Name: マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-21T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: 学ぶマウスのオリゴデンドロサイトの免疫磁気分離法。新生マウスからO4陽性細胞を高純度で迅速に分離し、脱髄疾患や髄鞘形成のメカニズム研究に応用します。この技術は神経科学の基礎研究に貢献します。

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本研究は、国民の多数硬化の社会 (RG4591A1/2) および健康の国民の協会 (R03NS06740402) からの助成金によって支えられました。著者は、実験スペース、機器やアドバイスを提供するため博士イバン エルナンデスと彼の研究室のメンバーをありがとうございます。

本研究で使用されるマウスは、SUNY ダウンステート医療センター部門の研究室動物資源 (DLAR) プロトコル番号 15 10492 のガイドラインに従って介抱され。
注: プライマリ オリゴデンドロ サイトが新生児 (P5 P7 野生型 C57Bl/6 n) から分離されたマウス。この段階では、未熟な最小二乗法は、高細胞収量を確保する齧歯動物の白質の 80% 以上を構成します。すべてのバッファーと試薬組成材料のテーブルの末尾にあります。
1. Coverslips 準備
注: ポリ D リジン (PDL)/ラミニン コート coverslips OL 分離前に準備されるべきです。
<ol><li>場所 #1 ドイツ語 50 mL の円錐管に coverslips をガラスし、70% の 35 mL を追加しそれらをきれいに江藤。</li>
	<li>管を閉じてならびにミキサーに軽くロッキングしながら少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。Coverslips は夜通し孵化することができます。</li>
	<li>70 %etoh を破棄します。</li>
	<li>脱イオン水で 3 回 coverslips を洗浄、真空吸引で毎回水を削除します。</li>
	<li>PDL 50 μ g/mL の 30-35 mL を 50 mL チューブに十分な coverslips をカバーする coverslips に追加します。</li>
	<li>ならびにミキサーに coverslips を含む 50 mL チューブを置き、穏やかに揺れる中、少なくとも 30 分間室温でインキュベートします。</li>
	<li>Coverslips 真空吸引で毎回水を除去、脱イオン水で 3 回洗います。</li>
	<li>脱イオン水を含む 60 mm のペトリ皿に、coverslips を転送します。</li>
	<li>P200 ピペット チップを使用すると、ペトリ皿の全体の表面を覆う層として、coverslips を配置できます。</li>
	<li>慎重に、真空吸引で皿から水を削除します。</li>
	<li>Coverslips 周りの水の過剰を削除し、蓋が開いたとフードの UV 光の下で一晩乾燥させます。 注: 歯根膜コーティング ガラス coverslips は滅菌シャーレに 4 ° C で最大 3 カ月保存できます。</li>
	<li>場所 1 つ好評につき、24 ウェル プレートに coverslips 微細鉗子を使用して。</li>
	<li>よく作るエッジは井戸の壁を触れないでくださいセンター、coverslips に移動します。</li>
	<li>B27NBMA で希釈した 10 μ G/ml ラミニンの 100 μ L を追加 (材料表参照) 各 coverslip の中心から開始し、すべての領域をカバーする円形のエッジに向かってファッションで移動します。 メモ: ラミニンが OL の保守に関係するが、成熟した最小二乗法への分化を促進するので、重要な OL 生存因子の in vitro培養41,42,43,44は。</li>
	<li>プレート 5% CO2で少なくとも 1 時間または、OLs はめっきの準備が整うまでの 37 ° C をインキュベーターで孵化させなさい。</li>
</ol>2. マウス脳皮質解離
<ol><li>以前、70% エタノールで洗浄ハサミでクイック斬首で生後 5-7 日の古い C57Bl/6 n マウスの子犬を犠牲に。 注: 5-6 新生児マウス子犬から大脳皮質のそれぞれの準備のため使用されました。平均すると、1 つのマウス脳 1 〜 1.5 x 106最小二乗法が得られます。</li>
	<li>小さな解剖はさみで正中線に沿って頭皮皮膚をカットし、頭蓋骨を公開する撤回します。</li>
	<li>前頭葉は、脳の損傷を避けるためにハサミを持ち上げに向かって頭の後ろに開口部から正中線に沿って慎重に頭蓋骨をカットします。その後、頭蓋骨の後ろに開口部を使用して各眼窩、頭蓋底に沿ってに向かってカット。</li>
	<li>優しく B27NBMA 7 mL を含んでいる 60 mm 培養皿に移して中脳から皮質をいじめるし微細鉗子を使用します。切り裂かれた野のプール、それぞれの脳の 2.4 から 2.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>5 mL の解離バッファーを含んでいる新しい 60 mm 培養皿に皮質を転送 (B27NBMA、20-30 U/mL パパインおよび 2,500 U DNase 私)。</li>
	<li>約 1 mm3 #15 メス刃を使用しての小さな断片に皮質をダイスし、37 ° C、5% CO2インキュベーターで 20 分間インキュベートします。</li>
	<li>牛の成長血清酵素反応を停止する (BGS) の 1 つの mL を追加します。</li>
	<li>解離メディアと一緒に野を 10 mL の血清ピペットを使用して 15 mL の円錐管に転送します。</li>
