Name: 作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: 学ぶカリウムイオン選択性微小電極の作製・校正法。マウス海馬切片を用いて神経興奮性とカリウム恒常性の機構を定量的に評価し、中枢神経系の生理学研究に応用可能な技術を習得する。

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Khakh ラボは、NIH の MH104069 によって支えられました。モディのラボは、NIH の NS030549 によって支えられました。J.C.O. は、NIH T32 神経回路トレーニング Grant(NS058280) のおかげでください。

すべての動物実験は、ケアと実験動物の使用のため国立の研究所に従って健康ガイドを実施し、カリフォルニア大学ロサンゼルス校で一等書記官の動物研究委員会によって承認されました。すべてのマウスは、12 h 光暗い環境で食料や水の利用可能な自由で収容されました。すべての動物は明らかな行動変化と健康だったが以前の研究に関与していない、ライト サイクルの犠牲になった。実験のデータは、成体マウス (6-8 週間すべての実験のために古い) から収集されました。
1 K+の選択的な電極の作製
<ol><li>ホウケイ酸ガラスのシリル化<ol>
<li>包装から十分なガラス管を取り外し、50 mL の円錐管に入れます。穏やかな撹拌一晩塩酸または最低 6 時間で 1 M 塩酸洗浄電極上部に円錐形の管を埋めます。</li>
		<li>70% エタノールで毛細血管を簡単に洗浄し、6-8 時間 100-120 ° C で完全に乾燥します。さらに使用する前に最大 4 週間の無水カルシウム硫酸塩の乾燥剤を容器に洗った毛細血管を格納します。</li>
		<li>シリル化、前に電極の引き手を使用してファインチップに毛細血管を引き出します。使用する電極は、直径約 2-5 ミクロンです。皮膚からオイルがシリル化を妨げることができます常に手袋で洗った毛細血管を処理します。</li>
		<li>電極が先端の破損を防ぐために下から上昇しているので、ガラスの容器に電極を配置します。オートクレーブ テープまたは同じような粘着テープを使用してコンテナーへ電極を修正します。</li>
		<li>窒素置換メソッドを使用して、そのコンテナーから 5 %dichlorodimethylsilane (DDS) シリル化ソリューションの約 0.5 mL を削除 (図 2参照)。窒素ガスで風船をいっぱい、バルーンにシリンジやチューブ、針を取り付けます。長い針を介して別の注射器に DDS を描きながら、DDS コンテナーに針を挿入します。</li>
		<li>ピペットの先端に滴下シリル化ソリューションを適用し、すぐにカバーします。シリル化ソリューションと電極に予め温めておいた (170-180 ° C) 実験室のオーブンに 10-12 時間または保持 200-220 ° C で 30 分のコンテナーを配置します。</li>
		<li>、孵化後は、オーブンを切りオーブンからプレートを削除します。非常に暑いので、インキュベーターからプレートを削除する注意してください。クールをガラスに 10-15 分間室温でベンチにプレートを配置します。</li>
		<li>(テープをカットするかみそりの刃やメスの刃を使用して) プレートから、電極を削除と乾燥剤充填密閉容器にそれらを置きます。水分の自由保たれるシラン処理電極は、シリル化、次まで 1 週間使用できます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>電極をプライミング<ol>
<li>K+イオノフォア カクテルの貯蔵液の準備: 5 %w/v バリノマイシン、93 %v/v 1, 2-ジメチル-3-ニトロ ベンゼン、2 w/v カリウム tetrakis(4-chlorophenyl) ホウ酸11。このソリューションは、かすかな黄色の色です。室温の気密、不透明な容器にしてください。正しく保存されているこのソリューションが数ヶ月を持続できます。</li>
		<li>10 mM HEPES 緩衝 pH 7.4 で 300 mM の NaCl の原液を準備します。クランプとバックフィルに注射器に接続されている 28 G microfil の先端を使用してバッファーの NaCl で電極を固定します。食塩が電極先端の終わりに達したことを確認します。電極は電流の流れを妨げる大きな泡の無料を確認します。</li>
		<li>電極の先端を約 10-20 μ m、メスやかみそりの刃の鈍側を使用して、幅に分割します。</li>
		<li>マイクロ ピペットを使用して、微小電極の先端の近くの K+イオノフォアの小さな液滴 (~0.1 μ l) を適用します。電極が正しく処理されている場合、壊れた先端に液滴が吸収されます。塗りつぶし K+イオノフォアと過剰な削除 1-2 mm の電極は、ティッシュ ペーパーを使用してください。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 K+の選択的な電極の校正
<ol><li>校正溶液の調製<ol>
