ラムダを選択cII変異検出システム

このプロトコルの全体的な目標は、トランスジェニックげっ歯類の培養細胞または目的の化学的および物理的薬剤で処理された対応する動物におけるLambda Select cII突然変異アッセイに関与する段階的な手順を視覚化することです。この試験方法は、試験化合物は変異原性ですか?もしそうなら、それはどのくらいの変異原性があるのでしょうか?

それは配列特異的な突然変異を誘導しますか?この技術の主な利点は、事実上あらゆる試験化合物に対して最小限であることです。この方法は、染色体に統合されたレポーター遺伝子を使用した哺乳類細胞の変異原性試験に使用できます。

1つのパッケージング反応を構成するには、最初の反応ミックスが入ったマイクロ遠心チューブに5マイクログラムのゲノムDNAを添加します。次に、チューブを摂氏30度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、12マイクロリットルの第2の反応混合物をチューブに加え、摂氏30度でさらに90分間放置します。

90分後、1.1ミリリットルのSMバッファーをチューブに加えます。次に、パッケージ化されたDNAを含むチューブを室温で約10秒間激しくボルテックスします。マイクロ遠心分離機で素早くパルススピンを与えます。

その後、使用するまでチューブを氷の上に置いておきます。次に、パッケージ化されたDNAのミリリットルごとに50マイクロリットルのクロロホルムを追加します。サンプルを同じ日に処理しない場合は、サンプルを穏やかにボルテックスし、摂氏4度で最大2週間保存します。

16本の滅菌丸底チューブと16枚のTB1寒天プレートを調製し、1つのパッケージDNAサンプルに使用します。スクリーニングには10本のチューブを使用し、力価測定には6本のチューブを使用します。次に、各丸底チューブに300マイクロリットルのG1250めっき培養物を分注します。

次に、力価を得るために、10マイクロリットルのパッケージ化されたDNAを990マイクロリットルのSMバッファーに添加し、1:100希釈します。次に、サンプルをボルテックスします。20マイクロリットルまたは100マイクロリットルの1:100DNA溶液を、それぞれ3本のタイター20またはタイター100チューブのそれぞれに加える。

スクリーニングのために、100マイクロリットルの希釈されていない包装DNAサンプルを10本のスクリーニングチューブのそれぞれに加えます。16本の力価チューブとスクリーニングチューブをすべて処理します。チューブを10秒間ボルテックスして、コンポーネントを混合します。

次に、チューブを室温で30分間インキュベートし、宿主の大腸菌がファージを吸収します。次に、2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天を追加します。摂氏55度を適切な力価とスクリーニングチューブに維持します。

追加後、すぐにチューブを優しくボルテックスします。次に、TB1寒天を適切な力価またはスクリーニングTB1寒天プレートに注ぎます。プレートを室温で15〜30分間放置します。

寒天が固まったら、10枚のスクリーニングプレートすべてを反転させ、摂氏24度の定置インキュベーターに46〜48時間放置します。残りの6つの力価プレートを摂氏37度の静止インキュベーターに一晩または1日放置します。摂氏37度でのインキュベーション後、3つの力価20および力価100のすべてのプレートに形成されたプラークの数を数えます。

摂氏24度でのインキュベーション後、10枚のスクリーニングプレートに形成されたプラークの数を数えます。putitive mutitant plaquesを確認するために、滅菌された広口径ピペットチップでプラークをコアにします。次に、プラークを500マイクロリットルの滅菌SMバッファーで満たされた滅菌マイクロ遠心チューブに移します。

次に、マイクロ遠心チューブを室温で室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、1マイクロリットルのコアードファージ溶液と200マイクロリットルのG1250プレーティング培養液を滅菌丸底チューブで混合します。次に、混合物を室温で30分間インキュベートします。

30分後、コアードファージ溶液を2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天培地にプレートし、摂氏24度で46〜48時間インキュベートします。二次プラークが見えたら、ピペットチップを使用して、十分に分離された単一のLambda cII変異プラークを選択します。プラークをピペットで25マイクロリットルの二重蒸留水で満たされたマイクロ遠心チューブに数回移します。

チューブを沸騰したお湯に5分間置きます。次に、チューブをGの18, 000倍で室温で3分間遠心分離します。遠心分離の直後に、10マイクロリットルの上清を40マイクロリットルのPCRマスターミックスを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。

PCR増幅後、PCR精製キットを使用して、cII遺伝子とその隣接領域を組み込んだ432塩基パラ増幅産物を精製します。次に、DNAアナライザーを使用してcII導入遺伝子の配列を決定し、突然変異を検出します。力価20と力価100の両方のプレートで得られたプラークは、白いライトボックスの隣に、暗い背景に対してそれらを保持することにより、はっきりと見えます。

ここで、棒グラフは、試験された物理化合物中のさまざまな化学物質の変異原性を示しています。これは、マウス胚性線維芽球から単離された相対的なcII変異体頻度の増加の程度を分析することによって行われます。棒グラフは、これらすべての試験試薬を示しており、cII変異体頻度が統計的に有意に増加しています。

次に、UVBを照射したマウス胚性線維芽球におけるcII導入遺伝子の変異スペクトルを実証する。円グラフは、対照と比較した場合、ピリミジンジヌクレオチドにおける単一またはタンデムシチジンからチミジンへの移行の相対頻度の有意な増加を示しています。一度習得すると、この技術は、培養中の細菌ストリークプレートの準備時間を除いて、適切に実行されれば8〜10時間で行うことができます。

DNAシーケンシングでは、cII変異体のスコアリングに続いて。このビデオを見れば、in vitroモデルシステムにおける試験化合物の突然変異解析の方法について十分に理解できるはずです。