	<li>優しくゆっくりをピペッティングによる脳組織を分離する開始し、気泡を最小限に抑えるように注意 6-8 回は、10 mL の血清ピペットを使用して、ダウン。</li>
	<li>2 〜 3 分のために解決し新鮮なチューブに上清を転送組織塊を許可します。</li>
	<li>10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/2500 U DNase I 組織ペレットします。</li>
	<li>5 mL の血清ピペットを使用して、優しく上下にピペッティングしながら脳組織を分離するに 6 〜 8 回。気泡を最小限に抑えるように注意します。</li>
	<li>2-3 分のために解決する組織塊を許可します。</li>
	<li>新鮮なチューブに上清を転送します。10% を含む B27NBMA の 3 mL を加える BGS/dn 組織にペレットします。</li>
	<li>優しくメディア ミックスをピペッティングしながら P1000 のピペット チップを使用して脳組織を切り離して、脳組織の上下。組織の大きな塊がなくなるまで、または B27NBMA までの手順 2.13 と 2.14 を繰り返します 10% を含む BGS/DNase 私は疲れている、いずれか早い方。気泡を最小限に抑えるように注意します。</li>
	<li>セル サスペンションはプール前の培養上清に。</li>
	<li>50 mL チューブに 70 μ m の細胞のストレーナーを配置します。70 μ m の細胞のストレーナーをそっとプールされた細胞懸濁液を通過 10 mL の血清ピペットを使用して。</li>
	<li>B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによってセル ストレーナーを洗浄 BGS/DNase 私。</li>
	<li>セル ストレーナーを破棄します。30 - ml B27NBMA で 10% を含むボリュームをもたらす BGS/DNase 私。</li>
	<li>2 つの 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みを削除します。上清は細胞の残骸により曇りでしょう。10% を含む B27NBMA の 3 mL を追加しペレットに BGS。</li>
	<li>慎重に P1000 ピペットを使用して細胞ペレットを切り離して考えます。10% を含む B27NBMA と 15 の mL にボリュームをもたらす BGS.</li>
	<li>細胞懸濁液を 40 μ m の新鮮な細胞のストレーナー通過します。</li>
	<li>B27NBMA の 1 mL の 10% を含むを追加することによって細胞のストレーナーを洗う BGS.セル ストレーナーを破棄します。</li>
	<li>10% を含む B27NBMA と 30 の mL にボリュームをもたらす BGS.</li>
	<li>2 x 15 mL コニカル チューブに細胞懸濁液を転送します。200 x g で 10 分間の細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>空気にさらされるセルを離れることがなく上澄みのほとんどを削除します。5 ml の氷冷磁気細胞 (MCS) バッファーの並べ替えの細胞ペレットを再懸濁します。</li>
</ol>3. 細胞数と生存率の定量
<ol><li>0.4% (w/v) で 1:5 希釈を達成するために 1.5 mL 遠心チューブにトリパン ブルー溶液 400 μ L での細胞懸濁液 100 μ L を希釈します。</li>
	<li>セル希釈 P10 ピペットを使用して、回避 10 μ L で 2 つの部屋いっぱいになる商工会議所検定と塗りつぶしの上カバー ガラスの中心します。ソリューションを毛管作用によってカバー ガラスの下通ります。</li>
	<li>顕微鏡ステージ上、検定を置き、40 倍の倍率を使用して、フォーカスを調整します。 注: セル数はそれぞれ 5 つの正方形 (4 つの角と一つの中心) の手持ちのカウンターを使用して記録されます。非実行可能なセルだけ染料を吸収し、ながらライブ、青で表示され、健康な細胞のラウンドと屈折を表示され、1 ミリリットルあたり現実的で総細胞数の決定を可能にする青色の色素を吸収しません。</li>
</ol>4. O4 の分離+オリゴデンドロ サイト
<ol><li>10 分間 200 x g で細胞懸濁液を遠心します。</li>
	<li>慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。</li>
	<li>MCS バッファー反 O4 ビーズ 1 x 10 の7セルごとの 10 μ l を添加した 1 x 107合計セルごとの 90 μ L でペレットを再懸濁します。</li>
	<li>優しく指で 15 mL の円錐管 4-5 回をフリックで細胞懸濁液やビーズをミックスします。</li>
	<li>素早く指で 15 mL の円錐管 4-5 timesevery、4 ° C で 15 分のミックスを孵化させなさい 5 分。</li>
	<li>優しくチューブに MCS バッファー 1 x 10 の7セルあたり 2 mL を追加してミックスを洗います。10 分間 200 x g でミックスを遠心します。</li>
	<li>慎重に空気への細胞の露出を避け、真空吸引を使用して上澄みを廃棄します。7すべて 1 x 10 のセルの MCS バッファーの 500 μ L の細胞ペレットを再懸濁します。</li>
	<li>磁気セパレーターを磁選機スタンドに取り付けます。磁選機付ける選択列、列の上に 40 μ m の細胞のストレーナーを配置します。15 mL の 2 つまたは 1 つ 50 mL の円錐管を通して流れを収集する分離カラムの下に配置します。</li>
	<li>プレ MCS バッファーの 3 mL で 40 μ m セル ストレーナーと分離列をすすぎ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファー。</li>
