Name: 膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-04-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 51 s
Description: 学ぶ膵臓生きた組織スライス法による膵島機能と免疫細胞相互作用の観察手法。バイブロトームを用いて組織を精密にスライスし、膵島の生理機能と免疫細胞の動態をリアルタイムで解析することで、1型糖尿病や2型糖尿病などの膵疾患の病態理解と治療戦略の開発に貢献します。

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この研究は、NIH助成金R01 DK123292、T32 DK108736、UC4 DK104194、UG3 DK122638、およびP01 AI042288によって資金提供されました。この研究は、糖尿病を有する膵臓臓器提供者のためのネットワークの支援を受けて行われました (nPOD;RRID:SCR_014641)、JDRF(nPOD:5-SRA-2018-557-Q-R)とレオナM.&ハリーB.ヘルムズリー慈善信託(グラント#2018PG-T1D053)が主催する共同1型糖尿病研究プロジェクト。表現された内容と見解は著者の責任であり、必ずしもnPODの公式見解を反映しているわけではありません。nPODと提携し、研究リソースを提供する臓器調達機関(OPO)を http://www.jdrfnpod.org/for-partners/npod-partners/ に掲載しています。マウススライスの生成に使用されるビブラートを提供してくれた、フロリダ大学のケビン・オットー博士に感謝します。

