単一セルの解像度蛍光は住む幼虫脳文化のショウジョウバエ概日時計のイメージング

この手順の全体的な目標は、ショウジョウバエの幼虫の脳を培養して、数日間のタイムラプス蛍光顕微鏡検査を行うことです。この方法は、特定のニューロン集団で発生する遺伝子発現の変化など、ショウジョウバエの神経遺伝学の分野における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、数時間から数日にわたって、生きた脳内の単一細胞分解能で蛍光プローブをイメージングできることです。

この手順の試薬を準備するときは、培養フードの下で作業してください。SAM培地とトロンビンの両方のアリコートを開始するには解凍する必要があります。トロンビンを取っておきます。

2.5ミリリットルのSAMを取り、残りのSAMを氷の上に置いて脇に置きます。次に、ペニシリンストレプトマイシンを分注したSAMに入れ、室温に保ちます。長期イメージング実験では、想像チャンバーを準備し、ガラス底皿のウェルの周りのプラスチック領域にオートクレーブ滅菌した真空グリースを塗布します。

次に、グリースを塗った皿をボンネットの下のUVライトで滅菌します。次に、SAMのアリコートをフィブリノーゲンに混合し、混合物を摂氏37度に移しますが、2時間重合しません。解剖のために、70%エタノールで2つの3ウェルガラス解剖皿で鉗子を洗浄します。

次に、400マイクロリットルのDSSを4つのウェルにロードし、400マイクロリットルのSAMを1つのウェルにロードします。解剖皿は冷えた皿に保管してください。繁殖するハエのバイアルから、さまようことのない3番目の幼虫を含む培地をすくい取り、鉗子で最大7つを冷たいDSSの井戸に移します。

次に、幼虫を DSS がロードされた 4 つのウェルのうち 3 つに通して、それらを洗浄します。解剖されるまで、最後のウェルに残しておきます。DSSの4番目のウェルを使用して、きれいな細い鉗子のペアで幼虫の脳を解剖します。

定評のあるインサイドアウト法を使用してください。熟練度があれば、各幼虫は約30秒で処理できます。各解剖後、DSSで事前にすすいだ20マイクロリットルのピペットチップを使用して、約3マイクロリットルのDSSで脳をSAM充填ウェルに移します。

埋め込み手順のために最大7つの脳を準備します。脳を作業溶液に移した後、脳と培地を滅菌ペトリ皿の蓋に分注します。次に、抗生物質を含むSAMをさらに3.5マイクロリットル追加し、フィブリノーゲンを含む温かいSAM3.5マイクロリットルを追加します。

手技中は、フィブリノーゲンを含むSAM培地を37度に維持することが重要です。次に、同じピペットチップで優しくピペッティングして脳の周りに溶液を混合し、溶液の2マイクロリットルを吸引してガラス底皿のカバーガラスに堆積させます。次に、液滴に0.8マイクロリットルのトロンビンを加え、非常に迅速に混合して重合を初期化し、白く見えます。

次に、鉗子を使用して脳をそっと摘み取り、重合フィブリンマトリックスにセットします。トロンビンは、脳が飛沫に移された後、多くの手順を複雑にするので、お勧めできないと思います。必要に応じて脳の向きを変え、脳をできるだけカバーガラスに近づけて非常に優しく押します。

次に、重合したフィブリンの層を選び、マトリックスを分離させない小さく穏やかな動きで脳の上に折ります。重合フィブリンの層を血栓のさまざまな部分から脳上に折り続けて、脳を安定させます。次に、埋め込まれた脳に抗生物質を含む20マイクロリットルのSAMを沈着させて、トロンビンの活性を停止します。

この手順を使用して、ガラス底の皿に5〜6個の脳を埋め込むことを進めます。長期間のイメージングには、埋め込まれた脳を抗生物質を含む600マイクロリットルのSAMに浸します。次に、PTFEメンブレンをメディウムの上に置き、メンブレンの端を皿のグリースを塗った部分に貼り付けます。

短いアッセイの場合は、2ミリリットルのSAMを抗生物質で皿に満たし、脳を浸し、PTFEメンブレンの使用を省略します。上記の手順を用いて、時計ニューロンドライバーによって駆動される分子時計レポーターを発現する脳を明暗に同調させ、その後、外植片培養として調製した。長期培養は、暗くなる直前の明期にセットアップされました。

目的のニューロンを含むSUMスタックは、バックグラウンド減算後に測定されたニューロンに対応する領域の平均蛍光強度で作成されました。レポーター表現のリズム性を決定するために、最大エントロピースペクトル解析と手動検査の両方を使用しました。次に、同じ遺伝子型の幼虫を、主観的な夜明けの1時間後、または主観的な夕暮れの1時間後に解剖した。

脳を1時間以内に2回画像化し、ベースラインを取得しました。次に、PDFまたはビヒクルを培養培地に加え、脳を1時間ごとに6時間画像化しました。暗くなってから間もなく採取した脳では、LNvsのPER-TDT発現プロファイルは、PDFを添加すると蛍光強度が日単位に増加する時間を示しました。

これはDN1でも発生し、DN2ではそれほどではありませんでした。このビデオを見た後、フィブリンの3Dマトリックスを使用してショウジョウバエの幼虫からex vivo脳培養を行う方法についてよく理解できるはずです。一度習得すると、解剖から埋め込みまで、全体の手順に約30分かかります。

解剖を開始する前に、埋め込み直後に脳を画像化できるように、イメージングセットアップを準備します。この手順に続いて、成体のショウジョウバエの脳も、追加の質問に答えるために蛍光タイムラプスイメージング用に培養することができます。