魚の目を通して糖尿病の勉強: 大人 tg(fli:EGFP) ゼブラフィッシュ網膜血管系の解析、可視化、レーザーマイクロダイ セクション

成体ゼブラフィッシュ網膜血管系のこの解剖プロトコルの全体的な目標は、蛍光またはレーザー走査型共焦点顕微鏡法による新血管新生および構造変化に関連する長期血管病変の設定で迅速な読み出しを提供することです。この方法は、糖尿病性網膜症の発症などの微小血管合併症の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、網膜血管系全体を、血管間蛍光を比較的迅速かつ標準化された方法で適用することなく、生理学的および疾患プロセスで提示および分析できることです。

まず、サンプルあたり新たに調製した4%PFA PBS溶液6ミリリットルを6つのウェルプレートのウェルに移します。テキストプロトコルに従って成魚のゼブラフィッシュを安楽死させた後、新しいペーパータオルの上に置き、乾燥させます。メスを使用して、蓋の後ろの頭を切ります。

次に、ヘッドを新しく調製した固定剤のウェルに直接移します。魚の頭が入ったプレートを摂氏4度で少なくとも24時間保管して、固定液が網膜のより深い層に浸透することを確認します。.加熱した2パーセントのアガロースで、ペトリ皿を3分の1まで満たし、寒天が固まるまで待ちます。

寒天プレートを1つのX PBSで覆い、目を解剖するためのワークスペースを作成します。固定したサンプルをペトリ皿に移します。そして、1本のピンセットで頭を切断面に保持することにより、眼窩空洞の眼球の下にピンで留められた別のピンセットを挿入します。

目の下のピンセットをゆっくりと開き、視神経をつかみます。次に、目を慎重に引き裂いて取り外します。眼に接続されている4つの直筋と2つの斜めの外眼筋、および眼と眼窩腔を結合している残りの眼外組織のいずれかを切除するには、半分閉じたピンセットで目を押さえ、もう一方のピンセットで構造をつかむと、直径の動きで柔らかく引き裂かれます。

次に、27ゲージの使い捨て針を使用して、外側の角膜に穴を開けます。この開口部を通して、両方のピンセットを使用して角膜を保持し、わずかに引き裂いて開きます。次に、慎重に作業して、それぞれの瞳孔のサイズを中心に裂け目を作成します。

眼球の角膜側、虹彩の上の角膜外側の端に圧力をかけます。これにより、小さなへこみができ、レンズが角膜裂傷の高さまで押し上げられます。次に、ピンセットをレンズの下に通して取り外します。

次に、視神経を上に向けて目を逆さまにします。強膜と角膜はつながって眼球の繊維状のチュニックを形成し、カップ状の網膜を保護していることに注意してください。角膜強膜と呼ばれるこのシェルは、視神経の周りの領域を温存します。

この中止時に針を挿入して、強膜と網膜の間に開口部を作ります。.次に、このアクセスを両方のピンセットで使用して、強膜を軸方向に慎重に裂いてストリップにし、視神経の周りの開口部を増やします。角膜側円周への移行時に角膜強膜が無傷を保つように注意してください。

残りの眼内組織から角膜強膜を取り除く前に、他の構造への付着が重要なポイントになるため、接続を断ち切るようにしてください。次に、片方のピンセットで強膜を持ち、もう片方のピンセットで視神経をつかんで引き離すことで、角膜強膜を目から完全に取り除き、廃棄します。このステップにより、ブドウ膜と網膜血管系を含む網膜からなるカップ状の構造が得られます。

次に、針先の縁で外面を削り取りながら、27ゲージの針を残りのカップに横向きに保持することにより、脈絡膜とRPE層に破裂を作成します。断裂をアクセスポイントとして使用して脈絡膜層とRPE層をつかみ、両方のピンセットを使用して虹彩への接続を損なわないようにストライプに引き裂きます。その後、虹彩の下にピンセットを1本通し、断絶した脈絡膜とRPE層を引っ張って張力を生じさせながら外部から回路状に動かし、結合した構造を切り離します。

虹彩の一部を切除できず、脈絡膜とRPE層を切除した後もカップ状の網膜に接続したままにできない場合は、成虫のゼブラフィッシュの目が光受容体層内で示す別の自然な破断点を利用します。同様に、虹彩を除去することが実証されています。残りのカップ状の網膜をこすり落とし、視細胞層の中止を誘発します。.

次に、作成したアクセスを使用して、虹彩への接続の可能性を損なわずにレイヤーを削除します。その後、ピンセットを虹彩の下に通し、このビデオで前述したように回路内で続行して、結合された構造を取り外します。虹彩は、血管の視覚化中に内側の視円の真上の蛍光をブロックするため、賢明な方法でその下にある組織から切断することが重要です。

過度に直接的なアプローチは、船舶の破損につながる可能性があります。次に、2点5ミリメートルの直線的な刃先を備えたマイクロダイセクションスプリングハサミを使用して、視神経を網膜にできるだけ近づけて切断します。これにより、ティッシュのより適切なフラットマウントが可能になります。

網膜血管系をマウントして視覚化するには、1つのX PBSを使用して、解剖された網膜をそれぞれ5分間2回洗浄します。PBSをスライドガラスに一滴垂らします。次に、マイクロスプーンの端が付いた実験用ヘラを使用して、網膜を液滴に移します。

ピンセットで組織を固定しながら、メスを使ってカップ状の構造を切断し、網膜のサイズに応じて平らな4枚の花びらまたは5枚の花びらの形を作ります。網膜に触れないように注意しながら、残ったPBSを細かい紙で吸い上げます。次に、フラットマウントされたRetinaをマウントメディアでコーティングし、カバースリップで覆います。

気泡が網膜血管の視覚化を歪める可能性があるため、泡を作らないように注意してください。マニキュアを使用してカバーを密封します。最後に、蛍光顕微鏡またはレーザー走査型顕微鏡検査を実施して、網膜血管系を視覚化します。

ここに示されているのは、成体のトランスジェニックハエEGFPゼブラフィッシュの網膜血管系の形態学的例を蛍光顕微鏡で視覚化したものと、バックグラウンド蛍光を低減する共焦点レーザー走査型顕微鏡で画像化した2番目の例です。明らかにされた網膜構造は、高度に組織化されたパターンを示しています。視神経動脈は視神経乳頭で網膜を貫通し、ほとんどのサンプルでは5〜7つの主要な血管に広がっています。

その後、主要な血管は一連のアーケードに分岐し、内側の視円またはIOC(円周静脈とも呼ばれる)に接続し、平らに取り付けられた網膜の周辺で視神経乳頭を囲みます。成体のゼブラフィッシュ網膜は、内側から外側に向かって以下の層で構成されています。神経節細胞層、内側叢状層、内核層、外側叢状層、外側核層、視細胞受容器層、および網膜色素上皮。

ここでは、網膜血管系の可視化による血管系パラメータの推定を示します。内側の網膜血管系は神経節細胞層に位置し、真性毛細血管は網膜色素上皮に関連しています。このテクニックは、一度トレーニングすると、適切に実行されれば20分以内に完了します。

この手順を試みるときは、準備を長期間欠席すると血管の完全性の結果が低下するため、定期的に練習することを覚えておくことが重要です。この手順に続いて、成体のゼブラフィッシュで糖尿病と神経血管の病状を分析できます。