ラムダを選択cII変異検出システム
April 26th, 2018
トランスジェニックげっ歯類の培養細胞でラムダを選択cII突然変異試験または興味の化学/物理エージェントで治療対応する動物のための詳しいプロトコルについて述べる。このアプローチは、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のため広く使用されています。
このプロトコルの全体的な目標は、トランスジェニックげっ歯類の培養細胞または目的の化学的および物理的薬剤で処理された対応する動物におけるLambda Select cII突然変異アッセイに関与する段階的な手順を視覚化することです。この試験方法は、試験化合物は変異原性ですか?もしそうなら、それはどのくらいの変異原性があるのでしょうか?
それは配列特異的な突然変異を誘導しますか?この技術の主な利点は、事実上あらゆる試験化合物に対して最小限であることです。この方法は、染色体に統合されたレポーター遺伝子を使用した哺乳類細胞の変異原性試験に使用できます。
1つのパッケージング反応を構成するには、最初の反応ミックスが入ったマイクロ遠心チューブに5マイクログラムのゲノムDNAを添加します。次に、チューブを摂氏30度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、12マイクロリットルの第2の反応混合物をチューブに加え、摂氏30度でさらに90分間放置します。
90分後、1.1ミリリットルのSMバッファーをチューブに加えます。次に、パッケージ化されたDNAを含むチューブを室温で約10秒間激しくボルテックスします。マイクロ遠心分離機で素早くパルススピンを与えます。
その後、使用するまでチューブを氷の上に置いておきます。次に、パッケージ化されたDNAのミリリットルごとに50マイクロリットルのクロロホルムを追加します。サンプルを同じ日に処理しない場合は、サンプルを穏やかにボルテックスし、摂氏4度で最大2週間保存します。
16本の滅菌丸底チューブと16枚のTB1寒天プレートを調製し、1つのパッケージDNAサンプルに使用します。スクリーニングには10本のチューブを使用し、力価測定には6本のチューブを使用します。次に、各丸底チューブに300マイクロリットルのG1250めっき培養物を分注します。
次に、力価を得るために、10マイクロリットルのパッケージ化されたDNAを990マイクロリットルのSMバッファーに添加し、1:100希釈します。次に、サンプルをボルテックスします。20マイクロリットルまたは100マイクロリットルの1:100DNA溶液を、それぞれ3本のタイター20またはタイター100チューブのそれぞれに加える。
スクリーニングのために、100マイクロリットルの希釈されていない包装DNAサンプルを10本のスクリーニングチューブのそれぞれに加えます。16本の力価チューブとスクリーニングチューブをすべて処理します。チューブを10秒間ボルテックスして、コンポーネントを混合します。
次に、チューブを室温で30分間インキュベートし、宿主の大腸菌がファージを吸収します。次に、2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天を追加します。摂氏55度を適切な力価とスクリーニングチューブに維持します。
追加後、すぐにチューブを優しくボルテックスします。次に、TB1寒天を適切な力価またはスクリーニングTB1寒天プレートに注ぎます。プレートを室温で15〜30分間放置します。
寒天が固まったら、10枚のスクリーニングプレートすべてを反転させ、摂氏24度の定置インキュベーターに46〜48時間放置します。残りの6つの力価プレートを摂氏37度の静止インキュベーターに一晩または1日放置します。摂氏37度でのインキュベーション後、3つの力価20および力価100のすべてのプレートに形成されたプラークの数を数えます。
摂氏24度でのインキュベーション後、10枚のスクリーニングプレートに形成されたプラークの数を数えます。putitive mutitant plaquesを確認するために、滅菌された広口径ピペットチップでプラークをコアにします。次に、プラークを500マイクロリットルの滅菌SMバッファーで満たされた滅菌マイクロ遠心チューブに移します。
次に、マイクロ遠心チューブを室温で室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、1マイクロリットルのコアードファージ溶液と200マイクロリットルのG1250プレーティング培養液を滅菌丸底チューブで混合します。次に、混合物を室温で30分間インキュベートします。
30分後、コアードファージ溶液を2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天培地にプレートし、摂氏24度で46〜48時間インキュベートします。二次プラークが見えたら、ピペットチップを使用して、十分に分離された単一のLambda cII変異プラークを選択します。プラークをピペットで25マイクロリットルの二重蒸留水で満たされたマイクロ遠心チューブに数回移します。
チューブを沸騰したお湯に5分間置きます。次に、チューブをGの18, 000倍で室温で3分間遠心分離します。遠心分離の直後に、10マイクロリットルの上清を40マイクロリットルのPCRマスターミックスを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。
PCR増幅後、PCR精製キットを使用して、cII遺伝子とその隣接領域を組み込んだ432塩基パラ増幅産物を精製します。次に、DNAアナライザーを使用してcII導入遺伝子の配列を決定し、突然変異を検出します。力価20と力価100の両方のプレートで得られたプラークは、白いライトボックスの隣に、暗い背景に対してそれらを保持することにより、はっきりと見えます。
ここで、棒グラフは、試験された物理化合物中のさまざまな化学物質の変異原性を示しています。これは、マウス胚性線維芽球から単離された相対的なcII変異体頻度の増加の程度を分析することによって行われます。棒グラフは、これらすべての試験試薬を示しており、cII変異体頻度が統計的に有意に増加しています。
次に、UVBを照射したマウス胚性線維芽球におけるcII導入遺伝子の変異スペクトルを実証する。円グラフは、対照と比較した場合、ピリミジンジヌクレオチドにおける単一またはタンデムシチジンからチミジンへの移行の相対頻度の有意な増加を示しています。一度習得すると、この技術は、培養中の細菌ストリークプレートの準備時間を除いて、適切に実行されれば8〜10時間で行うことができます。
DNAシーケンシングでは、cII変異体のスコアリングに続いて。このビデオを見れば、in vitroモデルシステムにおける試験化合物の突然変異解析の方法について十分に理解できるはずです。
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概要
このプロトコルは、遺伝子組み換えげっ歯類や様々な物質に暴露された動物の培養細胞における変異原性を評価するために使用されるLambda Select cII変異アッセイを概説しています。この方法は、試験化合物の変異原性ポテンシャルを理解するために重要です。
主要な研究要素
科学の分野
- 変異研究
- 遺伝毒性試験
- 発がん性評価
背景
- Lambda Select cII変異アッセイは広く認められた方法です。
- 化学物質や物理的物質の変異原性効果を評価します。
- このアッセイは染色体に組み込まれたレポーター遺伝子を使用します。
- 変異原のポテンシャルと特異性についての洞察を提供します。
研究の目的
- Lambda Select cII変異アッセイの手順を段階的に視覚化する。
- 試験化合物が変異原性であり、そのポテンシャルを判断する。
- 配列特異的変異の誘発を調査する。
使用された方法
- 遺伝子組み換えげっ歯類の培養細胞の利用。
- 対象となる化学物質や物理的物質への暴露。
- レポーター遺伝子を通じた変異原性の評価。
- アッセイ手順の段階的な視覚化。
主な結果
- このアッセイは変異原性化合物を効果的に同定します。