<li>KCl 塩化ナトリウムに置き換えて等しい浸透圧人工髄液 (アプライド) KCl の様々 な濃度の溶液を準備します。電極校正用 0.1、1、10 および 100 ミリメートル K+アプライド、4.5 を使いました。表 1にこれらの校正ソリューションのレシピのとおりです。</li>
	</ol>
</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td rowspan="2">化学</td>
			<td>MW</td>
			<td rowspan="2">最終的な mM</td>
			<td rowspan="2">0.1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">1 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">4.5 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">10 mM [K +]</td>
			<td rowspan="2">100 mM [K +]</td>
		</tr>
<tr>
<td>(g/mol)</td>
		</tr>
<tr>
<td>塩化ナトリウム</td>
			<td>58.44</td>
			<td>異なります</td>
			<td>1.51 g</td>
			<td>1.50 g</td>
			<td>1.44 g</td>
			<td>1.4 g</td>
			<td>0.345 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
			<td>在庫 1 M</td>
			<td>異なります</td>
			<td>20 μ l</td>
			<td>200 μ l</td>
			<td>900 μ l</td>
			<td>2 ml</td>
			<td>20 ml</td>
		</tr>
<tr>
<td>CaCl2
</td>
			<td>在庫 1 M</td>
			<td>2</td>
			<td colspan="5">400 μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2
</td>
			<td>在庫 1 M</td>
			<td>1</td>
			<td colspan="5">200 μ l</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaH2PO4
</td>
			<td>119.98</td>
			<td>1.2</td>
			<td colspan="5">0.29 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaHCO3
</td>
			<td>84.01</td>
			<td>26</td>
			<td colspan="5">0.437 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>D-グルコース</td>
			<td>180.16</td>
			<td>10</td>
			<td colspan="5">0.360 g</td>
		</tr>
<tr>
<td>水</td>
			<td colspan="7">品質 200 ml</td>
		</tr>
</tbody></table>表 1。カリウム校正ソリューション
<ol start="2"><li>電極校正<ol>
<li>実験を開始する前に、少なくとも 20 分間 95% O25% CO2とすべてのソリューションをバブルします。4.5 mM [K+] と一緒にお風呂を灌開始 3 mL/分の速度でアプライド。マニピュレーターを電極パッチアンプ用アダプターに接続されている電極ホルダーに K+電極を配置します。このパッチアンプ用アダプターは、適切なアンプに接続されます。浴液に電極の先端を挿入します。</li>
		<li>銀/塩化銀接地電極は同じソリューションに包まれて流れが安定したことを確認します。段階的校正ソリューションを適用し、電極先端部にわたって mV の電位変化を記録します。次の解決策に切り替える前に安定した値に達するまで電極先端部の電位を待つ</li>
		<li>電極先端部に校正ソリューションのアプリケーションへの応答の定常電圧変化を測定します。電極の応答の斜面が少なくとも 52 と 58 を超えないことを確認 [K+] のログ変更ごとの mV。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 急性海馬脳スライスの準備
<ol><li>スライス溶液の調製<ol>
<li>500 mL のショ糖を準備切削ソリューションから成る: 194 mM ショ糖、30 mM の NaCl、4.5 mM KCl、10 mM 1 mM MgCl2D-グルコース、1.2 mM NaH2PO4と 26 mM NaHCO395% O2と 5% CO2飽和 290 300 mOsm。</li>
