マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離
May 21st, 2018
体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。
この技術の全体的な目標は、免疫磁気分離を使用して、新生児マウスの子犬からO4陽性オリゴデンドロサイトを選択し、in vitro培養分析を行うことです。この方法は、ミエリンと髄鞘形成に影響を与える疾患の研究に関連する神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、約1時間で純度80%を超える最終的なオリゴデンドロサイト培養の調製を容易にすることです。
小さな解剖ハサミを使用して、出生後5〜7日目のマウスの頭皮の正中線に沿って皮膚を切断することから始めます。皮膚のフラップを引っ込めて頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨を背中の開口部から前頭部への正中線に沿って慎重に切ります。頭蓋骨の後ろの開口部から、骨の基部に沿って各眼窩に向かって切り込み、細い鉗子を使用して皮質を中脳からそっと離します。
次に、皮質を7ミリリットルのB-27ニューロベースA培地を含む60ミリメートルの組織培養皿に移します。すべての脳が収集されたら、皮質を5ミリリットルの解離バッファーを含む新しい60ミリメートル組織培養皿に移し、15番のメスの刃を使用して皮質を1つの立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。脳片を摂氏37度の5%CO2インキュベーターで20分間インキュベー
トします。次に、1ミリリットルのウシ成長血清を加えて酵素反応を止めます。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織スラリーを15ミリリットルの円錐管に移し、ピペッティングで脳組織を6〜8回穏やかに解離します。解離した組織チャンクが2〜3分間落ち着くのを待ちます。
次に、上清を新しいチューブに移します。次に、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルのニューロバサルA培地を組織に加え、5ミリリットルのピペットを使用して、ピペッティングで組織を穏やかに解離します。ご覧のとおり、適切なピペッティング力は、生存細胞を高収率で確保するために重要です。
ピペッティングが難しすぎると、生存率が低下する可能性があります。一方、ピペッティングが緩すぎると、細胞の収量が低下する可能性があります。ティッシュピースがさらに2〜3分間落ち着くのを待ちます。
次に、上清を新しいチューブに移し、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルの新鮮なNeurobasal A培地を組織に加えます。P-1000ピペットチップで脳組織をP-1000ピペットチップで静かに解離させ、気泡を避けながら大きな組織の塊が残らないようにします。10ミリリットルのピペットを使用して、70ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞溶液を50ミリリットルの円錐管にろ過し、ウシの成長血清とDNase I.Splitで細胞懸濁液を2つの15ミリリットルの円錐管に分割した新鮮なNeurobasal A媒体で単一細胞懸濁液の最終容量を30ミリリットルにします。 そして遠心分離によって神経細胞をペレット化します。
曇った上清の最後の5〜10マイクロリットルを除くすべてを取り除き、ウシ成長血清を添加した3ミリリットルのニューロベースA培地を細胞に加えます。.細胞ペレットを慎重に再懸濁し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なNeurobasal A培地で最終容量を最大15ミリリットルにします。40ミクロンの細胞ストレーナーで細胞溶液を新しい50ミリリットルの円錐管にろ過し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なニューロベースA培地で最終容量を最大30ミリリットルにします。
次に、ろ過した細胞懸濁液を2本の15ミリリットルのコニカルチューブに分割して遠心分離し、ペレットを2.5ミリリットルの氷冷磁気セルソーティングバッファーに再懸濁してから細胞をプールします。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを7つの細胞に1×10あたり90マイクロリットルの新鮮な磁気細胞選別緩衝液に再懸濁します。
次に、7つの細胞に1×10あたり10マイクロリットルの抗04ビーズを加え、細胞溶液を穏やかにフリックして混合します。摂氏4度で15分間、5分ごとに穏やかにフリックした後、7つの細胞に10分の1回あたり2ミリリットルの磁気細胞ソーティングバッファーを穏やかに加え、遠心分離による洗浄を行い、上清を慎重に真空吸引して廃棄します。7つの細胞に1回10回ごとに新鮮な磁気細胞選別緩衝液の500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、適切なサイズの磁気ビーズ選別カラムを対応する磁気分離器に配置します。
40ミクロンのストレーナをカラムに置き、3ミリリットルの磁気セルソーティングバッファーでストレーナーを事前にすすぎ、カラムを乾燥させずにバッファーをカラムに通します。細胞をストレーナーに加え、続いてMagnetic Cell Sorting Bufferで1ミリリットル洗浄します。カラムは、1回の洗浄につき3 mmリットルの磁気細胞ソーティングバッファーで3回、1回はオリゴデンドロサイト増殖培地で洗浄します。
次に、カラムを15 mLチューブに移し、プランジャーを使用して、5 mLの新鮮なオリゴデンドロサイト増殖培地をカラムに直ちに注入します。カウント後、細胞を適切なプレーティング密度に希釈し、24ウェルプレートのプレコートカバースリップのラミニンを100マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地と交換します。オリゴデンドロサイトを摂氏37度、CO25°Cで45分以内にインキュベートし、オリゴデンドロサイトのカバースリップへの接着を促進します。
次に、24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地を浸水させ、24時間のインキュベーションを行います。翌日、上清をオリゴデンドロサイト分化培地に交換し、細胞を固定の準備ができるまでインキュベーターに戻します。めっきの24時間後、細胞は、初期増殖オリゴデンドロサイトの特徴的な特徴である位相コントラスト顕微鏡法の下で双極性または三極性であるように見えます。
免疫蛍光染色は、プレーティングの24時間後、これらのプレオリゴデンドロサイトの大部分がNG2およびO4標識も示す一方で、GFAPおよび抗01抗体による標識ははるかに一般的ではないことを示しています。これは、この段階の細胞の大部分が、未成熟または成熟オリゴデンドロサイトがほとんどないプレオリゴデンドロサイトであることを示唆しています。72時間後、オリゴデンドロサイトの形態は24時間後よりも複雑になり、初期のオリゴデンドロサイトマーカーであるNG2に陽性の細胞の頻度ははるかに低くなります。また、ほとんどの細胞はO4標識を示しており、この段階では細胞のほぼ半分が01抗体で染色されており、細胞がより成熟した表現型に分化していることが示唆されています。
特に、アストロサイトの存在は極めて低いままです。これらの結果は、免疫磁気的に単離されたオリゴデンドロサイトが、時間の経過とともに、アストロサイトなどの他の細胞タイプの汚染をほとんど伴わずに、in vitroで成熟のステージ3に分化できることを示しています。このビデオを見れば、免疫磁気的単離を使用して新生児マウスの子から初代オリゴデンドロサイトを単離する方法を十分に理解できるはずです。
このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間で完了できます。ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験に頑張ってください。
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概要
この研究は、マウスの初代オリゴデンドロサイトの免疫磁気分離を詳細に説明し、in vitro分析のための迅速かつ特異的な細胞分離を可能にします。この技術は、新生マウスからのO4陽性オリゴデンドロサイトを標的とし、ミエリン化とそれに関連する疾患に関する問題を探求します。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- ミエリン化研究