<ol><li>Uc, A., Fishman, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Pancreatic disorders.</a> Pediatric Clinics of North America. 64 (3), 685-706 (2017).</li>
<li>Bluestone, J. A., Herold, K., Eisenbarth, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics%2C+pathogenesis+and+clinical+interventions+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genetics, pathogenesis and clinical interventions in type 1 diabetes.</a> Nature. 464 (7293), 1293-1300 (2010).</li>
<li>Taylor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+2+diabetes%3A+etiology+and+reversibility%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Type 2 diabetes: etiology and reversibility.</a> Diabetes Care. 36 (4), 1047-1055 (2013).</li>
<li>Meier, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+of+Langerhans+isolation+from+pediatric+and+juvenile+donor+pancreases%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+International%22%5BJournal%5D)">Islet of Langerhans isolation from pediatric and juvenile donor pancreases.</a> Transplant International. 27 (9), 949-955 (2014).</li>
<li>Marciniak, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+in+situ+studies+of+islet+of+Langerhans+and+acinar+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for in situ studies of islet of Langerhans and acinar cell biology.</a> Nature Protocols. 9 (12), 2809-2822 (2014).</li>
<li>Panzer, J. K., Cohrs, C. M., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+pancreas+tissue+slices+for+the+study+of+islet+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Using pancreas tissue slices for the study of islet physiology.</a> Methods in Molecular Biology. 2128, 301-312 (2020).</li>
<li>Speier, S., Rupnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+in+situ+characterization+of+pancreatic+beta-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Archive%22%5BJournal%5D)">A novel approach to in situ characterization of pancreatic beta-cells.</a> Pflugers Archive. 446 (5), 553-558 (2003).</li>
<li>Panzer, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas+tissue+slices+from+organ+donors+enable+in+situ+analysis+of+type+1+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Pancreas tissue slices from organ donors enable in situ analysis of type 1 diabetes pathogenesis.</a> JCI Insight. 5 (8), 134525(2020).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatitis-induced+depletion+of+syntaxin+2+promotes+autophagy+and+increases+basolateral+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Pancreatitis-induced depletion of syntaxin 2 promotes autophagy and increases basolateral exocytosis.</a> Gastroenterology. 154 (6), 1805-1821 (2018).</li>
<li>Dolai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreas-specific+SNAP23+depletion+prevents+pancreatitis+by+attenuating+pathological+basolateral+exocytosis+and+formation+of+trypsin-activating+autolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Pancreas-specific SNAP23 depletion prevents pancreatitis by attenuating pathological basolateral exocytosis and formation of trypsin-activating autolysosomes.</a> Autophagy. , 1-14 (2020).</li>
<li>Qadir, M. M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+culture+of+human+pancreatic+slices+as+a+model+to+study+real-time+islet+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Long-term culture of human pancreatic slices as a model to study real-time islet regeneration.</a> Nature Communications. 11 (1), 3265(2020).</li>
<li>Cohrs, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunction+of+persisting+%CE%B2+cells+is+a+key+feature+of+early+type+2+diabetes+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Dysfunction of persisting β cells is a key feature of early type 2 diabetes pathogenesis.</a> Cell Reports. 31 (1), 107469(2020).</li>
<li>Liang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ex+vivo+human+pancreatic+slice+preparations+offer+a+valuable+model+for+studying+pancreatic+exocrine+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ex vivo human pancreatic slice preparations offer a valuable model for studying pancreatic exocrine biology.</a> Journal of Biological Chemistry. 292 (14), 5957-5969 (2017).</li>
<li>Shultz, L. D., Ishikawa, F., Greiner, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+mice+in+translational+biomedical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized mice in translational biomedical research.</a> Nat Reviews. Immunology. 7 (2), 118-130 (2007).</li>
<li>Lamont, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+mechanisms+allow+undersized+anchor-deficient+class+I+MHC+ligands+to+mediate+pathogenic+autoreactive+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Compensatory mechanisms allow undersized anchor-deficient class I MHC ligands to mediate pathogenic autoreactive T cell responses.</a> Journal of Immunology. 193 (5), 2135-2146 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anesthesia+and+analgesia+in+laboratory+animals%22">Anesthesia and analgesia in laboratory animals</a>. Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. , Academic Press. (2011).</li>
<li>Clark, S. A., Borland, K. M., Sherman, S. D., Rusack, T. C., Chick, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+and+in+vitro+toxicity+of+dithizone+with+canine%2C+porcine%2C+and+bovine+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">Staining and in vitro toxicity of dithizone with canine, porcine, and bovine islets.</a> Cell Transplantation. 3 (4), 299-306 (1994).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Monette, R., Small, D. L., Mealing, G., Morley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+confocal+assay+to+assess+neuronal+viability+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">A fluorescence confocal assay to assess neuronal viability in brain slices.</a> Brain Research Protocols. 2 (2), 99-108 (1998).</li>
<li>Gál, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+in+situ+approach+to+studying+pancreatic+ducts+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel in situ approach to studying pancreatic ducts in mice.</a> Frontiers in Physiology. 10, 938(2019).</li>
<li>Stožer, A., Dolenšek, J., Rupnik, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-stimulated+calcium+dynamics+in+islets+of+Langerhans+in+acute+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Glucose-stimulated calcium dynamics in islets of Langerhans in acute mouse pancreas tissue slices.</a> PloS One. 8 (1), 54638(2013).</li>
<li>Stožer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+connectivity+in+islets+of+Langerhans+from+mouse+pancreas+tissue+slices%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Functional connectivity in islets of Langerhans from mouse pancreas tissue slices.</a> PLoS Computational Biology. 9 (2), 1002923(2013).</li>
<li>Früh, E., Elgert, C., Eggert, F., Scherneck, S., Rustenbeck, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucagonotropic+and+glucagonostatic+effects+of+KATP+channel+closure+and+potassium+depolarization%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Glucagonotropic and glucagonostatic effects of KATP channel closure and potassium depolarization.</a> Endocrinology. 162 (1), 136(2021).</li>
<li>Satin, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+for+sulfonylurea+control+of+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine%22%5BJournal%5D)">New mechanisms for sulfonylurea control of insulin secretion.</a> Endocrine. 4 (3), 191-198 (1996).</li>
<li>Ren, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+oscillations+of+KATP+conductance+in+mouse+pancreatic+islets+provide+support+for+electrical+bursting+driven+by+metabolic+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Slow oscillations of KATP conductance in mouse pancreatic islets provide support for electrical bursting driven by metabolic oscillations.</a> American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 305 (7), 805-817 (2013).</li>
<li>Marciniak, A., Selck, C., Friedrich, B., Speier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+pancreas+tissue+slice+culture+facilitates+long-term+studies+of+exocrine+and+endocrine+cell+physiology+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse pancreas tissue slice culture facilitates long-term studies of exocrine and endocrine cell physiology in situ.</a> PLoS One. 8 (11), 78706(2013).</li>
<li>Dzhagalov, I. L., Melichar, H. J., Ross, J. O., Herzmark, P., Robey, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+the+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of the immune system.</a> Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12, Unit 12.26 (2012).</li>
</ol>