		<li>構成されてレコーディング ソリューション (アプライド) の 1-2 リットルを準備: 124 mM の NaCl、4.5 mM KCl、1 mM MgCl2、10 mM D-グルコース、CaCl22 mM、1.2 mM NaH2PO4と 26 mM NaHCO3;pH 7.3 7.4 (バブル) 後、95% O2と 5% CO2飽和 290 300 mOsm。録音ソリューションと脳スライス ホルダー チャンバーを含むビーカーを記入し、32-34 ° c. でそれを維持Vibratome のチャンバーを氷-水の秘密を持つ。</li>
	</ol>
</li>
	<li>急性スライス標本<ol>
<li>深く 2-3 mL イソフルランとプリチャージ ベルジャーにそれを置くことによってマウスを麻酔します。つま先ピンチ反射確認し、場合非対応で急速に首を切る鋭いハサミやギロチンのペアを使用して動物のプロトコルを必要とします。</li>
		<li>正中線に沿って頭皮をカットする頭蓋骨の尾の部分からはさみを使用して 2-3 cm の切開を行います。頭皮を手動で取り消す中、2 1 cm 水平切開辺後頭孔から頭蓋を作る。その後、切開鼻に頭蓋の後部から正中線に沿って、頭蓋骨の長さをカット良い鋏を使用しています。</li>
		<li>正中線近くに挿入された微細鉗子を使用して、2 つの部分で切開頭蓋骨リトラクトします。頭蓋骨からマウスの脳を抽出し、小脳や脳の尾側と吻側部分にそれぞれ位置する嗅球を削除するブレードを使用します。これらは、皮質からそれらを分ける大きな亀裂によって識別することができます。</li>
		<li>スーパー接着剤を使用して vibratome トレーに頭脳のブロックをマウントします。氷冷切削ソリューションで vibratome トレイを埋めます。</li>
		<li>300 μ m の厚みでコロナの平面の組織切片をカットします。通常 6 コロナ海馬スライスを収集できます。</li>
		<li>各セクションをカットすると後は、すぐにビーカー 32 から 34 ° C に加温を保持しているスライスにスライスを転送します。セクションを含むビーカーを削除する前に 20 分間この温度でセクションを維持し、記録する前に、少なくとも 20 〜 30 分の室温でこれを置きます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 電気的誘発 K+のダイナミクス計測
<ol><li>スライス標本を設定<ol>
<li>浴をパスツール ピペットを用いた脳スライスをそっと置き、ナイロン弦とプラチナ ハープの場所に押し当ててください。</li>
		<li>双極刺激電極の先端が互いに平行で、スライスの面でレベルを確認します。ゆっくりと、6-7 秒のコースで、電極に挿入 CA3 地層結腸寄生虫約 40-50 μ m シャファー側枝を刺激する深い。コロナ セクションの CA3 約で識別できる適切な外側の海馬海馬の膝で顆粒細胞の層の部分の地層結腸寄生虫内側腹側錐体細胞層に落下します。</li>
		<li>K+を慎重に挿入-CA1 地層結腸寄生虫約 50 μ m ゆっくり約 3-4 秒間に電極を下げることによって、深部に電極。刺激をスライスに適用する前に電極間で安定する可能性を許可する: これは通常 5 ~ 10 分かかります。スライスを表わす自発場合細胞外 K+の変化は、破棄し、新しいスライスと、このプロセスを繰り返します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>メジャー誘発 K+リリース<ol>
<li>手動で応答をデジタル記録中刺激でトリガーを押すことによって電気刺激 (8 パルス) の列車を適用します。10 Hz と 10 μ A 刺激振幅から始まる 1 ms のパルス幅で刺激を適用します。</li>
		<li>最大 K+応答振幅が検出されるまで、2 の要因によって増加の刺激振幅を適用します。任意の応答がない場合は、100 μ m 単位で刺激サイトに近い K+電極の位置を移動します。</li>
		<li>半分の最大応答を生成する刺激の振幅を決定します。我々 の経験で、これは準備の質、動物と刺激電極と K+電極間距離の年齢に応じて 40 160 μ A の間です。</li>
		<li>同じスライスの半分の最大応答を生成する振幅より一段低いで刺激の振幅を使用して (例えば 80 μ A は、半最大応答を生成する場合は、40 μ A を使用して) のパルス数を増加させる刺激列車を適用。当初は、1、2、4、8、16、32、64、128 パルスの列車を使用しています。</li>
		<li>K+の信号は電気的刺激シャファー担保風呂の活動電位発火によって仲介されることを確認するには、10 分間 0.5 μ M アプライドの TTX を適用し、刺激プロトコルを繰り返します。換起された応答を観察しない必要があります。</li>
		<li>スライス実験を終えて確認電極は、再校正ソリューションで電極のキャリブレーションによってその感度を維持しているし、初期の校正から 10% 以上も逸脱していないが応答を確保します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