	<li>セル ストレーナーと選択した列には、細胞懸濁液とビーズのミックスを追加します。</li>
	<li>1 mL の MCS バッファーと 40 μ m セル ストレーナーを洗浄します。</li>
	<li>セル ストレーナーを破棄し、セル、ビーズ、乾燥させることがなく列を介して実行バッファーのミックスを聞かせてください。</li>
	<li>3 mL の MCS バッファーで 3 回分離カラムと OL 増殖メディアで 1 回洗います。</li>
	<li>磁選機から分離カラムを削除、すぐに 15 mL の円錐管に配置し、すぐに 5 mL の OL 増殖培を追加します。</li>
	<li>15 mL の円錐管にラベル付きセルをフラッシュするプッシュしっかりと列の上にピストンを配置します。</li>
	<li>細胞数と 3 のセクションで示されているように、トリパン ブルーと検定を使用しての生存率を決定する細胞を懸濁液 100 μ L を削除します。 注: 細胞生存率 80% 以上が、OLs の文化を進める許容が、90% 以上の生存率は最適。</li>
</ol>5. 分離 O4 のめっき+オリゴデンドロ サイト
<ol><li>密度 (coverslip あたり 5 x 10 の5セル) をめっき欲求に細胞懸濁液を希釈 OL 増殖メディアを使用しています。 注: OL 播種密度は非常に重要なので、始める前に培養顕微鏡を用いた適切な細胞密度を確認すべき。播種密度 10,000 細胞/coverslips 以下悪い細胞の生存可能性があります。10,000、25,000、OL で密度をめっき形態分化は遅い45 です。我々 は細胞の生存を確保するため、少なくとも 50,000 セル/coverslips の播種密度最小二乗法をプレートします。</li>
	<li>Coverslips ティッシュ文化フードにインキュベーターからラミニンとコーティングを含む 24 ウェル プレートを移動します。</li>
	<li>各 coverslip からラミニンを削除し、OL 懸濁液 100 μ L でそれを置き換えます。</li>
	<li>最小二乗法を最大、coverslips に OL の接着を促進するために 45 分の 37 °C/5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。</li>
	<li>インキュベーション後、インキュベーターから 24 ウェル プレートを削除します。それぞれの洪水 OL 増殖メディアの 500 μ L で 24 ウェル プレートのも。</li>
	<li>さらに 24 時間の 37 °C/5% CO2インキュベーターに Ol を配置します。</li>
	<li>最小二乗法のめっき後 24 h は増殖メディアを取り出し、分化誘導 OL 分化メディアで代用します。</li>
	<li>インキュベーターに Ol を置き、セルは固定のため準備ができているまでは削除しないでください。 注: pH 変化は最小二乗法の有害なセル実行可能性の減少、従ってインキュベーターから OLs 文化の不必要な除去を避けるべき。</li>
</ol>6. 蛍光抗体染色
<ol><li>細胞の検出のため表面マーカー (NG2、O1、O4) は井戸からメディアを削除します。</li>
	<li>O1 (原液)13 O4 (原液)13に対する主な抗体を含むマウス ハイブリドーマ培養上清の 250 μ L を追加し、ウサギの NG2 に対するポリクローナル (B27NBMA で希釈 1: 150)。 注: 市販アンチ O1 とアンチ O4 抗体を使用する場合は、製造元が推奨希釈液を利用することをお勧めです。</li>
	<li>37 °C/5% CO2インキュベーターで最大 45 分間一次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で二回洗います。4% のパラホルムアルデヒドとセルを修正 (4 %pfa) 室温で 10 分間。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>アレクサ 488 標識ヤギ抗マウス igm 抗体または抗うさぎ igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。</li>
	<li>Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>二重染色の内部マーカー (GFAP) の検出、室温で 15 分間ブロック/透過バッファーと 0.05% Tween 20/1 X PBS とブロック/permeabilize セルを削除します。それ以外の場合 6.17 の手順に進みます。</li>
	<li>ブロック/透過バッファーを削除し、250 μ L 鶏抗 GFAP (1: 100) ブロック/透過バッファーで希釈を追加します。</li>
	<li>室温で 1 時間抗 GFAP とセルを孵化させなさい。トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>Alexa 594 共役ヤギ抗にわとり igg 抗体二次抗体 (1: 400) B27NBMA で希釈します。</li>
	<li>Coverslips から 0.05% Tween 20/1 × PBS を削除します。暗闇の中で部屋の温度で 1 時間の二次抗体と細胞を孵化させなさい。</li>
	<li>トゥイーン-20/1 × PBS 0.05% で各 5 分を 3 回洗います。</li>
	<li>4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) と対比染色とセルを DAPI を含むメディアのマウント antifade マウントします。</li>
	<li>Coverslips が一晩室温で暗闇の中で硬化させてください。</li>
	<li>落射蛍光顕微鏡による染色の細胞をイメージします。 注: このプロトコルでセルは均一露光時間を使用して 40 倍の倍率でイメージしました。</li>
</ol>