著者らは競合する利益を宣言しない。

このプロトコルの目的は、膵臓スライスの生成と機能および免疫学的研究でスライスを採用するために必要な手順を説明することです。生きた膵スライスを使用するには多くの利点があります。しかし、記載された実験プロトコルの間に組織が生存可能で有用であり続けるために不可欠ないくつかの重要なステップがあります。迅速に作業することが不可欠です。膵臓を注入し、ビブラートメ上のスライスを生成する間の時間の長さは、組織の生存率を維持するために最小限に抑える必要があります。生存率はまた室温ECSとは対照的にスライスする前に冷たいECSで膵臓を保つことによって改善される。重要なことに、スライスはプロテアーゼ阻害剤なしで培地に入るべきではありません。プロテアーゼ阻害剤を使わずにスライスをインキュベートすると、生存率が大きく低下する。
染料のロード中にスライスが阻害剤なしで一時的に放置されたとき、高グルコースおよびKClに応答するCa2+フラックスは、スライスにまだ基礎活性がまだ見えないにもかかわらず記録されなくなりました。KRBHを含む生きたスライスと使用されるすべての溶液は、3 mM D-...

膵臓の関与は、膵炎、T1D、およびT2D1,2,3などの疾患に対する病理性である。孤立した小島における機能の研究は、通常、周囲の環境4から小島を除去することを含む。生きた膵臓組織スライス法は、膵臓組織の研究を可能にし、膵臓の微小環境をそのまま維持し、ストレスの多い膵島分離手順の使用を回避するために開発されました。ヒトドナー組織からの膵組織スライスはT1Dの研究に成功し、免疫細胞浸潤に加えてベータ細胞喪失および機能不全のプロセスを実証した8,9,10,11,12,13。生きた膵臓組織スライス法は、マウスおよびヒト膵組織の両方に適用することができる5,6,8。臓器提供組織からのヒト膵臓組織スライスは、糖尿病を有する膵臓臓器提供者ネットワーク(nPOD)との共同研究を通じて得られる。マウススライスは、さまざまなマウス株から生成することができます。
このプロトコルは、非肥満糖尿病-再結合活性化遺伝子-1-ヌル(NOD.ラグ1---)およびT細胞受容体トランスジェニック(AI4)(NOD.ラグ1-/-.AI4 α/β)マウス株。頷く。Rag1-/- マウスは、組換え活性化遺伝子1(Rag1)14の破壊によりT細胞およびB細胞を発達させることができない。頷く。ラグ1-/-.AI4 α/β マウスは、インスリンのエピトープを標的とする単一のT細胞クローンを産生し、一貫した小地浸潤および急速な疾患開発をもたらすため、加速1型糖尿病のモデルとして使用されます15。ここで取り上げたプロトコルは、共焦点顕微鏡法の適用を通じて、生きたヒトおよびマウス膵スライスを用いた機能および免疫学的研究の手順を説明する。本明細書に記載されている技術には、生存率評価、小口同定および位置、細胞細胞細胞Ca2+ 記録、ならびに免疫細胞集団の染色および同定が含まれる。