著者が明らかに何もありません。

ここで説明するメソッドを使用して、K+大人のマウスから急性海馬スライスでシャファー側枝の電気刺激に対する応答のダイナミクスを評価するためができました。K+イオン選択的な電極を準備するための手法は、以前記載されている手順12,13,14,15に似ています。ただし、このメソッドでは、迅速であり、K+の選択的な電極を準備するために複雑で、代替電極構成上の利点をします。適切な校正後しっかり電気刺激中にスライスの K+のダイナミクスを測定するこれらの電極が見つかりました、そのような応答は TTX によってブロックされました。これらの実験では 10 Hz で 80 160 uA の刺激は使用された;ただし、特定の実験のため、興味の脳領域の刺激条件の最適化が必要になります。これらの値は、ガイドとして表示されます...

カリウム イオンの濃度が脳内で堅く調整され、それらの変動はすべての細胞の静止膜電位に強力な影響を及ぼします。これらの重要な貢献の観点から、生物学の重要な目標は、1体のさまざまな器官の細胞外スペースでしっかりと K+の濃度を調節するために使用する細胞および生物物理学的メカニズムを決定することです。,2。 これらの研究で重要な要件は、K+濃度を正確に測定する能力。健康と病気の状態では、脳でカリウムの恒常性に貢献する多くのコンポーネントされているが、識別された3,4、5、さらに進行中の専門にされた性質のため抑制されていますカリウム測定用イオン選択性電極の準備。電極センサーを表す K+濃度の in vitro組織スライスのin vivo測定のゴールド スタンダード。
監視 K+のための新しいアプローチがしかし、これらは生物学的関連性の高い範囲の K+濃度を検出しないまたはない吟味されている完全に生体が光センサーを使用して開発中の最初の結果有望な6,7,8が表示されます。光センサーと比較して、電極、電極アレイ9空間分解能を向上させることが根本的にイオンの点光源測定に限定。K+の動態を監視するため銃身の単一電極センサーについて説明します。
この仕事で K+の選択的な電極、高選択的許可バリノマイシン ベース カリウム イオノフォアを使用して (104倍 K+ Na+選択性) をする段階的な手順の詳細は報告する K+膜10を移動します。自然に発生するポリペプチド、バリノマイシンは K+透水性孔として機能し、それの電気化学的勾配を K+の流れが容易になります。電極を調整する方法についても述べる保存し、それらを使用する方法、最後に大人のマウスから急性海馬脳スライスの K+濃度動態を測定するための展開方法について。特定のイオン チャネル細胞外 K+のダイナミクスを規制する提案を持たない遺伝子改変マウスと共にそのような電極を使用する必要があります K の大気中濃度を制御する神経系によって使用される細胞メカニズムを明らかにします。+細胞外の環境の中で。