著者の開示があります。

この通信は、高純度の未熟なマウス オリゴデンドロ サイト文化の効率的な分離法を提案する.以前に公開されたプロトコル39,40に比べると、このメソッドは、GFAP 陽性アストロ サイトの非常に低いレベルと他の非特徴の細胞の割合が非常に低い高い純度を得られました。オリゴデンドロ サイトの血統に既にコミット未熟な最小二乗法であることを指摘することが重要です。したがって、これらの細胞は、分化の初期段階の研究の役に立たないでしょう。
Dincman プロトコル40から変更の 1 つは、私たちの拡散メディアから塩基性繊維芽細胞成長因子 (bFGF) の除去だった。報告されているその体外bFGF の強い細胞増殖因子として機能分化から Opc を阻害するだけでなく、またプロセス46,47の数が減少しま...

オリゴデンドロ サイト (OLs) は、中枢神経系 (CNS)1の髄の細胞です。分離と規制の厳しい環境でプライマリ オリゴデンドロ サイトの文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、脱髄疾患多発性硬化症2 などの生物の生体外で研究のための貴重なツール.これは、効率的で堅牢なオリゴデンドロ サイト分離と培養法3を必要があります。本研究では迅速かつ具体的変更された分離手法を実装する、特徴的なオリゴデンドロ サイト細胞の表面マーカーの発現を利用をしました。
成熟オリゴデンドロ サイトの 4 つの明瞭な段階を識別されている、各各発育ステージ (図 1) 特徴的な細胞表面マーカーの発現が特徴します。これらの細胞の表面のマーカー抗体4、5、によって認識することができます、特定の段階で最小二乗法を分離する使用ことができます。最初の段階では、オリゴデンドロ サイト前駆細胞 (Opc) は増殖、移行、および具体的にはエクスプレス ・血小板由来成長因子受容体 (PDGF-Rα)6, ガングリオシド A2B5, プロテオグリカン NG27,8 能力を持っています。、ポリシアル酸神経細胞接着分子9および脂肪酸酸結合タンパク質 7 (FABP7)10。Opc 神経前駆細胞11の特徴である細胞体の反対の極から発せられるいくつかの短いプロセスとバイポーラの形態があります。
<img alt="オリゴデンドロサイト成熟図;マーカーのある段階:OPC、前オリゴデンドロサイト、未熟、成熟。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="オリゴデンドロサイト成熟図;マーカーのある段階:OPC、前オリゴデンドロサイト、未熟、成熟。"> 図 1: マウス オリゴデンドロ サイト開発時にセル表面のマーカーの表現。A2B5、GalC (O1)、NG2、O4、PDGF Rα は具体的には特定の抗体を使用して、特定の発達段階でオリゴデンドロ サイトを分離する使用ことができますよう、OLs セル表面のマーカーです。  <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
第二段階で Opc preoligodendrocytes に上昇を与えるし、細胞膜で OPC マーカーだけでなく、O4 抗体12,13、14GPR17 蛋白質によって認識されるスルファチド (硫酸化 galactolipid)未熟なオリゴデンドロ サイト (OL) 段階まで主張します。この段階では、preoligodendrocytes は、多極短いプロセスを拡張します。Preoligodendrocytes 生後 2 (P2) で主要な段階の OL は未熟な最小二乗法15のマイナーな人口を持つラットおよびマウスの大脳白質します。
第 3 段階では、未熟な OLs 続行 O4 を表現し A2B5 と NG2 マーカーの発現を失う、galactocerebroside C16を表現し始めます。この段階で OLs は別個の系統にコミットしているし、長い分岐し枝17,18と分裂後の細胞になります。未熟な OL が P7 で齧歯動物の白質の 80% 以上を構成して、この時点で最初の MBP+細胞は15,19,20,21が観察されます。したがって、P7 で OLs の分離は、高細胞収量を確保できます。
OL 開発の最後、第 4 段階で成熟した OLs エクスプレス髄蛋白質 (ミエリン塩基性タンパク質 (MBP)、ミエリンプロテオリピドタンパク質 (PLP)、関連付けられているミエリン糖タンパク質 (MAG) とミエリン オリゴデンドロ サイト糖タンパク質 (モグ)22,23 ,24,25,26。この段階で成熟した最小二乗法は、軸索の周り鞘を enwrapping フォーム最適化される膜を拡張し、脳内を活性化することができます。これは、ラットやマウスの脳で MBP+細胞なる P1419,20,21ますます豊富な観察と一致します。
Immunopanning28,29,30, を含む Fewster と 1967年27で同僚のオリゴデンドロ サイトの最初の分離後 OLs の齧歯動物の中枢神経系からの分離のためのいくつかの方法を実施しています蛍光活性化細胞は、細胞表面抗原28,31, 微分勾配遠心法32,33,34,35 を利用 (FACS) を選別と異なる中枢神経系グリア36,37の差分の遵守に基づく振動法。ただし、現行の培養法には、純度、収量、38の手順の実行に要する時間の観点から特に制限があります。したがって、オリゴデンドロ サイトの効率的分離法が必要です。
本稿で提案する簡単な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。このメソッドは、エメリーらによって報告される技術の変更39と Dincmanら40し約 4 時間で 80% 以上のオリゴデンドロ サイト準備純度を提供します。

