作成、テスト、および成人の脳の切片でカリウム イオン選択的な電極を使用して

この技術の全体的な目標は、モノポーラカリウムイオン選択性微小電極を作製、較正、および使用することです。このような電極を用いることで、成体の脳切片における誘発カリウムイオン濃度ダイナミクスの定量的評価が可能になります。この方法は、中枢神経系におけるカリウムイオン恒常性の細胞および分子メカニズムの特定など、生理学における重要な質問に答えるのに役立ちます。

この技術の主な利点は、マイクロ電極センサーが簡単でわかりやすい製造方法であることに加えて、カリウムイオン濃度の測定のゴールドスタンダードであることです。ホウケイ酸ガラスキャピラリーをシラン化するために調製するには、50ミリリットルの円錐管に入れます。円錐管に1モルの塩酸を充填し、ガラスキャピラリーを塩酸で一晩静かに攪拌しながら、最低6時間インキュベー

その後、毛細血管を70%エタノールで短時間すすぎ、摂氏100〜120度で6〜8時間完全に乾燥させます。洗浄した毛細血管は、無水硫酸カルシウム乾燥剤の入った容器に最大4週間保管してから使用してください。シラン化する前に、微小電極プーラーを使用してキャピラリーを細い先端に引っ張ります。

次に、オートクレーブテープを使用してガラス容器に微小電極を入れ、電極が下から持ち上げられて先端の破損を防ぎます。次に、約0.5ミリリットルの5%DDSシラン化溶液を窒素置換法で容器から取り出します。バルーンに窒素ガスを入れ、シリンジまたはチューブと針をバルーンに取り付けます。

次に、長い針を介してDDSを別のシリンジに引き込みながら、針をDDS容器に挿入します。その後、シラン化溶液をピペットの先端に滴下し、すぐに容器を覆います。シラン化溶液を含む微小電極を保持している容器を、摂氏170〜180度で10〜12時間、または摂氏200〜220度で30分間、予熱した実験室オーブンに入れます。

インキュベーション後、プレートをオーブンから取り出します。プレートを室温のベンチに10〜15分間置き、ガラス器具を冷まします。微小電極をプレートから取り外し、乾燥剤を充填した密閉容器に入れます。

シラン化微小電極は、水分を含まない状態に保たれ、シラン化後最大1週間使用できます。電極をプライミングするには、カリウムイオノフォアカクテルのストック溶液を調製し、室温で気密性の高い不透明な容器に保管します。次に、pH 7.4の10ミリモルHEPES緩衝300ミリモル塩化ナトリウムのストック溶液を調製します。

電極をクランプに固定します。その後、鈍器を使用して、電極の先端を約10〜20マイクロメートルの幅にすくい取り、次に、シリンジに接続された28ゲージのMicroFilチップを使用して、電極にHEPES緩衝塩化ナトリウムを埋め戻します。生理食塩水が微小電極の先端の端に達していることを確認し、微小電極に電流の流れを妨げる可能性のある大きな気泡がないことを確認します。

マイクロピペットを使用して、マイクロ電極の先端近くにカリウムイオノフォアを少量滴下します。電極が適切にシラン化されている場合、液滴は壊れた先端に吸収されます。電極にイオノフォアカリウムを約1mm充填し、ティッシュペーパーを使用して余分なものを取り除きます。

微小電極をキャリブレーションするには、実験を開始する前に、すべてのキャリブレーション溶液とスライスバッファー溶液を95%酸素/5%二酸化炭素で少なくとも20分間泡立てます。4.5ミリモルのカリウムイオン含有ACSFを毎分3ミリリットルの割合で浴に灌流し始めます。カリウムイオン選択性電極を、マニピュレータの電極ヘッドステージに取り付けられた電極ホルダーに入れます。

次に、電極の先端をバス灌流液に挿入します。銀/塩化銀接地電極が同じ溶液に浸され、流れが安定していることを確認します。キャリブレーション溶液を段階的に塗布し、電極先端の電位変化をミリボルト単位で記録します。

電極先端の電位が安定した値に達するのを待ってから、次のソリューションに切り替えます。次に、電極チップへのキャリブレーション溶液の塗布に応じた定常状態の電圧変化を測定します。電極電圧応答の傾きが、カリウム濃度の10倍の変化ごとに少なくとも52、59ミリボルト以下であることを確認します。