<table><tbody><tr><td>ビブラトーム</td><td>DSK</td><td>マイクロスライサー Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>マウス C57BL/6NTac 近交系マウス</td><td>タコニック</td><td>ストック#B6</td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>オリンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>電極プーラー</td><td>サッター</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl 粉砕ペレット</td><td>WPI</td><td>EP2</td><td></td></tr><tr><td>pCLAMP10.3</td><td>分子デバイス</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>カスタムマイクロフィル28Gチップ</td>世界の<td>精密機器</td><td>CMF28G</td><td></td></tr><tr><td>タングステンロッド</td><td>AMシステム</td><td>716000</td><td></td></tr><tr><td>バイポーラ刺激電極</td><td>FHC</td><td>MX21XEW(T01)</td><td></td></tr><tr><td>刺激アイソレータ</td><td>世界の精密機器</td><td>A365</td><td></td></tr>グラス<tr><td>S88刺激装置</td><td>グラスインスツルメンツカンパニーS88</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ホウケイ酸ガラスピペット</td><td>世界の精密機器</td><td>1B150-4</td><td></td></tr><tr><td>AからDボード</td><td>Digidata 1322A</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>信号増幅器</td><td>マルチクランプ 700Aまたは700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>Headstage</td><td>CV-7B Cat 1</td><td>Axon Instruments</td><td></td></tr><tr><td>パッチコンピュータ</td><td>Dell</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5886</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カリウム</td><td>シグマ</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>シグマ</td><td>H3375</td><td></td></tr>重<tr><td>炭酸ナトリウム</td><td>シグマ</td><td>S5761</td><td></td></tr>リン酸<tr><td>ナトリウム一塩基性</td><td>シグマ</td><td>S0751D</td><td></td></tr><tr><td>-グルコース</td><td>シグマ</td><td>G7528</td><td></td></tr>塩化<tr><td>カルシウム</td><td>シグマ</td><td>21108</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>シグマ</td><td>M8266</td><td></td></tr>バリ<tr><td>ノマイシン</td><td>シグマ</td><td>V0627-10mg</td><td></td></tr><tr><td>1,2-ジメチル-3-ニトロベンゼン</td><td>シグマ</td><td>40870-25ml</td><td></td></tr><tr><td>カリウムテトラキス(4-クロロフェニル)ホウ酸</td><td>シグマ</td><td>60591-100mg</td><td></td></tr><tr><td>ヘプタン中の5%ジメチルジクロロシラン</td><td>シグマ</td><td>85126-5ml</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>ケイマン化学会社</td><td>14964</td><td></td></tr><tr><td>塩酸</td><td>Σ</td><td>H1758-500mL</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Σ</td><td>S9378-5kg</td><td></td></tr><tr><td>ピペット マイクロマニピュレーター</td><td>サッター</td><td>MP-285/ROE-200/MPC-200</td><td></td></tr><tr><td>対物レンズ</td><td>オリンパス</td><td>PlanAPO 10xW</td><td></td></tr></tbody></table>

作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

Making, Testing, and Using Potassium Ion Selective Microelectrodes in Tissue Slices of Adult Brain

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、そのため、細胞外の K+濃度は細胞興奮性の重要な調節因子。活動電位の根底にある電位依存性イオン チャネルのクローズ、オープン、不活化状態間の平衡をシフトすることによって静止膜電位および細胞内興奮性細胞外の K+影響の濃度を変更発生と伝導。したがって、健康と病気にかかった状態で細胞外の K+のダイナミクスを直接測定する貴重なです。ここでは、確認、調整および単極 K+を使用する方法について述べる-選択的な電極。我々 は電気的誘発 K+濃度動態を測定する成体海馬スライスで展開します。そのような電極の賢い使用は神経系における細胞外の K+の濃度を制御する細胞および生物物理学的メカニズムを評価するために必要なツール キットの重要な部分です。

細胞外 K+の選択的測定のきれいなホウケイ酸ガラス ピペット (図 1 a) のシリル化による疎水性の層で被覆されたイオン選択性電極を作製しました。このコーティングにより、バリノマイシン電極の先端に置き、電極先端 (図 1 b) の狭い開口部を通って K+フラックスのみを許可するを含む K+イオノフォアです。埋食塩と K+イオノフォア電極をプライミング後バス K+濃度 (図 3 a) の段階的な変化に彼らの急速なと線形応答への応答として、電極はテストできます。バス K+は、生理食塩水の調整範囲内 (図 3 b) で変更またはネルンスト式2によって予測された方法...

カリウム イオンは細胞の静止膜電位に貢献し、細胞外の K+濃度細胞興奮性の重要な調節因子であります。確認、調整、モノポーラ K+を使用する方法について説明-選択的な電極。そのような電極を使用すると、大人の海馬スライスにおける電気的誘発 K+濃度動態の測定ができます。

Potassium ions significantly contribute to the resting membrane potential of cells and, therefore, extracellular K+ concentration is a crucial regulator ...