<table><tbody><tr><td>10ml血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>10mlシリンジLuer-Locチップ</td><td>BD、ベクトンディキンソン</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>15ml円錐管ファ</td><td>ルコン</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>24ウェル組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353935</td><td></td></tr><tr><td>40&micro;m細胞ストレーナー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22368547</td><td></td></tr><tr><td>50mlコニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>5ml血清ピペット</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>60mm組織培養プレート</td><td>ファルコン</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>70&micro;m cell strainer</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG (H+L) 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgM (H+L) 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A21042</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ヤギ抗ウサギ IgM (H+L) 二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594ヤギ抗鶏IgG(H + L)二次抗体</td><td>Invitrogen</td><td>A11042</td><td></td></tr>抗<tr><td>O4ビーズ-抗O4マイクロビーズ</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-543</td><td></td></tr><tr><td>Apo-Transferrinヒト</td><td>シグマ</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>オートフィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml</td><td>米国科学</td><td>6032-1101</td><td></td></tr>オート<tr><td>フィルコンプリートボトルトップフィルターアセンブリ、0.22umフィルター、250ml</td><td>USAサイエンティフィック</td><td>6032-1102</td><td></td></tr><tr><td>B27</td>サプリメント<td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td></td></tr>ホ<tr><td>ウ酸</td><td>シグマ</td><td>B7660</td><td></td></tr>ウ<tr><td>シ成長血清(BGS)</td><td>GEヘルスケアライフサイエンス</td><td>SH30541.03</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP-1600-100</td><td></td></tr><tr><td>CNTF</td><td>ペプロテック</td><td>450-50</td><td></td></tr><tr><td>d-ビオチン</td><td></td><td>Sigma B4639</td><td></td></tr><tr><td>デオキシリボヌクレアーゼ I (DNAse I)</td><td>Worthington</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Fisher</td><td>Scientific</td><td>S311</td><td></td></tr><tr><td>落射蛍光顕微鏡 オリンパス DP70 カメラ付き</td><td>オリンパス</td><td>Bx51</td><td></td></tr><tr><td>フェザー使い捨てメス</td><td>Andwin Scientific</td><td>EF7281C</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma</td><td>F6886</td><td></td></tr><tr><td>ドイツ製ガラスカバースリップ、#1 厚さ、直径 12mm 丸型</td><td>NeuVitro</td><td>GG-12-oz</td><td></td></tr><tr><td>GFAP 抗体</td><td>Aves</td><td>GFAP</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Invitrogen</td><td>12585-014</td><td></td></tr><tr><td>磁気セパレータースタンド - MACSマルチスタンド</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>磁気セパレーター - MiniMACSセパレーター</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>Millex PES 0.22&micro;m フィルターユニット</td><td>Millipore</td><td>SLG033RS</td><td></td></tr><tr><td>Mounting media- Prolong Gold with DAPI</td><td>Thermo Fisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>N-acetyl-cysteine (NAC)</td><td>Sigma</td><td>A8199</td><td></td></tr><tr><td>Natural mouse laminin</td><td>Invitrogen</td><td>23017-015</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal Medium A</td><td>Invitrogen</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>Neurotrophin-3 (NT-3)</td><td>Peprotech</td><td>450-03</td><td></td></tr><tr><td>NG2</td>抗体<td>ミリポア</td><td>AB5320</td><td></td></tr><tr><td>パパイン</td><td>ワーシントン</td><td>LS003126</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+およびMg2+</td><td>Sigma</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>PDGF</td><td>ペプロテック</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>シャーレ</td><td>ファルコン</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン</td><td>シグマ</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>プリモシン</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-2</td><td></td></tr><tr><td>プロゲステロン</td><td>シグマ</td><td>P8783</td><td></td></tr><tr><td>プトレシン</td><td>シグマ</td><td>P5780</td><td></td></tr><tr><td>セレクション column-LS columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>亜セレン酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S5261</td><td></td></tr><tr><td>微量元素 B</td><td>コーニング</td><td>25-000-CI</td><td></td></tr><tr><td>トリヨードチロニン (T3)</td><td>シグマ</td><td>T6397</td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X</td><td>シグマ</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>トリパン ブルーソリューション</td><td>コーニング</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン 20</td><td>シグマ</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>B27NBMA</td><td></td><td></td><td>487.75 mL ニューロベースルミディアムA;10 mL B27サプリメント;プリモシン1mL;1.25mLグルタマックス;フィルター滅菌し、4°Cで保管します。