2 光子レーザー顕微鏡を用いた細胞膜修復法

この手順の全体的な目標は、筋ジストロフィー患者細胞の原形質膜修復能を定量化することです。この方法は、特定の突然変異と膜再封鎖動態との関係など、筋ジストロフィーの重要な質問に答えるのに役立ちます。この手法の主な利点は、生細胞における膜再封鎖速度のリアルタイム定量化が可能になることです。

まず、40ミリリットルの増殖培地が入ったT225フラスコで、37°Cの二酸化炭素インキュベーターで線維芽細胞を培養します。培養物が70〜80%のコンフルエントに達したら、洗浄ごとに40ミリリットルのPBSで細胞を2回すすぎ、続いて5ミリリットルの0.05%トリプシンを摂氏37度で5分間追加します。細胞が分離したら、40ミリリットルの新鮮な増殖培地で反応を停止し、100,000細胞/ミリリットルの濃度で2ミリリットルの細胞を35ミリメートルのコラーゲン被覆ガラス底プレートに播種し、摂氏37度と二酸化炭素5%で一晩インキュベーションします。

トランスフェクション培養物1本につき1.5ミリリットルのチューブ1本に、150マイクロリットルの新鮮な血清欠乏培地を添加します。次に、各チューブに3マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加え、チューブを室温で少なくとも5分間インキュベートします。チューブのインキュベーション中に、175マイクロリットルの血清由来培地と3.5マイクログラムのジスフェリンプラスミドDNAを、プレートあたり1.5ミリリットルのチューブ

次に、150マイクロリットルのプラスミドDNA溶液と150マイクロリットルのトランスフェクション試薬を1プレートあたり1本の新しいチューブに組み合わせ、室温で20分間インキュベートします。翌朝、成長培地を2ミリリットルの血清由来培地と交換します。インキュベーションの終了時に、300マイクロリットルのプラスミド溶液全体を各プレートに均等に分配し、プレートを二酸化炭素インキュベーター内で摂氏37度で24時間インキュベー

翌日、プラスミド上清を新鮮な増殖培地と交換し、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。2光子創傷アッセイ用の細胞を調製するには、トランスフェクションした培養物を1ミリリットルのTyrode溶液で1回すすぎます。次に、1ミリリットルの新鮮なチロード溶液に1マイクロリットルの2.5ミリモルFM4-64色素を補充して細胞に加えます。

次に、倒立共焦点顕微鏡を使用して、顕微鏡のソフトウェアで0.2 x 2ミクロンのターゲットを作成し、ターゲットラインが重なり合って細胞膜に対して垂直になるように、ターゲットを細胞膜の端に配置します。FM色素信号を励起するには543ナノメートルのヘリウムネオンレーザーを、GFP信号を励起するには488ナノメートルのアルゴンレーザーを選択し、検出範囲をそれぞれ600〜760ナノメートルと500〜550ナノメートルに設定します。次に、5 分間の時系列の連続画像スキャンを作成します。

膜病変を作製するには、2光子レーザーを15%のレーザー出力で820ナノメートルまで10回の反復で使用して、時系列の開始から25秒後に細胞を漂白します。FM4-64色素の蛍光を定量するには、ソフトウェアを使用して6 x 6ミクロンの関心領域を描画し、その関心領域を細胞内の創傷位置に隣接して配置します。次に、バックグラウンド値を減算し、正味の増加を時間ゼロでの蛍光値で除算して、各時点の相対的な蛍光値を計算します。

健康なヒト線維芽細胞は、レーザー創傷後に低レベルのFM4-64蛍光活性化を示しますが、未治療の患者線維芽細胞は、損傷後に高度の相対蛍光強度を示します。全長ジスフェリンプラスミドをトランスフェクションした患者細胞は、未治療の患者対照と比較して相対的なFM4-64蛍光強度が減少しましたが、健康な対照で観察された蛍光値と同様です。この手順を試みる際には、細胞が緩衝液中でゆっくりと死滅するため、迅速に作業し、定期的に新鮮な細胞に変化させることを覚えておくことが重要です。

このビデオを見れば、2光子顕微鏡を使用して膜病変を再生する方法と、膜再封止をリアルタイムで定量化する方法について十分に理解できるはずです。