細胞に基づく試金の酵素補充療法の細胞内取り込みを中和する抗体の検出

この方法は、中和抗体が医薬品の安全性、有効性、薬物動態および薬力学的プロファイルに与える影響について、免疫原性およびバイオアナリシス分野における重要な疑問に答えるのに役立ちます。この技術の主な利点は、薬物特異的な中和抗体を半定量的に測定するための、高感度で生物学的に関連性のある細胞ベースの方法を提供することです。この手法では、蛍光色素で標識された酵素は、マンノース-6-リン酸残基の陽イオン非依存性マンノース-6-リン酸受容体またはCI-M6PRへの結合を介してJurkat細胞に侵入します。

酵素受容体の相互作用を防ぐ中和抗体は、フローサイトメトリーで測定すると蛍光の減少を誘導します。まず、96ウェルの丸底細胞培養プレートでウェルあたり100マイクロリットルの細胞増殖培地に100マイクロリットルのJurkat細胞を7.5倍10〜4番目のJurkat細胞に播種し、摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度95%で14〜20時間インキュベーションします。アッセイサンプルをまず無血清培地で1対2.5の比率で希釈します。

次に、各サンプルの60マイクロリットルを、96ウェルの白い丸底の非結合ポリプロピレンプレートの適切なウェルに加えます。これがサンプルインキュベーションプレートになります。スクリーニングで陽性となり、確認が必要なサンプルの場合は、酵素補充療法またはERTビーズのバイアルをボルテックスし、適切な数のビーズを15ミリリットルのコニカルチューブに追加して別のボルテックスを行います。

次に、チューブを磁気チューブラックに2分間置き、上清を慎重に取り除きます。4回目の洗浄後、新しい白い96ウェル丸底非結合ポリプロピレンプレートの適切なウェルに100マイクロリットルのビーズを追加します。すべてのビーズがメッキされたら、プレートを96ウェルのサイドスカートマグネットに置き、ビーズがペレットを形成するのを待ってから、透明な上清を慎重に取り除きます。

次に、各サンプルの140マイクロリットルを適切なウェルに加え、プレートをプラスチックフィルムで密封し、室温で約800RPMのロータリーシェーカーで少なくとも60分間振とうします。次に、確認プレートを96ウェルサイドスカートマグネットに置き、ビーズが別のペレットを形成するようにし、60マイクロリットルのサンプルを96ウェルの白い丸底の非結合ポリプロピレンサンプルインキュベーションプレートの適切なウェルに加えます。スクリーニングされ、陽性と確認されたサンプルについては、力価シリーズが実行される場合があります。

力価シリーズを調製するには、プールされたマトリックス中のサンプルを所定の力価カットポイントを交差するのに十分な回数連続希釈し、各希釈サンプルの60マイクロリットルをサンプルインキュベーションプレートの適切なウェルに追加し、60マイクロリットルの適切な濃度の蛍光色素標識ERTを新しい96ウェルの白い丸底非結合ポリプロピレンプレートの適切なウェルにテキストプロトコルに従って追加します。次に、蛍光色素分子ERTサンプル溶液を数回ピペットで動かして、プレートをホイルで包み、摂氏2〜8度で14〜20時間インキュベーションします。翌朝、サンプルプレートを摂氏37度のビーズ浴で10〜15分間温め、倒立顕微鏡で播種した細胞をチェックして、細胞が健康でウェル全体に均一に分布していることを確認します。

プレートが温まったら、実験プレートマップに従って100マイクロリットルのサンプルと蛍光色素標識ERT混合物を細胞プレートに加え、細胞をさらに3時間15分間細胞培養インキュベーターに戻します。インキュベーションの最後に、遠心分離によって細胞をペレット化し、各ウェルの底にペレットが存在することを確認します。プレートを30〜45度の角度で保持し、ペレットを乱さずに各ウェルの上清を慎重に除去し、遠心分離ごとにウェルあたり200マイクロリットルのDPBSで細胞を3回洗浄します。

最後の洗浄後、各ウェルに100マイクロリットルの生死染色を加え、暗所で室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの終了時に、遠心分離により細胞をペレット化し、ウェルあたり200マイクロリットルのDPBSで細胞を洗浄します。洗浄したペレットをウェルあたり摂氏2〜8度の1%パラホルムアルデヒドの100マイクロリットルに再懸濁し、プレートを密封して穏やかなパルスボルテックスを行います。

次に、プレートをホイルで包み、摂氏2〜8度で10分間固定します。フローサイトメトリーで細胞生存率を解析するには、細胞をウェルあたり50マイクロリットルのDPBSと混合して単一細胞懸濁液にし、標準的なフローサイトメトリープロトコルに従ってフローサイトメーターで細胞を読み取ります。その後、蛍光色素標識ERTの取り込みは、生細胞の蛍光強度の中央値またはMFIに従って評価できます。

アッセイで試験する前に、実験的スクリーニングカットポイントが陽性および陰性サンプルを決定するための閾値として計算されます。この例では、中和抗体の量が多いまたは少ない量をスパイクした品質管理を示しています。次に、陽性サンプルを薬物標識磁気ビーズを使用した確認アッセイで試験し、サンプルから薬物特異的抗体を枯渇させます。

回収率が確認カットポイントより大きいサンプルは陽性と見なされます。スクリーニングされ、陽性と確認されたサンプルは、力価アッセイで段階的に希釈および試験され、各サンプル中和抗体の相対力価が決定されます。力価は、力価カットポイントを横切る2つの希釈間の補間値です。

ここに示されているのは、フルオロフォア標識ERTの取り込みを評価した生シングルセルMFIです。例えば、この実験では、ポジティブコントロール抗体をスパイクしたマトリックスは、蛍光色素結合型ERTの取り込みを阻害し、蛍光強度の中央値を低く抑えました。対照的に、ポジティブコントロール抗体の非存在下でマトリックスとインキュベートした細胞は、蛍光強度の中央値が高く、蛍光色素結合ERTの取り込みを示しました。

この手順を試行する際は、信頼性が高く一貫した結果を得るために、厳密なインキュベーションウィンドウを維持することを覚えておくことが重要です。また、各酵素補充療法のアッセイを最適化することも重要です。この技術の開発後、この技術は、医薬品開発における免疫原性科学者やバイオアナリシス科学者が、細胞取り込み中和抗体がERTの安全性と有効性に与える影響を調査する道を開きました。

人間のサンプルを扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、すべてのサンプルが感染の可能性があるかのように扱う必要があることを忘れないでください。