使用までC。</td></tr><tr><td>B27NBMA + 10% BGS</td><td></td><td></td><td>27 mL B27NBMA; 3 mL ウシ成長血清</td></tr><tr><td>CNTF溶液ストック(10 & micro;グラム/ミリリットル;1000X)</td><td></td><td></td><td>Peprotech(450-50)から注文してください。メーカーによると0.1〜1 mg / mlでメイクアップバッファー(例:DPBS + 0.2% BSA)中の命令(ロットごとに異なる場合があります)。-80°C. 作業溶液(10&�マイクロ;g/ml、1000X) 1.DPBSの解決およびろ過sterilize. 2の0.2% BSA(フィッシャー科学BP-1600-100)で作りなさい。マスターストックアリコートを10&microに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(20&micro;L / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>d-ビオチンストック溶液(50 & micro;グラム/ミリリットル;5000X)</td><td></td><td></td><td>d-ビオチン(Sigma-B4639)を50μで再蒸留したH2Oに再懸濁します。g / ml(例:50 mlのddH2Oに2.5 mg)。再懸濁には、かなりの量の攪拌/渦、または37°Cでの穏やかな温暖化が短時間かかる場合があります。それでもd-ビオチンが可溶化しない場合は、濃度の低いもの(例:10&micro;g/ml)、B27NBMAに体積を多く追加する(1/5000ではなく1/1000)。4°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>DNase Iストック溶液</td><td></td><td></td><td>1。氷上で冷やしたHBSSに12,500UデオキシリボヌクレアーゼI / mlで溶解します. 2.氷上でフィルター滅菌します 3.200 &microのアリコート;lと一晩で凍結し、-20°Cで 4。アリコートは-20〜-30°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Ca2+およびMg2+なし)</td><td></td><td></td><td>ポーチを1リットルの水に溶解して、培地1リットルあたり9.6グラムの粉末で1リットルの培地を生成します。2-8°Cで保管します。</td></tr><tr><td>フォルスコリン原液(4.2 mg/ml、1000X)</td><td></td><td></td>1 <td>mLの滅菌DMSOをボトル(Sigma-F6886)の50 mgフォルスコリンに加え、再懸濁するまでピペットで固定します。15 mLの遠心分離チューブに移し、11 mlの滅菌DMSOを加えて4.2 mg / mlにします。l)で保存し、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ハンクs バランス塩 (HBSS) (Sigma</td><td></td><td></td><td>1.900mlの水を測定します(温度15-20°C;C)シリンダーに入れ、穏やかにかき混ぜます. 2.力を加え、溶けるまでかき混ぜます. 3.元のパッケージを少量の水ですすいで、粉末のすべての痕跡を取り除きます. 4.手順 2. 5 でソリューションに追加します。最終容量1リットルあたり0.35グラムの重炭酸ナトリウム(7.5%w / v)を追加します. 6。溶解するまで攪拌を続けます. 7.攪拌しながら緩衝液のpHをpH = 7.4より0.1〜0.3単位下に調整します。pH. 8を調整するために、1N HClまたは1N NaOHの使用をお勧めします。水を追加して、最終容量を 1L. 9 にします。気孔率0.22ミクロンのメンブレンを使用したろ過により滅菌します. 10。2-8°Cで保管します。</td></tr><tr><td>インスリンストック溶液(4000&micro;g / ml)</td><td></td><td></td><td>ボトルを解凍し、分注25&micro;マイクロ遠心チューブあたりのlで、-20°Cで保管します。</td></tr><tr><td>ラミニン溶液</td><td></td><td></td><td>ラミニンを寒さでゆっくりと解凍します(2°C;Cから8°C;C)ゲル形成を避けるため。次に、ポリプロピレンチューブに分注します。5°Cで保管します。Cから-20°C;アリコート中のC(例:20 &micro;l)そして繰り返し凍結/解凍しないでください。ラミニンは、これらの温度で最大6か月間保存できます。</td></tr><tr><td>磁気セルソーティング(MCS)バッファー</td><td></td><td></td><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.2、および0.5%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.5 mM EDTA、5&microを含む溶液を準備します。g / mlインスリン、1g / Lグルコース。滅菌し、0.22&microに通すことにより緩衝液をろ過することにより、脱気します。mミッレクフィルター。バッファを4°Cで保存します。</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン(NAC)ストック溶液(5 mg / ml; 1000X)</td><td></td><td></td>を使用する前に<td>、N-アセチル-L-システイン(Sigma-A8199)をDMEMに5 mg / mlで溶解します(例:. 10 ml B27NBMAに50 mg NAC)。.フィルター滅菌とアリコート(例:20 &micro;-20°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>NT3ストック溶液(1 & micro;グラム/ミリリットル;1000X)</td><td></td><td></td><td>マスターストック: Peprotech(450-03)からの注文。メーカーによると0.1〜1mg / mlでメイクアップの指示(ロットごとに異なる場合があります)、バッファー(例:DPBS + 0.2% BSA)で。-80°C. Working stock (1&micro;グラム/ミリリットル;1000X): 1.DPBS溶液で0.2%BSAを調製し、滅菌. をろ過します 2.マスターストックアリコートを1&microに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(例:20&micro;L / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>PDGFストック溶液(10 &micro;グラム/ミリリットル;1000X)</td><td></td><td></td><td>マスターストック: Peprotech(100-13A)からの注文。メーカーによると0.1〜1mg / mlでメイクアップの指示(ロットごとに異なる場合があります)をバッファー(DPBSなど)+ 0.2%BSA)で保存します。-80°C. Working stock (1&micro;グラム/ミリリットル;1000X): 1.DPBS溶液で0.2%BSAを調製し、滅菌. をろ過します 2.マスターストックアリコートを1&microに希釈します。g/mL 滅菌済み、冷蔵 0.2% BSA/DPBS. 3.アリコート(例:20&micro;L / tube)と液体窒素でスナップフリーズします. 4.アリコートは-80°Cで保管してください。</td></tr><tr><td>ポリ-D-リジン (1mg/ml; 100X)</td><td></td><td></td><td>ポリ-D-リジン、分子量 70-150 kD (Sigma P6407) を 0.5mg/ml で 0.15M ホウ酸 pH 8.4 で再懸濁します (例: 50 ml ホウ酸緩衝液に 50 mg)。フィルター滅菌と分注(例:100&micro;L /チューブ)。使用前に、100Xストック(1mg / ml)を50°Cに希釈してください。滅菌水中のg / ml。</td></tr><tr><td>オリゴデンドロサイト増殖培地</td><td></td><td></td><td><a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">補足表 1</a></td></tr><tr><td>オリゴデンドロサイト分化培地</td><td></td><td></td><td>参照 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">補足表 1</a</td></tr><tr><td>>佐藤サプリメント (100X)</td><td></td><td></td><td>参照:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57543/57543_SupplementalTable.xlsx">補足表1</a></td></tr><tr><td>参考文献:試薬とレシピのリストは、Emeryら2013年(Emery, B. &Dugas, J. C. イムノパニングによるマウス皮質からのオリゴデンドロサイト系譜細胞の精製。コールドスプリングハーブプロトック。2013 (9), 854-868, doi:10.1101/pdb.prot073973, (2013)) および Dincman et.(Dincman、TA、Beare、JE、Ohri、S.S.&ホイットモア、SR皮質マウスオリゴデンドロサイト前駆細胞の単離。J Neurosciメソッド。日本木材処理学会誌, 209, 1, 219-226, doi:10.1016/j.jneumeth.2012.06.017, (2012))</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