この技術の全体的な目標は、モノポーラカリウムイオン選択性微小電極を作製、較正、および使用することです。このような電極を用いることで、成体の脳切片における誘発カリウムイオン濃度ダイナミクスの定量的評価が可能になります。この方法は、中枢神経系におけるカリウムイオン恒常性の細胞および分子メカニズムの特定など、生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、マイクロ電極センサーが簡単でわかりやすい製造方法であることに加えて、カリウムイオン濃度の測定のゴールドスタンダードであることです。ホウケイ酸ガラスキャピラリーをシラン化するために調製するには、50ミリリットルの円錐管に入れます。円錐管に1モルの塩酸を充填し、ガラスキャピラリーを塩酸で一晩静かに攪拌しながら、最低6時間インキュベートします。その後、毛細血管を70%エタノールで短時間すすぎ、摂氏100〜120度で6〜8時間完全に乾燥させます。洗浄した毛細血管は、無水硫酸カルシウム乾燥剤の入った容器に最大4週間保管してから使用してください。シラン化する前に、微小電極プーラーを使用してキャピラリーを細い先端に引っ張ります。次に、オートクレーブテープを使用してガラス容器に微小電極を入れ、電極が下から持ち上げられて先端の破損を防ぎます。次に、約0.5ミリリットルの5%DDSシラン化溶液を窒素置換法で容器から取り出します。バルーンに窒素ガスを入れ、シリンジまたはチューブと針をバルーンに取り付けます。次に、長い針を介してDDSを別のシリンジに引き込みながら、針をDDS容器に挿入します。その後、シラン化溶液をピペットの先端に滴下し、すぐに容器を覆います。シラン化溶液を含む微小電極を保持している容器を、摂氏170〜180度で10〜12時間、または摂氏200〜220度で30分間、予熱した実験室オーブンに入れます。インキュベーション後、プレートをオーブンから取り出します。プレートを室温のベンチに10〜15分間置き、ガラス器具を冷まします。微小電極をプレートから取り外し、乾燥剤を充填した密閉容器に入れます。シラン化微小電極は、水分を含まない状態に保たれ、シラン化後最大1週間使用できます。電極をプライミングするには、カリウムイオノフォアカクテルのストック溶液を調製し、室温で気密性の高い不透明な容器に保管します。次に、pH 7.4の10ミリモルHEPES緩衝300ミリモル塩化ナトリウムのストック溶液を調製します。電極をクランプに固定します。その後、鈍器を使用して、電極の先端を約10〜20マイクロメートルの幅にすくい取り、次に、シリンジに接続された28ゲージのMicroFilチップを使用して、電極にHEPES緩衝塩化ナトリウムを埋め戻します。生理食塩水が微小電極の先端の端に達していることを確認し、微小電極に電流の流れを妨げる可能性のある大きな気泡がないことを確認します。マイクロピペットを使用して、マイクロ電極の先端近くにカリウムイオノフォアを少量滴下します。電極が適切にシラン化されている場合、液滴は壊れた先端に吸収されます。電極にイオノフォアカリウムを約1mm充填し、ティッシュペーパーを使用して余分なものを取り除きます。微小電極をキャリブレーションするには、実験を開始する前に、すべてのキャリブレーション溶液とスライスバッファー溶液を95%酸素/5%二酸化炭素で少なくとも20分間泡立てます。4.5ミリモルのカリウムイオン含有ACSFを毎分3ミリリットルの割合で浴に灌流し始めます。カリウムイオン選択性電極を、マニピュレータの電極ヘッドステージに取り付けられた電極ホルダーに入れます。次に、電極の先端をバス灌流液に挿入します。銀/塩化銀接地電極が同じ溶液に浸され、流れが安定していることを確認します。キャリブレーション溶液を段階的に塗布し、電極先端の電位変化をミリボルト単位で記録します。電極先端の電位が安定した値に達するのを待ってから、次のソリューションに切り替えます。次に、電極チップへのキャリブレーション溶液の塗布に応じた定常状態の電圧変化を測定します。電極電圧応答の傾きが、カリウム濃度の10倍の変化ごとに少なくとも52、59ミリボルト以下であることを確認します。海馬スライスを準備するには、頭蓋骨の尾側部分から2〜3センチメートルの切開を行い、正中線に沿って頭皮を切断します。