海馬スライスを準備するには、頭蓋骨の尾側部分から2〜3センチメートルの切開を行い、正中線に沿って頭皮を切断します。手動で頭皮を引っ込めながら、頭蓋骨の側面に沿って大孔から1センチメートルの水平切開を2回行います。次に、細かい鋏を使用して、頭蓋骨の後ろから鼻まで正中線に沿って切開します。

次に、正中線の近くに細い鉗子を挿入し、切開した頭蓋骨を2つに引っ込めます。頭蓋骨からマウスの脳を取り出し、ブレードを使用して、脳の尾側と吻側にある小脳球、前頭前野球、嗅球をそれぞれ取り除きます。次に、瞬間接着剤を使用して脳ブロックをビブラトームトレイに取り付けます。

ビブラトームトレイに氷冷した切断液を入れます。その後、冠状平野の組織切片を300マイクロメートルの厚さで切断します。通常、4〜6個の冠状海馬スライスを収集できます。

各セクションをカットした後、すぐにスライスを摂氏32〜34度に温めたスライス保持ビーカーに移します。この温度で20分間保持してから、ビーカーとセクションを少なくとも20〜30分間室温に移してから、録音します。カリウムイオンのダイナミクスを測定するには、パスツールピペットを使用して脳のスライスを浴にそっと置き、ナイロン弦付きのプラチナハープで静かに所定の位置に保持します。

バイポーラ刺激電極の先端が互いにほぼ平行で、スライスのプレーンと同じ高さであることを確認してください。5〜7秒かけて、電極を約40〜50マイクロメートルの深さのCA3層ラジアタムにゆっくりと挿入し、Schafferの担保を刺激します。次に、カリウムイオン選択性電極をCA1層の半径状に約50μmの深さまで、電極を約3〜4秒かけてゆっくりと下げて慎重に挿入します。

電極全体で電位が安定するのを待ってから、スライスに刺激を加える必要があります(通常は5〜10分かかります)。スライスが細胞外カリウムイオン濃度の過度の自発的変化を示す場合は、廃棄し、新しいスライスでプロセスを繰り返します。誘発されたカリウムイオンの放出を測定するには、刺激アイソレータを介して一連の電気刺激を加えながら、応答をデジタルで記録します。

10 マイクロアンペアの刺激振幅から開始して、1 パルスあたり 10 ヘルツと 1 ミリ秒で刺激を適用します。最大カリウム応答振幅が検出されるまで、刺激振幅を2倍に増やします。応答が観察されない場合は、カリウムイオン選択電極の位置を100マイクロメートル刻みで刺激部位に近づけます。

カリウムイオン濃度の変化が電気的に活性化されたシェーファー担保の活動電位発火によって媒介されることを確認するために、ACSFに0.5マイクロモルTTXを10分間適用し、刺激プロトコルを繰り返します。誘発された反応は観察されるべきではありません。.埋め戻されたHEPES緩衝生理食塩水とカリウムイオノフォアで電極をプライミングした後、電極は、バスカリウムイオン濃度の段階的な変化に対する迅速な応答と、ネルンスト方程式によって予測される方法で0.1〜100ミリモルのキャリブレーション範囲でのバスカリウムイオンの変化に対する線形応答をテストできます。

定常状態の電位は、ラインの傾きを決定するために、バスのカリウムイオン濃度に対してプロットでき、これは約V 58.2ミリボルトで、カリウムイオン濃度の10倍の変化あたり52ミリボルト以上である必要があります。カリウム選択性電極の応答性をさらに試験し、カリウムの5.5ミリモルの増加に対する応答が、約85ミリ秒の上昇および減衰時間定数で観察されました。刺激電極とカリウムイオン選択性電極を組織に配置し、記録が安定したベースラインに達すると、電流振幅が増加するパルスを印加できます。

この活性の波形は、指数関数的な崩壊率を伴うカリウムの急激な増加として現れますが、これはTTXの適用で廃止されます。このテクニックを習得すると、注意深く正確に実行すれば、約3〜4時間で完了します。この手順を試行する際は、正確な記録を可能にするために電極の先端をできるだけ小さく保ち、低ノイズを可能にするのに十分な大きさに保つことを忘れないでください。