背景
- オリゴデンドロサイトは神経系におけるミエリン鞘形成に不可欠です。
- それらの分離の理解は脱髄疾患の研究を向上させます。
- この方法は細胞培養の純度と効率を大幅に向上させます。
- 免疫磁気分離はオリゴデンドロサイトの挙動と機能の研究に役立ちます。
研究目的
- in vitro実験のためのオリゴデンドロサイトの分離と培養。
- オリゴデンドロサイトに関連する細胞および分子力学を調査すること。
- 将来の研究のための高い細胞活性と純度を持つ方法を確立すること。
使用した方法
- 初代オリゴデンドロサイト培養のための免疫磁気分離法。
- 生物学的モデルとして5〜7日齢のマウスの子が使用されます。
- マルチオミクスのワークフローは言及されていません。
- 分離プロセスは80%以上の純度を目指し、約1時間かかります。
- 主要なステップには組織解離、細胞懸濁液の調製、磁気分離が含まれます。
主要な結果
- この方法は、後続の実験分析に適した高い収率とオリゴデンドロサイトの純度を達成します。
- 免疫蛍光染色により、初期増殖オリゴデンドロサイトの特徴的な特徴が明らかになります。
- 成功した分離により、ミエリン化と関連疾患に関与するメカニズムの研究が可能になります。
- 結果の意味は、オリゴデンドロサイトの機能性を評価する上でこの方法の役割を強調しています。
結論
- この研究は神経科学研究のためのオリゴデンドロサイト分離の効果的なアプローチを示しています。
- 免疫磁気分離技術は分離された細胞の純度を大幅に向上させます。
- 結果は、オリゴデンドロサイトの生物学と脱髄性疾患への影響についてのより深い理解に貢献します。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Rapid immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes enables high-purity, lineage-committed cell populations for in vitro disease modeling and mechanistic studies. This capability supports early-stage target validation and de-risking in neurobiology-focused discovery pipelines, particularly for demyelinating disease research. The method's efficiency and specificity facilitate reproducible workflows and scalable assay development for translational neuroscience portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of oligodendrocyte lineage commitment and myelination pathways in disease-relevant systems.
- Supports biological de-risking by minimizing contaminating cell types, increasing confidence in downstream analyses.
- Facilitates functional target validation for myelin-associated therapeutic hypotheses.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, high-purity oligodendrocyte cultures for quantitative in vitro assays.
- Improves reproducibility and scalability of cell-based screening platforms for neuroactive compounds.
- Enables reliable evaluation of compound effects on oligodendrocyte differentiation and maturation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro models with disease-relevant cell types for demyelinating disorder studies.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling mechanistic studies of myelination.
- Reduces risk of confounding results due to cellular heterogeneity in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
This immunomagnetic isolation method fits at the interface of early discovery and assay development, providing a foundation for lead identification and mechanistic de-risking in neurobiology pipelines.
- Discovery Biology: Delivers lineage-committed oligodendrocytes for hypothesis-driven studies of myelination and neurodegeneration.
- Screening: Supplies reproducible, high-purity cell populations for quantitative assay development and compound screening.
- Analytics: Enables robust measurement of differentiation markers and cell-type purity for comparative analyses.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models by maintaining disease-relevant cellular context.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable across neurobiology research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and mechanistic studies of myelination.
- Operational Value: Delivers standardized, rapid, and reproducible cell isolation for scalable R&D workflows.
- Strategic Value: Supports informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neurotherapeutic portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of neurobiology assets through robust in vitro validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue dissection and immunomagnetic cell sorting.
- Demands access to magnetic separation instrumentation and validated antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of cell handling and assay protocols.
- Adaptable to other neural cell types with appropriate marker selection and validation.
- Yield and purity may vary with tissue quality and operator proficiency.