<table><tbody><tr><td>#3 スタイル メス ハンドル</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-000-163</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES</td> フィ<td>ッシャー サイエンティフィック</td><td>BP299-100</td><td>HEPES バッファー、1M 溶液</td></tr><tr><td>10 cm 未処理培養皿</td><td>コーニング</td><td>430591</td><td></td></tr><tr><td>10 mL ルアーロック シリンジ</td><td></td><td>BD 301029</td><td>BD シリンジ ルアーロック チップ付き</td></tr><tr><td>27 G ニードル</td><td>BD</td><td>BD 305109</td><td>BD一般使用およびPrecisionGlide皮下注射針</td></tr><tr><td>35 mmカバーガラス底ペトリ皿</td><td>Ibidi</td><td>81156</td><td>&micro;-ディッシュ35 mm、高</td></tr><tr><td>50 mLシリンジ</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>8ウェルチャンバーカバーガラス</td><td>Ibidi</td><td>80826</td><td>&micro;-スライド8ウェル</td></tr><tr><td>APC抗マウスCD8a抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>フィッシャーScientific</td><td>199898</td><td></td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td></td><td>Σ C5670</td><td>CaCl2</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>Σ</td><td>C7902</td><td>CaCl2 (二水和物)</td></tr><tr><td>コンパクトデジタルロッカー</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td><td>ック 88880020</td><td></td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査顕微鏡</td><td>ライカ</td><td>SP8</td><td>ピンホール&thinsp;= 1.5-2風通しの良いユニット;10x/0.40 開口数 HC PL APO CS2 dry および 20x/0.75 開口数 HC PL APO CS2 dry 対物レンズで 512&thinsp で取得。&times;&シンスプ;512ピクセル解像度</td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td></td><td>Sigma G7021</td><td>C6H12O6</sub</td></tr><tr><td>>ddiH2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dithizone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5130-10G</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Invitrogen</td><td>D12345</td><td>Dimethyl sulfoxide</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm 組織培養ディッシュ</td><td>Corning</td><td>353001</td><td>Falcon Easy-Grip 組織培養ディッシュ</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10082147</td><td></td></tr><tr><td>Feather No. 10 Surgical Blade</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>7204410</td><td></td></tr><tr><td>fluo-4-AM</td><td>Invitrogen</td><td>F14201</td><td>細胞透過性 Ca2+ インジケーター</td></tr><tr><td>ゲルコントロール スーパーグルー</td><td>Loctite</td><td>45198</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>硬化ファインハサミ</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025092</td><td>Hanks Balanced Salt Solution</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td>C8H18N2O4S</td></tr><tr><td>アイスバケツ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>03-395-150</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン</td><td>パターソン獣医</td><td>NDC 14043-704-05</td><td></td></tr><tr><td>ジョンズホプキンスブルドッグクランプ</td><td>ロボズ外科店</td><td>RS-7440</td><td>&nbsp;直;500-900グラムの圧力;1.5 "長さ</td></tr><tr><td></td><td>Kimwipesキンバリークラークプロフェッショナル</td><td>34705</td><td>Kimtech科学&貿易;キムワイプ&トレード;デリケートタスクワイパー、2層</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD生存率/細胞毒性キット</td><td>Invitrogen</td><td>L3224</td><td>このキットには、calcein-AM生細胞色素が含まれています。</td></tr><tr><td>低グルコース DMEM</td><td>コーニング</td><td>10-014-CV</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td>MgCl2 (六水和物)</td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム七水和物</td><td>Σ</td><td>M2773</td><td>MgSO4 (七水和物)</td></tr><tr><td>磁気加熱プラットフォーム</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>PM-1</td><td>動的刺激用イメージングチャンバー用プラットフォーム録音</td></tr><tr><td>マイクロ波</td><td>GE</td><td>JES1460DSWW</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene シリンジフィルター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>726-2520</td><td></td></tr><tr><td>No.4 ペイントブラシ</td><td>マイケルズ</td><td>10269140</td><td></td></tr><tr><td>オープンダイヤモンド バス イメージングチャンバー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>RC-26</td><td>ダイナミックスティミュレーション用イメージングチャンバー</td></tr><tr><td>録音 オレゴングリーン 488 BAPTA-1-AM</td><td>Invitrogen</td><td>O6807</td><td>細胞透過性 Ca2+</td></tr><tr><td>インジケーター オーバーナイトイメージングチャンバー</td><td>Okolab</td><td>H201-LG</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>20012050</td><td>スライス生成用アガロースを作るには</td></tr><tr><td>PE標識インスリンテトラマー</td><td>エモリーテトラマー 研究コア</td><td>配列 YAIENYLEL</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td>KCl</td></tr><tr><td>リン酸カリウム 一塩基性</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>Razor Blades</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>71998</td><td>ビブラトーム用;ダブルエッジステンレススチール、コーティングなし</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SeaPlaque 低融点アガロース</td><td>ロンザ</td><td>50101</td><td>スライス生成用アガロースを作るには</td></tr><tr><td>スライスアンカー</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>64-1421</td><td></td></tr><tr><td>スライスアンカー(ダイナミックイメージング)</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>640253</td><td>ダイナミックイメージングチャンバー</td></tr><tr><td>用スライスアンカー重炭酸ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S5761</td><td>NaHCO3</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Σ</td><td>S5886</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム一水和物</td><td>Σ</td><td>S9638</td><td>NaH2PO4 (一水和物)</td></tr><tr><td>大豆トリプシン阻害剤</td><td>Σ</td><td>T6522-1G</td><td>グリシンmax(大豆)ステージからのトリプシン阻害剤</td></tr><tr><td>アダプター</td><td>ワーナー・インスツルメンツ</td><td>SA-20MW-AL</td><td>顕微鏡ステージでの動的刺激記録のためのイメージングチャンバーに適合</td></tr><tr><td>ステージトップインキュベーター</td><td>Okolab</td><td>H201</td><td></td></tr><tr><td>ステレオスコープ</td><td>ライカ</td><td>IC90 E MSV266</td><td></td></tr><tr><td>SYTOX ブルーデッドセル染色</td><td>Invitrogen</td><td>S34857</td><td>青色蛍光核酸染色</td></tr><tr><td>トランスファーピペット</td><td>ファルコン</td><td>357575</td><td>Falcon&trade;プラスチック 使い捨てトランスファー ピペット</td></tr><tr><td>バルブ制御システム</td><td>ワーナーインスツルメンツ</td><td>VCS-8</td><td>動的刺激録音用システム</td></tr><tr><td>ビブレーター VT1000 S</td><td>ライカ</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>FSGPD02</td><td>フィッシャーブランド アイソテンプ ゼネラルパーパス デラックスウォーターバス GPD 02</td></tr></tbody></table>

