコース溶液中のインキュベーションを交互ストレプトゾトシン アブレーション ベータ細胞のプロドラッグ メトロニダゾール、pdx1 遺伝子ノックダウンやノックアウト、だけでなく、骨格筋の増加するインシュリン抵抗のモデルを介したイネ糖尿病を使用してニトロを介するベータ細胞アブレーション12しますこれらはすでに種の上記の仕様のプロトコルを確立し、効率的にすべてのサンプルの多数のゲノムを操作する能力を示すメカニズムを勉強のゼブラフィッシュの利点。薬理学的介入のためのスクリーンに能力だけでなく、複雑な病気プロセスを運転します。
基本的なゼブラフィッシュ眼の解剖学 (図 1) の一般的な理解は、網膜血管障害のモデルとしてのゼブラフィッシュを利用するために切開に必要です。ゼブラフィッシュ眼強膜13でグローブの外側に六つの外眼筋、4 直筋, と 2 つの斜筋を挿入するには。角膜は、レンズを覆う透明の組織であり目の外殻を形成する強膜に直接続きます。強膜非透過的で、部分的に光反射面、色素が強く。レンズ自体は、人間の同等よりもっとボール形です。酸素を提供する網膜血管内側の神経節細胞層と密接に関連ですが、網膜のネットワークを形成していない網膜は神経細胞の 3 つの核層で構成されています。脈絡膜血管は対照的に、強膜と網膜の間にある、網膜色素上皮 (RPE) に関連付けられます。この毛細血管は、14の網膜の外側の部分に酸素を供給します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig1.jpg"> 
図 1: アダルト ゼブラフィッシュ眼の模式。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
Tg(fli:EGFP) 遺伝子導入ゼブラフィッシュ行15の利用による網膜血管系の簡単な可視化を実現できます。血管の内皮細胞に fli プロモーターの制御下で表明した緑色蛍光タンパク質は、レーザー後の手順で顕微鏡による可視化のための基礎です。これは、ゼブラフィッシュの網膜の解剖や組織全体でマウントを介して実現されます。このトランスジェニック モデルは、血管内のラベル付けやホール マウント免疫組織染色の任意のアプリケーションがなくても高速血管の読み出しを提供します。ゼブラフィッシュにおける糖尿病網膜症を分析するには、ステップ バイ ステップと標準化された準備ルーチンはすべての切開で使用ください。次の準備のプロトコルは、他の研究グループの簡単に成人ゼブラフィッシュ眼の露出した血管での血管の変化を評価し、ゼブラフィッシュの網膜の最適化された解剖ルーチンを確立するためのガイダンスを提供オプションを提供します。

<table><tbody><tr><td>NaOH</td><td>Roth</td><td>6771.3</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>メルク</td><td>1.04936</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2*6H20</td><td>Roth</td><td>5239.2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4*7H20</td><td>Merck</td><td>1.05886.0500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>ナトリウムリン酸二水素</td><td>ロス</td><td>2370.1</td><td></td></tr><tr><td>エチル3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸塩(MS-222、トリカイン)</td><td>シグマ</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>ロス</td><td>9143.1</td><td></td></tr>ア<tr><td>ガロー</td>スロー<td>ス</td><td>2267.3</td><td></td></tr>フル<tr><td>オロマウント-G</td><td>サーモフィッシャー00-4958-02</td><td></td><td></td></tr>シャーレ<tr><td></td><td>グライナーバイオワン</td><td>633180</td><td></td></tr><tr><td>6ウェルプレート</td><td>StarLab</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>ニードル</td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>BD 300900</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピンセット</td><td>World Precision Instruments</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Microdissection Scissor</td><td>World Precision Instruments</td><td>501778</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>Carl Roth</td><td>H872.1</td><td></td></tr><tr><td>カバースリップ 22mmx22mm</td><td>neoLab</td><td></td><td></td>103512222</tr>メス <tr><td></td><td>MSG Praxisbedarf</td><td>FEA111</td><td></td></tr><tr><td>落射照明</td><td>ライカ</td><td>10446389</td><td></td></tr><tr><td>蛍光実体顕微鏡 MZ10 F</td><td>ライカ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡 SP5 DS</td><td>ライカ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>実体顕微鏡 M80</td><td>ライカ</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>ゼブラフィッシュライン: Tg(fli:EGFP), ABTL 野生型</td><td>NA</td><td>NA</td><td>参考文献 15</td></tr><tr><td>Mayer'のヘマトキシリン</td><td>博士K.ホルボーン&S&ouml;hne</td><td>0088663</td><td></td></tr><tr><td>0.5% eosin</td><td>Dr. K. Hollborn &S&ouml;hne</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>99,9% エタノール</td><td>Roth</td><td>9065.2</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Merck</td><td>1,071,501,000</td><td></td></tr><tr><td>キシロール</td><td>Roth</td><td>4436.2</td><td></td></tr><tr><td>アセトン</td><td>Emsure</td><td>606-001-00-8</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム RM 2165</td><td>ライカ</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:egfp) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