- 様々な試験物質のポテンシャルを示します。
- 配列特異的変異を分析できます。
- この方法は幅広い試験化合物に適応可能です。
結論
- Lambda Select cII変異アッセイは変異研究において貴重なツールです。
- 化合物の変異原性に関する重要なデータを提供します。
- このプロトコルは変異原性メカニズムの理解を深めます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
The Lambda Select cII mutation detection system enables quantitative assessment of mutagenic potential in mammalian cells, supporting early-stage genotoxicity screening in drug discovery. By measuring mutant frequency and spectrum, it provides mechanistic insights that help de-risk lead compounds before significant investment. This assay supports data-driven go/no-go decisions in preclinical development by identifying DNA-reactive agents with statistical confidence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of DNA damage mechanisms and functional validation of genotoxic risk in lead candidates.
- Operational Value: Provides a chromosomally integrated reporter system for consistent, reproducible mutation detection across cell types.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative mutant frequency data to rank-order mutagenic potency of test compounds.
- Operational Value: Delivers standardized plaque-based readouts compatible with high-throughput screening formats.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Characterizes mutation spectra (e.g., UVB-induced C→T transitions) to link mechanism to structural alerts.
- Operational Value: Supports cross-species extrapolation from transgenic rodent models to human relevance.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the genotoxicity testing cascade, informing early discovery through lead optimization by providing quantitative mutagenicity data prior to traditional assays like Ames or micronucleus.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on DNA repair pathways and mutagenic mechanism elucidation.
- Screening: Enables reproducible, quantitative scoring of mutant plaques for compound prioritization.
- Analytics: Delivers mutant frequency and spectrum data for structure-activity relationship modeling.
- Translational Research: Connects in vitro findings to in vivo mutagenicity via transgenic rodent models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for mutagenicity profiling across therapeutic areas and modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in genotoxic risk assessment through mutation spectrum analysis.
- Operational Value: Ensures assay reproducibility via standardized phage rescue and plating protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering mutagenic leads early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative mutagenicity thresholds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular biology, phage techniques, and DNA sequence analysis.
- Dependent on lambda phage packaging systems, bacterial host strains, and selective agar media.
- Necessitates cross-team standardization between discovery toxicology and analytical genomics groups.
- Adaptation considerations include varying transfection efficiencies across primary and immortalized cell lines.
- Practical limitations include multi-day workflow duration and sensitivity to genomic DNA quality and purity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:52
In Vitro Packaging Reaction
1:51
Plating the Packaged DNA Samples
3:36
Examination of the Titer and the Screening Plates to Determine the Putative cll Mutants, Verification of Mutant Plaques, PCR Amplification, and DNA Sequencing
5:31
Results: Use of λ Select cll Assay to Detect Mutations in the cll Transgenes from the Genomic DNA
6:31
Conclusion