マウスの主なオリゴデンドロ サイトの特異的・迅速免疫分離

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

効率的で堅牢な分離とプライマリ オリゴデンドロ サイト (OLs) の文化はオリゴデンドログリアの開発だけでなく、多発性硬化症などの疾患を脱髄の生物学の生体外で研究のための貴重なツールとPelizaeus メルツバッハー様疾患 (PMLD)。ここでは、単純な効率的な選択方法の免疫隔離のためステージ 3 O4+ preoligodendrocytes 細胞新生仔マウスの子犬。未熟な OL が、80% 以上の生後 7 日目で齧歯動物脳白質 (P7) この分離方法だけでなく細胞高利回りを保証も既に別個の系統にコミット OLs の特定の分離を構成するので減少、アストロ サイトなど汚染細胞とマウスの脳から他の細胞を分離することの可能性。このメソッドは、以前、報告方法の変更です、オリゴデンドロ サイト準備純度約 4 時間で 80% 以上を提供します。

本研究の目的は O4 の改善の分離法を確立、+プライマリ マウス オリゴデンドロ サイト ターゲット細胞の最低限の操作を必要とします。Coverslips のセルのめっきに子犬の安楽死から全体のプロシージャは約 4 時間、ここで表示されるデータを表す 3 つの独立した実験。組織解離後 4.3 ± 0.46 × 107セルの平均値が 91% ± 5.6% の生存率をそれぞれ独立した実験のため分離されました。アンチ O4 を使用して免疫隔離タグ マイクロ磁気ビーズ後 6.9 ± 0.38 x 106の平均最小二乗法が得られた (10 x 1 1.5 マウスあたり6 ) 16.2% である最初解離; 合計セルの ± 1.6%生存率 96.3% ± 3.5% であった。
<img alt="細胞分化プロセス;神経細胞におけるNG2,O4,GFAP,およびO1マーカーの顕微鏡...