Studying Diabetes Through the Eyes of a Fish: Microdissection, Visualization, and Analysis of the Adult tg(fli:EGFP) Zebrafish Retinal Vasculature

糖尿病網膜症は、中年の成人の失明の主要原因です。世界的な糖尿病の罹患率の増加になる糖尿病の血管合併症の予防次の十年の重要な研究分野の一つ。視力低下のリスクがある患者数の増加を管理するには、特殊な目標とされた療法と新規治療薬の開発が必要。ゼブラフィッシュは増加する多因子疾患の代謝プロセスをモデル化するための関連性と発達障害研究の質問のための動物モデルを確立です。最適な可視化とスループットの高い薬剤のスクリーニングのアプローチ、興味の遺伝子をノックアウトする強力な機能を組み合わせるの種の利点を許可します。ここでは、長期的な血管病態促進や血管の損傷にリンクの設定で高速読み出しとして大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の簡単な分析を可能にするプロトコルについて述べる。これは、ゼブラフィッシュの網膜の解剖や組織全体でマウントを介して実現されます。露出した血管の可視化し、大人の網膜血管系の表現緑 EGFP 記者の共焦点顕微鏡を介して達成されます。組織の正しい処理は、良い結果になり、内部の容器破損不変の血管構造の可視化を確保に します。メソッドは、網膜血管の促進と同様、容器のアーキテクチャの変化にリンクのゼブラフィッシュ モデルで利用できます。

大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュの網膜血管系の 2 つの典型的な形態例を示す: 一度可視化 (図 9 a) 蛍光顕微鏡と共焦点レーザー走査型顕微鏡 (図 9 b)。明らかに網膜構造は、非常に組織されるパターンを示します。蛍光顕微鏡で視覚化されたとき、強い蛍光がゼブラフィッシュの網膜に見られます。したがって、バック グラウンド蛍光を軽減し、コントラストを高めるは、共焦点スキャンを介してのみ血管層の可視化の使用をお勧めします。高速画像取得や質的データが十分な状況は、蛍光顕微鏡は魅力的な代替手段です。
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig9.jpg"> 
図 9: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の代表的な写真です。網膜血管系の 2 つの典型的な形態の例を示す: 中央光動脈アーケードの連続に分岐し、5-7 主要血管系へと 。すべてのさらなる血管の各花弁の外側の部分を制限する円周静脈 (CV) にドレインします。2.5 倍の倍率(A)の蛍光顕微鏡による可視化共焦点レーザー顕微鏡複合 5 x 5 の単一のイメージ タイル スキャン(B)による網膜血管の可視化。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig9large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
光の動脈は視神経乳頭、網膜に浸透、ほとんどのサンプルで 5-7 主な血管 (図 10 a) へと 。メインの船、アーケードの連続に分岐し、内部ファイバー円 (IOC) 円周静脈 (CV) とも呼ばれるフラット マウントされた網膜の周辺部で視神経を包囲に接続 (図 10 bを参照)。IOC は、眼の世界 (球輪) の内側の縁に動脈の血液を排出する静脈血管です。ゼブラフィッシュの網膜血管は、毛細血管と血管新生の萌芽 (図 10) の分岐の高い血管活動の領域を示しています。この血管の活動は IOC にすぐ近くに大抵あります。同じ目が網膜の異なる領域で両方の高値と安値血管活動を発揮できることに気づくことが重要です (図 10 bと図 10を比較)。一般より多くの無血管領域とマウス17の網膜などに比較すると主枝の間に少ない毛細血管、ゼブラフィッシュの網膜血管を示しています。血管間で異なる場合があります、特異検査はバイアスにつながることができますので、各サンプルの両方の目を分析する必要があります。
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig10.jpg"> 
図 10: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管可視化の領域を拡大します。主な容器(A)に分岐ファイバー動脈。網膜毛細血管低血管活動写真(B)の下に内側の光円 (IOC) に接続します。IOC (C)に接続する高い血管活動の領域の網膜毛細血管。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
神経層の非常に節約されるアーキテクチャは約 72 時間からゼブラフィッシュに存在既にポスト受精 (hpf) 以降18。アダルト ゼブラフィッシュ網膜インサイド アウト (図 11) から次の層を示しています: 神経節細胞層 (GCL)、内網状層 (IPL)、内部の核層 (INL)、外網状層 (OPL)、核外層 (ONL)、視細胞層 (PL)網膜色素上皮 (RPE)。網膜血管の可視化から血管パラメーターの推定は図 12に示します。内側の網膜血管は、脈絡膜、神経節細胞層 (GCL) (図 13 b、ホワイト ボックス) 沿いに毛細血管が網膜色素上皮 (RPE) に関連付けられます。
<img alt="Figure 11" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56674/56674fig11.jpg"> 
図 11: 彼大人ゼブラフィッシュ眼の染色します。(A)レンズを除去した後全体の目の断面の概要です。大人のゼブラフィッシュの網膜の層の目19 (B)。PL (C)自然の限界点を示す (黒矢印)。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56674/56674fig11large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

