磁気活性化細胞選別を用いたマウス脳脱髄病変からのミクログリアの単離

マウス脳の脳梁から染色された脱髄病変を解剖する。

これらの病変には、細胞表面インテグリン CD11b を発現する脳常在ミクログリアが含まれています。

組織を採取し、タンパク質分解酵素とDNaseを含む溶液を加えます。

酵素は細胞外マトリックスを分解し、DNaseは遊離DNAを分解します。

コールドバッファーを加え、懸濁液をストレーナーでろ過して細胞の塊を取り除きます。

遠心分離し、上清を廃棄し、ペレット化した細胞を密度勾配培地に再懸

バッファーと遠心分離機で重ねて、上層に残っている破片を回収します。無傷の細胞は底に沈殿します。

破片を取り除き、細胞をバッファーに再懸濁します。

抗CD11b磁気ビーズを加えてミクログリアを標識します。

磁気分離器の磁場に配置された強磁性球を含むカラムにセルをロードします。

外部磁場の下では、ビーズ結合したミクログリアがカラム内に保持され、結合していない細胞が流れます。

磁場からカラムを取り除きます。ミクログリアを溶出するためにバッファーを追加します。

脳梁周囲の中性色素で標識された病変を実体顕微鏡下で顕微解剖します。解剖した組織を300 x g で30秒間遠心分離し、チューブの底にサンプルを採取します。酵素ミックス1と酵素ミックスをインキュベーターで摂氏2〜37度に予熱します。次に、1,950マイクロリットルの予熱酵素ミックス1を1サンプルに加え、摂氏37度のインキュベーターで5分間消化します。30マイクロリットルの予熱酵素ミックス2を加え、穏やかに混ぜます。

消化後、4ミリリットルの冷たいPBSをチューブに加え、軽く振ってください。組織サンプルを摂氏4度で300 x g 10分間遠心分離し、上清をゆっくりと完全に吸引します。細胞ペレットを1,550マイクロリットルの冷たいPBSで穏やかに再懸濁します。破片除去用の冷たい溶液を450マイクロリットル加え、よく混ぜます。

1000マイクロリットルのピペットを使用して、混合物を2ミリリットルの冷たいPBSで非常にゆっくりと穏やかに重ねます。混合物を遠心分離してから、3つの層を探します。1000マイクロリットルのピペットを使用して2つの最上層を完全に吸引し、チューブに最大5ミリリットルのコールドローディングバッファーを充填します。チューブを3回ゆっくりと反転させます。

次に、上清を遠心分離して吸引した後、細胞ペレットを90マイクロリットルのローディングバッファーで再懸濁し、10マイクロリットルのCD11bビーズを加えます。よく混ぜて摂氏4度で15分間インキュベートします。インキュベーション後、1ミリリットルのローディングバッファーを加え、1000マイクロリットルのピペットで液体を上下に穏やかにピペッティングして細胞を洗浄します。

細胞を摂氏4:00度で300×gで10分間遠心分離し、上清を完全に吸引して結合していないビーズを除去します。細胞を500マイクロリットルのローディングバッファーに再懸濁し、MSカラムをセパレーターとともに磁場中でポジティブセレクションします。細胞を保護するために 500 マイクロリットルのローディングバッファーでカラムをすすぎ、メーカーのプロトコルに基づいて磁気選別の効率を確保します。

細胞懸濁液をMSカラムに塗布し、標識されていない細胞を含むフロースルーを廃棄します。500マイクロリットルのローディングバッファーを加えてカラムを洗浄し、セパレーターから取り出します。カラムを15ミリリットルの遠心分離管に置き、1ミリリットルのローディングバッファーをカラムに加えます。最後に、プランジャーをカラムの底に押し込み、磁気標識されたセルを洗い流します。