体外培養の細胞の迅速かつ特定の分離を可能にするプライマリ マウス オリゴデンドロ サイトの免疫隔離について述べる。

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

この技術の全体的な目標は、免疫磁気分離を使用して、新生児マウスの子犬からO4陽性オリゴデンドロサイトを選択し、in vitro培養分析を行うことです。この方法は、ミエリンと髄鞘形成に影響を与える疾患の研究に関連する神経科学分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、約1時間で純度80%を超える最終的なオリゴデンドロサイト培養の調製を容易にすることです。小さな解剖ハサミを使用して、出生後5〜7日目のマウスの頭皮の正中線に沿って皮膚を切断することから始めます。皮膚のフラップを引っ込めて頭蓋骨を露出させ、頭蓋骨を背中の開口部から前頭部への正中線に沿って慎重に切ります。頭蓋骨の後ろの開口部から、骨の基部に沿って各眼窩に向かって切り込み、細い鉗子を使用して皮質を中脳からそっと離します。次に、皮質を7ミリリットルのB-27ニューロベースA培地を含む60ミリメートルの組織培養皿に移します。すべての脳が収集されたら、皮質を5ミリリットルの解離バッファーを含む新しい60ミリメートル組織培養皿に移し、15番のメスの刃を使用して皮質を1つの立方ミリメートルの断片にさいの目に切ります。脳片を摂氏37度の5%CO2インキュベーターで20分間インキュベートします。次に、1ミリリットルのウシ成長血清を加えて酵素反応を止めます。10ミリリットルの血清ピペットを使用して、組織スラリーを15ミリリットルの円錐管に移し、ピペッティングで脳組織を6〜8回穏やかに解離します。解離した組織チャンクが2〜3分間落ち着くのを待ちます。次に、上清を新しいチューブに移します。次に、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルのニューロバサルA培地を組織に加え、5ミリリットルのピペットを使用して、ピペッティングで組織を穏やかに解離します。ご覧のとおり、適切なピペッティング力は、生存細胞を高収率で確保するために重要です。ピペッティングが難しすぎると、生存率が低下する可能性があります。一方、ピペッティングが緩すぎると、細胞の収量が低下する可能性があります。ティッシュピースがさらに2〜3分間落ち着くのを待ちます。次に、上清を新しいチューブに移し、ウシ成長血清とDNase Iを添加した3ミリリットルの新鮮なNeurobasal A培地を組織に加えます。P-1000ピペットチップで脳組織をP-1000ピペットチップで静かに解離させ、気泡を避けながら大きな組織の塊が残らないようにします。10ミリリットルのピペットを使用して、70ミクロンの細胞ストレーナーを介して細胞溶液を50ミリリットルの円錐管にろ過し、ウシの成長血清とDNase I.Splitで細胞懸濁液を2つの15ミリリットルの円錐管に分割した新鮮なNeurobasal A媒体で単一細胞懸濁液の最終容量を30ミリリットルにします。 そして遠心分離によって神経細胞をペレット化します。曇った上清の最後の5〜10マイクロリットルを除くすべてを取り除き、ウシ成長血清を添加した3ミリリットルのニューロベースA培地を細胞に加えます。.細胞ペレットを慎重に再懸濁し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なNeurobasal A培地で最終容量を最大15ミリリットルにします。40ミクロンの細胞ストレーナーで細胞溶液を新しい50ミリリットルの円錐管にろ過し、10%のウシ成長血清を含む新鮮なニューロベースA培地で最終容量を最大30ミリリットルにします。次に、ろ過した細胞懸濁液を2本の15ミリリットルのコニカルチューブに分割して遠心分離し、ペレットを2.5ミリリットルの氷冷磁気セルソーティングバッファーに再懸濁してから細胞をプールします。カウント後、細胞を再度遠心分離し、ペレットを7つの細胞に1×10あたり90マイクロリットルの新鮮な磁気細胞選別緩衝液に再懸濁します。次に、7つの細胞に1×10あたり10マイクロリットルの抗04ビーズを加え、細胞溶液を穏やかにフリックして混合します。摂氏4度で15分間、5分ごとに穏やかにフリックした後、7つの細胞に10分の1回あたり2ミリリットルの磁気細胞ソーティングバッファーを穏やかに加え、遠心分離による洗浄を行い、上清を慎重に真空吸引して廃棄します。7つの細胞に1回10回ごとに新鮮な磁気細胞選別緩衝液の500マイクロリットルでペレットを再懸濁し、適切なサイズの磁気ビーズ選別カラムを対応する磁気分離器に配置します。40ミクロンのストレーナをカラムに置き、3ミリリットルの磁気セルソーティングバッファーでストレーナーを事前にすすぎ、カラムを乾燥させずにバッファーをカラムに通します。細胞をストレーナーに加え、続いてMagnetic Cell Sorting Bufferで1ミリリットル洗浄します。カラムは、1回の洗浄につき3 mmリットルの磁気細胞ソーティングバッファーで3回、1回はオリゴデンドロサイト増殖培地で洗浄します。次に、カラムを15 mLチューブに移し、プランジャーを使用して、5 mLの新鮮なオリゴデンドロサイト増殖培地をカラムに直ちに注入します。カウント後、細胞を適切なプレーティング密度に希釈し、24ウェルプレートのプレコートカバースリップのラミニンを100マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地と交換します。オリゴデンドロサイトを摂氏37度、CO25°Cで45分以内にインキュベートし、オリゴデンドロサイトのカバースリップへの接着を促進します。次に、24ウェルプレートの各ウェルに500マイクロリットルのオリゴデンドロサイト増殖培地を浸水させ、24時間のインキュベーションを行います。翌日、上清をオリゴデンドロサイト分化培地に交換し、細胞を固定の準備ができるまでインキュベーターに戻します。めっきの24時間後、細胞は、初期増殖オリゴデンドロサイトの特徴的な特徴である位相コントラスト顕微鏡法の下で双極性または三極性であるように見えます。免疫蛍光染色は、プレーティングの24時間後、これらのプレオリゴデンドロサイトの大部分がNG2およびO4標識も示す一方で、GFAPおよび抗01抗体による標識ははるかに一般的ではないことを示しています。これは、この段階の細胞の大部分が、未成熟または成熟オリゴデンドロサイトがほとんどないプレオリゴデンドロサイトであることを示唆しています。72時間後、オリゴデンドロサイトの形態は24時間後よりも複雑になり、初期のオリゴデンドロサイトマーカーであるNG2に陽性の細胞の頻度ははるかに低くなります。また、ほとんどの細胞はO4標識を示しており、この段階では細胞のほぼ半分が01抗体で染色されており、細胞がより成熟した表現型に分化していることが示唆されています。特に、アストロサイトの存在は極めて低いままです。これらの結果は、免疫磁気的に単離されたオリゴデンドロサイトが、時間の経過とともに、アストロサイトなどの他の細胞タイプの汚染をほとんど伴わずに、in vitroで成熟のステージ3に分化できることを示しています。このビデオを見れば、免疫磁気的単離を使用して新生児マウスの子から初代オリゴデンドロサイトを単離する方法を十分に理解できるはずです。このテクニックを習得すると、適切に実行すれば4時間で完了できます。ご覧いただきありがとうございます。あなたの実験に頑張ってください。

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

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学ぶマウスのオリゴデンドロサイトの免疫磁気分離法。新生マウスからO4陽性細胞を高純度で迅速に分離し、脱髄疾患や髄鞘形成のメカニズム研究に応用します。この技術は神経科学の基礎研究に貢献します。

マウスの主なオリゴデンドロサイトの特異的・迅速免疫分離

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