ここでは、長期血管病態促進と構造変化にリンクの設定で高速読み出しとして大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の簡単な分析を可能にする方法のプロトコルについて述べる。

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成体ゼブラフィッシュ網膜血管系のこの解剖プロトコルの全体的な目標は、蛍光またはレーザー走査型共焦点顕微鏡法による新血管新生および構造変化に関連する長期血管病変の設定で迅速な読み出しを提供することです。この方法は、糖尿病性網膜症の発症などの微小血管合併症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、網膜血管系全体を、血管間蛍光を比較的迅速かつ標準化された方法で適用することなく、生理学的および疾患プロセスで提示および分析できることです。まず、サンプルあたり新たに調製した4%PFA PBS溶液6ミリリットルを6つのウェルプレートのウェルに移します。テキストプロトコルに従って成魚のゼブラフィッシュを安楽死させた後、新しいペーパータオルの上に置き、乾燥させます。メスを使用して、蓋の後ろの頭を切ります。次に、ヘッドを新しく調製した固定剤のウェルに直接移します。魚の頭が入ったプレートを摂氏4度で少なくとも24時間保管して、固定液が網膜のより深い層に浸透することを確認します。.加熱した2パーセントのアガロースで、ペトリ皿を3分の1まで満たし、寒天が固まるまで待ちます。寒天プレートを1つのX PBSで覆い、目を解剖するためのワークスペースを作成します。固定したサンプルをペトリ皿に移します。そして、1本のピンセットで頭を切断面に保持することにより、眼窩空洞の眼球の下にピンで留められた別のピンセットを挿入します。目の下のピンセットをゆっくりと開き、視神経をつかみます。次に、目を慎重に引き裂いて取り外します。眼に接続されている4つの直筋と2つの斜めの外眼筋、および眼と眼窩腔を結合している残りの眼外組織のいずれかを切除するには、半分閉じたピンセットで目を押さえ、もう一方のピンセットで構造をつかむと、直径の動きで柔らかく引き裂かれます。次に、27ゲージの使い捨て針を使用して、外側の角膜に穴を開けます。この開口部を通して、両方のピンセットを使用して角膜を保持し、わずかに引き裂いて開きます。次に、慎重に作業して、それぞれの瞳孔のサイズを中心に裂け目を作成します。眼球の角膜側、虹彩の上の角膜外側の端に圧力をかけます。これにより、小さなへこみができ、レンズが角膜裂傷の高さまで押し上げられます。次に、ピンセットをレンズの下に通して取り外します。次に、視神経を上に向けて目を逆さまにします。強膜と角膜はつながって眼球の繊維状のチュニックを形成し、カップ状の網膜を保護していることに注意してください。角膜強膜と呼ばれるこのシェルは、視神経の周りの領域を温存します。この中止時に針を挿入して、強膜と網膜の間に開口部を作ります。.次に、このアクセスを両方のピンセットで使用して、強膜を軸方向に慎重に裂いてストリップにし、視神経の周りの開口部を増やします。角膜側円周への移行時に角膜強膜が無傷を保つように注意してください。残りの眼内組織から角膜強膜を取り除く前に、他の構造への付着が重要なポイントになるため、接続を断ち切るようにしてください。次に、片方のピンセットで強膜を持ち、もう片方のピンセットで視神経をつかんで引き離すことで、角膜強膜を目から完全に取り除き、廃棄します。このステップにより、ブドウ膜と網膜血管系を含む網膜からなるカップ状の構造が得られます。次に、針先の縁で外面を削り取りながら、27ゲージの針を残りのカップに横向きに保持することにより、脈絡膜とRPE層に破裂を作成します。