Name: ラムダを選択cII変異検出システム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: 学ぶLambda Select cII変異検出アッセイの段階的な手順。トランスジェニック齧歯類培養細胞を用いて化学・物理的因子の変異原性を評価し、遺伝毒性と発がん性のメカニズム解明に貢献します。

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すべての同僚の貢献と (説明のため) この原稿に呼ばれている、結果が私たちの元の研究に協力したいと思います。作家の作品は、国立歯科・頭蓋顔面研究、国立衛生研究所 (1R01DE026043) ab の AB (California Tobacco-Related 病研究プログラムの大学からの補助金によってサポートされてTRDRP-26IR-0015) および ST (TRDRP-25IP-0001)。研究のスポンサーには、研究デザイン、データ収集、データ分析、データ解釈、レポートの執筆、出版のために提出する決定の役割はなかった。

すべての著者は利益相反を宣言しません。

Λ 選択cIIアッセイは、3BB の齧歯動物の臓器・組織由来細胞のゲノム DNA から回復したcII遺伝子変異の検出に使用されます。これらの形質転換動物ゲノムには染色体統合 λLIZ シャトル ベクトルは、 cIIを運ぶ複数タンデム コピーが含まれます (294 bp) とラッチ(1,080 bp) 遺伝子変異レポーター遺伝子1,2,25. λ 選択cIIアッセイは、適切なホストを感染させることができる λ ファージの頭に救助されたベクトルの包装が続いて、トランスジェニック動物の細胞・組織のゲノム DNA から λLIZ シャトル ベクトルの検索に基づいて大腸菌。その後、感染した細菌が得点とcII遺伝子の突然変異の分析を許可する選択的な条件の下で栽培されて (<strong cla...

トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの広い範囲は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらの大きなブルー (以下 bb) トランスジェニック マウスと λ 選択cII変異検出システムで採用されている変異原性実験のためこのグループは、多くの他研究グループ世界中1,の2、 3,4,5,6,7,8,9。過去 16 年間、これらのトランスジェニック動物を用いた化学的および/または物理的な剤の変異原性の効果を調べたか、対応する胚性線維芽細胞培養テスト混合物と扱われ、その後の分析、λ 選択cIIアッセイおよび DNA の配列、それぞれ10、11,12,の13,14によってcII遺伝子の遺伝子型と表現型,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24. これらのトランスジェニック動物のゲノムに複数コピー頭-尾コンカテマー1,2,25, 染色体 4 統合バクテリオファージ λ シャトル ベクトル (λLIZ) が含まれています。ΛLIZ シャトルベクターを運ぶ 2 つの変異レポーター遺伝子、すなわち、ラッチとcII遺伝子1,2,25,26,27、 28,29,30,31,32,33,34,35,36、 37,38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. λ 選択cIIアッセイに基づいて λLIZ シャトル ベクトルのトランスジェニック動物1,2,25 の臓器・組織由来細胞のゲノム DNA からの回復.回復 λLIZ シャトル ベクトル、インジケーター ホスト大腸菌に感染可能な λ ファージの頭にパッケージ化されます。その後、感染した細菌は、得点とcII遺伝子1,3における変異解析を可能にする選択的な条件のもとで栽培しています。
ここ、体外治療トランスジェニック動物の細胞・臓器からゲノム DNA の隔離から成っている λ 選択cIIの試金のための詳しいプロトコルについて述べる/シャトル生体内でλLIZ の化合物は、取得テスト ベクトルgenomic DNA から、バクテリオファージ、 cIIの同定とホストエシェリヒア属大腸菌の感染感染 λ ファージにベクトルの包装- cIIの突然変異頻度を決定する選択的な条件の下で突然変異体とCII変異スペクトルを確立する dna 塩基配列解析。トランスジェニック マウス ・ ラット細胞培養体外興味の化学/物理エージェントに適用できるプロトコルまたは対応する動物の組織/臓器治療体内テスト化学/エージェント1、 2,4,48,49,50,51,52。Λ 選択cIIアッセイの図式を図 1に示します。