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

Observing Islet Function and Islet-Immune Cell Interactions in Live Pancreatic Tissue Slices

生きた膵臓組織スライスは、膵島の生理学と、無傷の膵島微小環境の文脈での機能の研究を可能にする。スライスはアガロースに埋め込まれた生きたヒトおよびマウス膵臓組織から調製され、ビブラートメを使用して切断される。この方法は、組織が1型(T1D)および2型糖尿病(T2D)などの基礎的な病理を維持することに加えて、生存率と機能を維持することを可能にする。このスライス法は、膵臓の内分泌組織と外分泌組織を構成する複雑な構造および様々な細胞間相互作用の維持を通じて、膵臓の研究における新たな方向性を可能にする。このプロトコルは膵臓のスライス内の生きた内因性免疫細胞の染色およびタイムラプス顕微鏡を、膵臓生理学の評価と共に行う方法を示す。さらに、この手法は、主要な組織適合性複合体多体試薬を用いて、小島細胞抗原に特異的な免疫細胞集団を識別するように精製することができる。

このプロトコルは、機能研究と免疫細胞の記録の両方に適した生きた膵臓組織スライスを生み出す。明視野と反射光の下の両方でスライスの外観を図1A,Bに示します。議論したように、小島は、インスリン含有量(図1C)のために発生する粒度の増加による反射光を使用したスライスに見つけることができ、反射光が使用される場合にはバックグラウンド組織と比較して明確に観察される。生存率はスライス生成後に評価されるべきであり、島の20%以上が生存できない場合は、島を記録すべきではない。生存率の高いアイレットを図1Dに示すのに対し、処理不良のスライスの例を補足図1に示します。生存率の低い島はSYTOXブルー染色が重くなり、組織は死んだ細胞の染色された核で覆われます。さらに、オレゴングリーン488 BAPTA-1、AMがここで使用し、Fluo-4-AMなどのカルセインAMとCa2+の指標は死んだ細胞にう...

本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。

Live pancreatic tissue slices allow for the study of islet physiology and function in the context of an intact islet microenvironment. Slices are prepared ...