断裂をアクセスポイントとして使用して脈絡膜層とRPE層をつかみ、両方のピンセットを使用して虹彩への接続を損なわないようにストライプに引き裂きます。その後、虹彩の下にピンセットを1本通し、断絶した脈絡膜とRPE層を引っ張って張力を生じさせながら外部から回路状に動かし、結合した構造を切り離します。虹彩の一部を切除できず、脈絡膜とRPE層を切除した後もカップ状の網膜に接続したままにできない場合は、成虫のゼブラフィッシュの目が光受容体層内で示す別の自然な破断点を利用します。同様に、虹彩を除去することが実証されています。残りのカップ状の網膜をこすり落とし、視細胞層の中止を誘発します。.次に、作成したアクセスを使用して、虹彩への接続の可能性を損なわずにレイヤーを削除します。その後、ピンセットを虹彩の下に通し、このビデオで前述したように回路内で続行して、結合された構造を取り外します。虹彩は、血管の視覚化中に内側の視円の真上の蛍光をブロックするため、賢明な方法でその下にある組織から切断することが重要です。過度に直接的なアプローチは、船舶の破損につながる可能性があります。次に、2点5ミリメートルの直線的な刃先を備えたマイクロダイセクションスプリングハサミを使用して、視神経を網膜にできるだけ近づけて切断します。これにより、ティッシュのより適切なフラットマウントが可能になります。網膜血管系をマウントして視覚化するには、1つのX PBSを使用して、解剖された網膜をそれぞれ5分間2回洗浄します。PBSをスライドガラスに一滴垂らします。次に、マイクロスプーンの端が付いた実験用ヘラを使用して、網膜を液滴に移します。ピンセットで組織を固定しながら、メスを使ってカップ状の構造を切断し、網膜のサイズに応じて平らな4枚の花びらまたは5枚の花びらの形を作ります。網膜に触れないように注意しながら、残ったPBSを細かい紙で吸い上げます。次に、フラットマウントされたRetinaをマウントメディアでコーティングし、カバースリップで覆います。気泡が網膜血管の視覚化を歪める可能性があるため、泡を作らないように注意してください。マニキュアを使用してカバーを密封します。最後に、蛍光顕微鏡またはレーザー走査型顕微鏡検査を実施して、網膜血管系を視覚化します。ここに示されているのは、成体のトランスジェニックハエEGFPゼブラフィッシュの網膜血管系の形態学的例を蛍光顕微鏡で視覚化したものと、バックグラウンド蛍光を低減する共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化した2番目の例です。明らかにされた網膜構造は、高度に組織化されたパターンを示しています。視神経動脈は視神経乳頭で網膜を貫通し、ほとんどのサンプルでは5〜7つの主要な血管に広がっています。その後、主要な血管は一連のアーケードに分岐し、内側の視円またはIOC(円周静脈とも呼ばれる)に接続し、平らに取り付けられた網膜の周辺で視神経乳頭を囲みます。成体のゼブラフィッシュ網膜は、内側から外側に向かって以下の層で構成されています。神経節細胞層、内側叢状層、内核層、外側叢状層、外側核層、視細胞受容器層、および網膜色素上皮。ここでは、網膜血管系の可視化による血管系パラメータの推定を示します。内側の網膜血管系は神経節細胞層に位置し、真性毛細血管は網膜色素上皮に関連しています。このテクニックは、一度トレーニングすると、適切に実行されれば20分以内に完了します。この手順を試みるときは、準備を長期間欠席すると血管の完全性の結果が低下するため、定期的に練習することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、成体のゼブラフィッシュで糖尿病と神経血管の病状を分析できます。

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