<table><tbody><tr><td>寒天</td><td>MOバイオラボラトリーズ(株)</td><td>12112-05</td><td>細菌学グレード</td></tr><tr><td>BigDye Terminator v3.1 サイクル シーケンシング キット</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>4337455</td><td>なし</td></tr><tr><td>カゼイン ペプトン</td><td>アルファ Aesar</td><td>H26557</td><td>なし</td></tr><tr><td>ゼラチン</td><td>J. T. Baker</td><td>2124-01</td><td>粉末</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>BP 229-1 / M-13750</td><td>なし</td></tr><tr><td>LB 寒天</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィック</td><td>BP 9724-500</td><td>なし</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット</td><td>Qiagen</td><td>8104</td><td>50 PCR精製反応</td></tr><tr><td>酢酸ナトリウム三水和物</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>M-15756</td><td>なし</td></tr><tr><td>Taq5000DNAポリメラーゼ&nbsp;</td><td>キアゲン</td><td>201207</td><td>なし</td></tr><tr><td>チアミン塩酸塩</td><td>マクロン ファインケミカルズ</td><td>2722-57</td><td>なし</td></tr><tr><td>トランスパック包装エキス</td><td>ストラタジーン社、バイオリライアンス社が買収 |シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>200223</td><td>50 包装反応</td></tr><tr><td>トリスベース</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP 152-1 / EC 201-064-4</td><td>なし</td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>バイオサイエンス</td><td>RC-110</td><td>なし</td></tr></tbody></table>

ラムダを選択cii変異検出システム

The Lambda Select cII Mutation Detection System

トランスジェニック動物モデルおよび突然変異検出システムの数は、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のために開発されています。これらのトランスジェニック マウスとラムダ (λ) の選択cII変異検出システム世界中の多くの研究グループによって変異原性実験のため採用されています。ここでは、ラムダを選択cII突然変異試験は、トランスジェニック マウス/ラットの培養細胞に適用することができるための詳しいプロトコルについて述べるまたは興味の化学/物理エージェントに対応する動物が扱われます。プロトコルは、次の手順で構成されます: (1) 分離細胞からゲノム dna やトランスジェニック動物の臓器・組織生体外でまたは生体内で、それぞれで治療テスト混合物;(ゲノム DNA からの (すなわち、 cII遺伝子) の変異レポーター遺伝子を運ぶラムダ シャトルベクターの回復 2)(伝染性のバクテリオファージに救助されたベクトルの包装 3)(4) ホストの細菌に感染して誘導cII突然変異の伝播を許可する選択的な条件下で培養(5) 得点cII-変異体と DNA シーケンスをそれぞれcII突然変異頻度および突然変異スペクトルを分析します。

データ ディストリビューションによってパラメトリックまたはノンパラのテストを使用して、処置および制御グループ (すなわち、自発の突然変異体の周波数対誘導) のcIIの突然変異頻度の違いの重要性を判断します.誘導cII変異周波数別の治療グループ間での比較が行われます各種 (一対)、適用可能な統計的テスト。Χ2テストや分散分析 (ANOVA) などの他のテストは、頻度を比較する使用できますがアダムスと Skopek の超幾何テストを使用して全体的な誘導および自発の突然変異のスペクトル57を比較一般(例えば遷移、意義、挿入、または削除) の突然変異誘導・制御の突然変異スペクトル間または異なる化学物質/エージェントまたは同じ用量の変化による様々 な突然変異スペクトル間のそれぞれの特定の種類の化学/エージェント。
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トランスジェニックげっ歯類の培養細胞でラムダを選択cII突然変異試験または興味の化学/物理エージェントで治療対応する動物のための詳しいプロトコルについて述べる。このアプローチは、哺乳類細胞における発がん性物質の変異原性試験のため広く使用されています。

ラムダを選択cII変異検出システム

A number of transgenic animal models and mutation detection systems have been developed for mutagenicity testing of carcinogens in mammalian cells. Of ...

