マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

この技術の全体的な目標は、免疫磁気分離を使用して、新生児マウスの子犬からO4陽性オリゴデンドロサイトを選択し、in vitro培養分析を行うことです。この方法は、ミエリンと髄鞘形成に影響を与える疾患の研究に関連する神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、約1時間で純度80%を超える最終的なオリゴデンドロサイト培養の調製を容易にすることです。

小さな解剖ハサミを使用して、出生後5〜7日目のマウスの頭皮の正中線に沿って皮膚を切断することから始めます。皮膚のフラップを引っ込めて頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨を背中の開口部から前頭部への正中線に沿って慎重に切ります。頭蓋骨の後ろの開口部から、骨の基部に沿って各眼窩に向かって切り込み、細い鉗子を使用して皮質を中脳からそっと離します。

次に、皮質を7ミリリットルのB-27ニューロベースA培地を含む60ミリメートルの組織培養皿に移します。すべての脳が収集されたら、皮質を5ミリリットルの解離バッファーを含む新しい60ミリメートル組織培養皿に移し、15番のメスの刃を使用して皮質を1つの立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。脳片を摂氏37度の5%CO2インキュベーターで20分間インキュベー

次に、1ミリリットルのウシ成長血清を加えて酵素反応を止めます。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織スラリーを15ミリリットルの円錐管に移し、ピペッティングで脳組織を6〜8回穏やかに解離します。解離した組織チャンクが2〜3分間落ち着くのを待ちます。

次に、上清を新しいチューブに移します。次に、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルのニューロバサルA培地を組織に加え、5ミリリットルのピペットを使用して、ピペッティングで組織を穏やかに解離します。ご覧のとおり、適切なピペッティング力は、生存細胞を高収率で確保するために重要です。

ピペッティングが難しすぎると、生存率が低下する可能性があります。一方、ピペッティングが緩すぎると、細胞の収量が低下する可能性があります。ティッシュピースがさらに2〜3分間落ち着くのを待ちます。

次に、上清を新しいチューブに移し、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルの新鮮なNeurobasal A培地を組織に加えます。P-1000ピペットチップで脳組織をP-1000ピペットチップで静かに解離させ、気泡を避けながら大きな組織の塊が残らないようにします。10ミリリットルのピペットを使用して、70ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞溶液を50ミリリットルの円錐管にろ過し、ウシの成長血清とDNase I.Splitで細胞懸濁液を2つの15ミリリットルの円錐管に分割した新鮮なNeurobasal A媒体で単一細胞懸濁液の最終容量を30ミリリットルにします。 そして遠心分離によって神経細胞をペレット化します。

曇った上清の最後の5〜10マイクロリットルを除くすべてを取り除き、ウシ成長血清を添加した3ミリリットルのニューロベースA培地を細胞に加えます。.細胞ペレットを慎重に再懸濁し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なNeurobasal A培地で最終容量を最大15ミリリットルにします。40ミクロンの細胞ストレーナーで細胞溶液を新しい50ミリリットルの円錐管にろ過し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なニューロベースA培地で最終容量を最大30ミリリットルにします。

次に、ろ過した細胞懸濁液を2本の15ミリリットルのコニカルチューブに分割して遠心分離し、ペレットを2.5ミリリットルの氷冷磁気セルソーティングバッファーに再懸濁してから細胞をプールします。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを7つの細胞に1×10あたり90マイクロリットルの新鮮な磁気細胞選別緩衝液に再懸濁します。

次に、7つの細胞に1×10あたり10マイクロリットルの抗04ビーズを加え、細胞溶液を穏やかにフリックして混合します。摂氏4度で15分間、5分ごとに穏やかにフリックした後、7つの細胞に10分の1回あたり2ミリリットルの磁気細胞ソーティングバッファーを穏やかに加え、遠心分離による洗浄を行い、上清を慎重に真空吸引して廃棄します。7つの細胞に1回10回ごとに新鮮な磁気細胞選別緩衝液の500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、適切なサイズの磁気ビーズ選別カラムを対応する磁気分離器に配置します。

40ミクロンのストレーナをカラムに置き、3ミリリットルの磁気セルソーティングバッファーでストレーナーを事前にすすぎ、カラムを乾燥させずにバッファーをカラムに通します。細胞をストレーナーに加え、続いてMagnetic Cell Sorting Bufferで1ミリリットル洗浄します。カラムは、1回の洗浄につき3 mmリットルの磁気細胞ソーティングバッファーで3回、1回はオリゴデンドロサイト増殖培地で洗浄します。

次に、カラムを15 mLチューブに移し、プランジャーを使用して、5 mLの新鮮なオリゴデンドロサイト増殖培地をカラムに直ちに注入します。カウント後、細胞を適切なプレーティング密度に希釈し、24ウェルプレートのプレコートカバースリップのラミニンを100マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地と交換します。オリゴデンドロサイトを摂氏37度、CO25°Cで45分以内にインキュベートし、オリゴデンドロサイトのカバースリップへの接着を促進します。

次に、24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地を浸水させ、24時間のインキュベーションを行います。翌日、上清をオリゴデンドロサイト分化培地に交換し、細胞を固定の準備ができるまでインキュベーターに戻します。めっきの24時間後、細胞は、初期増殖オリゴデンドロサイトの特徴的な特徴である位相コントラスト顕微鏡法の下で双極性または三極性であるように見えます。

免疫蛍光染色は、プレーティングの24時間後、これらのプレオリゴデンドロサイトの大部分がNG2およびO4標識も示す一方で、GFAPおよび抗01抗体による標識ははるかに一般的ではないことを示しています。これは、この段階の細胞の大部分が、未成熟または成熟オリゴデンドロサイトがほとんどないプレオリゴデンドロサイトであることを示唆しています。72時間後、オリゴデンドロサイトの形態は24時間後よりも複雑になり、初期のオリゴデンドロサイトマーカーであるNG2に陽性の細胞の頻度ははるかに低くなります。また、ほとんどの細胞はO4標識を示しており、この段階では細胞のほぼ半分が01抗体で染色されており、細胞がより成熟した表現型に分化していることが示唆されています。

特に、アストロサイトの存在は極めて低いままです。これらの結果は、免疫磁気的に単離されたオリゴデンドロサイトが、時間の経過とともに、アストロサイトなどの他の細胞タイプの汚染をほとんど伴わずに、in vitroで成熟のステージ3に分化できることを示しています。このビデオを見れば、免疫磁気的単離を使用して新生児マウスの子から初代オリゴデンドロサイトを単離する方法を十分に理解できるはずです。

このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間で完了できます。ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験に頑張ってください。