私たちのプロトコルは、免疫細胞相互作用が小水機能に与える影響に答えるのに役立ちます。膵臓の生きた組織スライス法は、膵島の生理学と機能を研究しながら、基礎となる病理および天然の微小環境を維持することを可能にする。この方法は、膵炎、I型糖尿病、II型糖尿病などの膵臓疾患の疾患プロセスに関する洞察を提供する可能性があります。まず、ブレード幅を超えないように、サンプルホルダーのブロックを配置し、ビブラートメがゆっくりと動いたときにブレードが可能な限り少ない距離で進むことができるようにします。標本ホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端を使用して薄い層を作り、組織ブロックを接着剤に反転させ、組織に近い側が上向きになるようにします。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。次に、ねじでビブラートメにプレートを取り付け、ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上を移動するようにブレードの高さと距離を調整します。ブロックを鉗子で軽く動かして接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまで細胞外溶液でビブラートメトレイを満たします。ビブラートオムを120マイクロメートルの厚さのスライスを作り、それを開始し、その後、組織ブロックから外れるスライスを観察します。彼らはそれらの下にペイントブラシや鉗子を配置することによってブロックから浮かぶときにスライスを持ち上げ、3ミリモルDグルコースとトリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液にスライスを置きます。スライスを含むプレートをロッカーに置き、室温で25RPMで1時間インキュベートします。スライスを長く保つ必要がある場合は、スライスを15ミリリットルのスライス培地に入れ、プレートをインキュベーターに入れる。同じ日の研究のために摂氏37度で調製したスライスをインキュベートするか、実験の前に少なくとも1時間摂氏37度まで一晩で摂氏24度で培養されたスライスを移します。記録の少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に平衡化します。ステージ上のスライスを含むカバーガラス底ペトリ皿を固定します。明視野モードで10Xの目標を設定して顕微鏡を焦点を当て、スライス内のオレンジ色の茶色の楕円形を探すことによって、明るいフィールドモードを使用して島を見つけます。顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率を使用して小島を表示するには、638レーザー検出器とPMT検出器をオンにします。レーザーパワーを1~2%に設定し、ノッチフィルタをオフにします。405ナノメートルレーザーとPMT検出器を使用して、核酸染色を観察します。CD8抗体検出用のハイブリッド検出器と488ナノメートルレーザーおよびハイブリッド検出器はインスリン四量体を見る。ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的の小地が見つかったら、20Xの目標に切り替えてズームインし、小子がフレームの大部分を占めます。小地のzスタックを取り、その後、細胞が生きていると任意の周囲の免疫細胞が焦点を当てている最高の光学セクションを見つけます。XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定し、数時間の期間にわたって20分ごとに選択したステップのZスタックを記録するように設定を最適化します。膵臓組織スライス中の膵島を、明視野と反射光顕微鏡を用いて可視化した。小島のインスリンは粒度を増加させ、大量の反射光の吸収を引き起こし、小島の視認性を高める。生きたヒト膵臓組織スライスの生存率を染色によって評価した。生細胞は緑色で示され、死んだ細胞は青で示されます。生存率のもう一つの肯定的な指標は、観察可能な基底活動である。生きた膵スライスに細胞透過性カルシウム指標を積んだとき、マウスとヒトの両方の膵臓スライスでグルコース刺激が観察された。グルコース刺激時の個々の細胞の蛍光も定量化した。インタクトおよび病気の小島は、ジチゾン染色および反射光顕微鏡を用いて観察された。病気の小島は、免疫細胞浸潤と細胞死のために粒度を失い始める。免疫細胞集団は、CD8抗体およびインスリン四量体染色を使用して同定することができる。共染色は、細胞がインスリン抗原を特異的に標的とするエフェクターT細胞であることを示す。この手順で覚えておくべきことの最も重要なことは、溶液プロテアーゼ阻害剤のスライスを常に保持することです。この手順に従って、免疫細胞実験における多数の機能性を、免疫細胞相互作用および小子機能の効果を研究することを可能にすることができる。

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JoVE Journal

Immunology and Infection

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急性マウス膵臓組織スライスにおけるカルシウム動態の共焦点レーザー走査顕微鏡

膵臓内イメージングウィンドウを用いたマウスモデルにおける膵臓の細胞レベル可視化におけるビ ボ における縦方向の安定化

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内分泌および外分泌膵臓生理学を研究するためのヒト膵臓組織スライスの生成

学ぶ膵臓生きた組織スライス法による膵島機能と免疫細胞相互作用の観察手法。バイブロトームを用いて組織を精密にスライスし、膵島の生理機能と免疫細胞の動態をリアルタイムで解析することで、1型糖尿病や2型糖尿病などの膵疾患の病態理解と治療戦略の開発に貢献します。

膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察

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