このプロトコルの全体的な目標は、トランスジェニックげっ歯類の培養細胞または目的の化学的および物理的薬剤で処理された対応する動物におけるLambda Select cII突然変異アッセイに関与する段階的な手順を視覚化することです。この試験方法は、試験化合物は変異原性ですか?もしそうなら、それはどのくらいの変異原性があるのでしょうか?それは配列特異的な突然変異を誘導しますか?この技術の主な利点は、事実上あらゆる試験化合物に対して最小限であることです。この方法は、染色体に統合されたレポーター遺伝子を使用した哺乳類細胞の変異原性試験に使用できます。1つのパッケージング反応を構成するには、最初の反応ミックスが入ったマイクロ遠心チューブに5マイクログラムのゲノムDNAを添加します。次に、チューブを摂氏30度で90分間インキュベートします。インキュベーション後、12マイクロリットルの第2の反応混合物をチューブに加え、摂氏30度でさらに90分間放置します。90分後、1.1ミリリットルのSMバッファーをチューブに加えます。次に、パッケージ化されたDNAを含むチューブを室温で約10秒間激しくボルテックスします。マイクロ遠心分離機で素早くパルススピンを与えます。その後、使用するまでチューブを氷の上に置いておきます。次に、パッケージ化されたDNAのミリリットルごとに50マイクロリットルのクロロホルムを追加します。サンプルを同じ日に処理しない場合は、サンプルを穏やかにボルテックスし、摂氏4度で最大2週間保存します。16本の滅菌丸底チューブと16枚のTB1寒天プレートを調製し、1つのパッケージDNAサンプルに使用します。スクリーニングには10本のチューブを使用し、力価測定には6本のチューブを使用します。次に、各丸底チューブに300マイクロリットルのG1250めっき培養物を分注します。次に、力価を得るために、10マイクロリットルのパッケージ化されたDNAを990マイクロリットルのSMバッファーに添加し、1:100希釈します。次に、サンプルをボルテックスします。20マイクロリットルまたは100マイクロリットルの1:100DNA溶液を、それぞれ3本のタイター20またはタイター100チューブのそれぞれに加える。スクリーニングのために、100マイクロリットルの希釈されていない包装DNAサンプルを10本のスクリーニングチューブのそれぞれに加えます。16本の力価チューブとスクリーニングチューブをすべて処理します。チューブを10秒間ボルテックスして、コンポーネントを混合します。次に、チューブを室温で30分間インキュベートし、宿主の大腸菌がファージを吸収します。次に、2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天を追加します。摂氏55度を適切な力価とスクリーニングチューブに維持します。追加後、すぐにチューブを優しくボルテックスします。次に、TB1寒天を適切な力価またはスクリーニングTB1寒天プレートに注ぎます。プレートを室温で15〜30分間放置します。寒天が固まったら、10枚のスクリーニングプレートすべてを反転させ、摂氏24度の定置インキュベーターに46〜48時間放置します。残りの6つの力価プレートを摂氏37度の静止インキュベーターに一晩または1日放置します。摂氏37度でのインキュベーション後、3つの力価20および力価100のすべてのプレートに形成されたプラークの数を数えます。摂氏24度でのインキュベーション後、10枚のスクリーニングプレートに形成されたプラークの数を数えます。putitive mutitant plaquesを確認するために、滅菌された広口径ピペットチップでプラークをコアにします。次に、プラークを500マイクロリットルの滅菌SMバッファーで満たされた滅菌マイクロ遠心チューブに移します。次に、マイクロ遠心チューブを室温で室温で少なくとも2時間インキュベートします。次に、1マイクロリットルのコアードファージ溶液と200マイクロリットルのG1250プレーティング培養液を滅菌丸底チューブで混合します。次に、混合物を室温で30分間インキュベートします。30分後、コアードファージ溶液を2.5ミリリットルの溶融TB1トップ寒天培地にプレートし、摂氏24度で46〜48時間インキュベートします。二次プラークが見えたら、ピペットチップを使用して、十分に分離された単一のLambda cII変異プラークを選択します。プラークをピペットで25マイクロリットルの二重蒸留水で満たされたマイクロ遠心チューブに数回移します。チューブを沸騰したお湯に5分間置きます。次に、チューブをGの18, 000倍で室温で3分間遠心分離します。遠心分離の直後に、10マイクロリットルの上清を40マイクロリットルのPCRマスターミックスを含む新しいマイクロ遠心チューブに移します。PCR増幅後、PCR精製キットを使用して、cII遺伝子とその隣接領域を組み込んだ432塩基パラ増幅産物を精製します。次に、DNAアナライザーを使用してcII導入遺伝子の配列を決定し、突然変異を検出します。力価20と力価100の両方のプレートで得られたプラークは、白いライトボックスの隣に、暗い背景に対してそれらを保持することにより、はっきりと見えます。ここで、棒グラフは、試験された物理化合物中のさまざまな化学物質の変異原性を示しています。これは、マウス胚性線維芽球から単離された相対的なcII変異体頻度の増加の程度を分析することによって行われます。棒グラフは、これらすべての試験試薬を示しており、cII変異体頻度が統計的に有意に増加しています。次に、UVBを照射したマウス胚性線維芽球におけるcII導入遺伝子の変異スペクトルを実証する。円グラフは、対照と比較した場合、ピリミジンジヌクレオチドにおける単一またはタンデムシチジンからチミジンへの移行の相対頻度の有意な増加を示しています。一度習得すると、この技術は、培養中の細菌ストリークプレートの準備時間を除いて、適切に実行されれば8〜10時間で行うことができます。DNAシーケンシングでは、cII変異体のスコアリングに続いて。このビデオを見れば、in vitroモデルシステムにおける試験化合物の突然変異解析の方法について十分に理解できるはずです。

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Immunology and Infection

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ラムダを選択cII変異検出システム

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