手動で頭皮を引っ込めながら、頭蓋骨の側面に沿って大孔から1センチメートルの水平切開を2回行います。次に、細かい鋏を使用して、頭蓋骨の後ろから鼻まで正中線に沿って切開します。次に、正中線の近くに細い鉗子を挿入し、切開した頭蓋骨を2つに引っ込めます。頭蓋骨からマウスの脳を取り出し、ブレードを使用して、脳の尾側と吻側にある小脳球、前頭前野球、嗅球をそれぞれ取り除きます。次に、瞬間接着剤を使用して脳ブロックをビブラトームトレイに取り付けます。ビブラトームトレイに氷冷した切断液を入れます。その後、冠状平野の組織切片を300マイクロメートルの厚さで切断します。通常、4〜6個の冠状海馬スライスを収集できます。各セクションをカットした後、すぐにスライスを摂氏32〜34度に温めたスライス保持ビーカーに移します。この温度で20分間保持してから、ビーカーとセクションを少なくとも20〜30分間室温に移してから、録音します。カリウムイオンのダイナミクスを測定するには、パスツールピペットを使用して脳のスライスを浴にそっと置き、ナイロン弦付きのプラチナハープで静かに所定の位置に保持します。バイポーラ刺激電極の先端が互いにほぼ平行で、スライスのプレーンと同じ高さであることを確認してください。5〜7秒かけて、電極を約40〜50マイクロメートルの深さのCA3層ラジアタムにゆっくりと挿入し、Schafferの担保を刺激します。次に、カリウムイオン選択性電極をCA1層の半径状に約50μmの深さまで、電極を約3〜4秒かけてゆっくりと下げて慎重に挿入します。電極全体で電位が安定するのを待ってから、スライスに刺激を加える必要があります(通常は5〜10分かかります)。スライスが細胞外カリウムイオン濃度の過度の自発的変化を示す場合は、廃棄し、新しいスライスでプロセスを繰り返します。誘発されたカリウムイオンの放出を測定するには、刺激アイソレータを介して一連の電気刺激を加えながら、応答をデジタルで記録します。10 マイクロアンペアの刺激振幅から開始して、1 パルスあたり 10 ヘルツと 1 ミリ秒で刺激を適用します。最大カリウム応答振幅が検出されるまで、刺激振幅を2倍に増やします。応答が観察されない場合は、カリウムイオン選択電極の位置を100マイクロメートル刻みで刺激部位に近づけます。カリウムイオン濃度の変化が電気的に活性化されたシェーファー担保の活動電位発火によって媒介されることを確認するために、ACSFに0.5マイクロモルTTXを10分間適用し、刺激プロトコルを繰り返します。誘発された反応は観察されるべきではありません。.埋め戻されたHEPES緩衝生理食塩水とカリウムイオノフォアで電極をプライミングした後、電極は、バスカリウムイオン濃度の段階的な変化に対する迅速な応答と、ネルンスト方程式によって予測される方法で0.1〜100ミリモルのキャリブレーション範囲でのバスカリウムイオンの変化に対する線形応答をテストできます。定常状態の電位は、ラインの傾きを決定するために、バスのカリウムイオン濃度に対してプロットでき、これは約V 58.2ミリボルトで、カリウムイオン濃度の10倍の変化あたり52ミリボルト以上である必要があります。カリウム選択性電極の応答性をさらに試験し、カリウムの5.5ミリモルの増加に対する応答が、約85ミリ秒の上昇および減衰時間定数で観察されました。刺激電極とカリウムイオン選択性電極を組織に配置し、記録が安定したベースラインに達すると、電流振幅が増加するパルスを印加できます。この活性の波形は、指数関数的な崩壊率を伴うカリウムの急激な増加として現れますが、これはTTXの適用で廃止されます。このテクニックを習得すると、注意深く正確に実行すれば、約3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、正確な記録を可能にするために電極の先端をできるだけ小さく保ち、低ノイズを可能にするのに十分な大きさに保つことを忘れないでください。

making-testing-using-potassium-ion-selective-microelectrodes-tissue

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウムイオン選択的な電極を使用して

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