膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察
April 12th, 2021
本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。
私たちのプロトコルは、免疫細胞相互作用が小水機能に与える影響に答えるのに役立ちます。膵臓の生きた組織スライス法は、膵島の生理学と機能を研究しながら、基礎となる病理および天然の微小環境を維持することを可能にする。この方法は、膵炎、I型糖尿病、II型糖尿病などの膵臓疾患の疾患プロセスに関する洞察を提供する可能性があります。
まず、ブレード幅を超えないように、サンプルホルダーのブロックを配置し、ビブラートメがゆっくりと動いたときにブレードが可能な限り少ない距離で進むことができるようにします。標本ホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端を使用して薄い層を作り、組織ブロックを接着剤に反転させ、組織に近い側が上向きになるようにします。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。
次に、ねじでビブラートメにプレートを取り付け、ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上を移動するようにブレードの高さと距離を調整します。ブロックを鉗子で軽く動かして接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまで細胞外溶液でビブラートメトレイを満たします。ビブラートオムを120マイクロメートルの厚さのスライスを作り、それを開始し、その後、組織ブロックから外れるスライスを観察します。
彼らはそれらの下にペイントブラシや鉗子を配置することによってブロックから浮かぶときにスライスを持ち上げ、3ミリモルDグルコースとトリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液にスライスを置きます。スライスを含むプレートをロッカーに置き、室温で25RPMで1時間インキュベートします。スライスを長く保つ必要がある場合は、スライスを15ミリリットルのスライス培地に入れ、プレートをインキュベーターに入れる。
同じ日の研究のために摂氏37度で調製したスライスをインキュベートするか、実験の前に少なくとも1時間摂氏37度まで一晩で摂氏24度で培養されたスライスを移します。記録の少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に平衡化します。ステージ上のスライスを含むカバーガラス底ペトリ皿を固定します。
明視野モードで10Xの目標を設定して顕微鏡を焦点を当て、スライス内のオレンジ色の茶色の楕円形を探すことによって、明るいフィールドモードを使用して島を見つけます。顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率を使用して小島を表示するには、638レーザー検出器とPMT検出器をオンにします。
レーザーパワーを1~2%に設定し、ノッチフィルタをオフにします。405ナノメートルレーザーとPMT検出器を使用して、核酸染色を観察します。CD8抗体検出用のハイブリッド検出器と488ナノメートルレーザーおよびハイブリッド検出器はインスリン四量体を見る。
ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的の小地が見つかったら、20Xの目標に切り替えてズームインし、小子がフレームの大部分を占めます。小地のzスタックを取り、その後、細胞が生きていると任意の周囲の免疫細胞が焦点を当てている最高の光学セクションを見つけます。
XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定し、数時間の期間にわたって20分ごとに選択したステップのZスタックを記録するように設定を最適化します。膵臓組織スライス中の膵島を、明視野と反射光顕微鏡を用いて可視化した。小島のインスリンは粒度を増加させ、大量の反射光の吸収を引き起こし、小島の視認性を高める。
生きたヒト膵臓組織スライスの生存率を染色によって評価した。生細胞は緑色で示され、死んだ細胞は青で示されます。生存率のもう一つの肯定的な指標は、観察可能な基底活動である。
生きた膵スライスに細胞透過性カルシウム指標を積んだとき、マウスとヒトの両方の膵臓スライスでグルコース刺激が観察された。グルコース刺激時の個々の細胞の蛍光も定量化した。インタクトおよび病気の小島は、ジチゾン染色および反射光顕微鏡を用いて観察された。
病気の小島は、免疫細胞浸潤と細胞死のために粒度を失い始める。免疫細胞集団は、CD8抗体およびインスリン四量体染色を使用して同定することができる。共染色は、細胞がインスリン抗原を特異的に標的とするエフェクターT細胞であることを示す。
この手順で覚えておくべきことの最も重要なことは、溶液プロテアーゼ阻害剤のスライスを常に保持することです。この手順に従って、免疫細胞実験における多数の機能性を、免疫細胞相互作用および小子機能の効果を研究することを可能にすることができる。
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概要
この研究は、膵臓の生組織スライスを用いてアイレットの生理学とアイレット-免疫細胞の相互作用の研究に応用することを提示しています。この方法により、本来の微小環境を保ちながらアイレットの機能性を検討することができます。
主要な研究構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- アイレット細胞はグルコース代謝において重要な役割を果たします。
- 免疫細胞の相互作用はアイレット機能に影響を与える可能性があります。
- これらの相互作用を理解することは膵臓疾患に対処する上で重要です。
- 生体組織スライスは細胞の生理学的文脈を維持します。
研究目的
- 免疫細胞の相互作用がアイレット機能性に与える影響を調査すること。
- I型およびII型糖尿病などの膵臓疾患に関する洞察を提供すること。
- 組織の病理と微小環境を保持する方法を開発すること。
使用した方法
- 生体膵臓組織スライスの準備。
- 精密なスライスに用いる振動ブレードの利用。
- 組織ブロックの安定化に用いるスーパーグルーの適用。
- アイレット-免疫細胞の相互作用をリアルタイムで観察すること。
主要な結果
- 生体膵臓組織スライス法はアイレットの生理を効果的に保持します。
- 免疫細胞の相互作用がアイレット機能に有意な影響を与えることが示されました。
- このアプローチにより基礎となる病理の研究が可能になります。
- 得られた洞察は膵臓疾患の治療戦略に情報を提供する可能性があります。
結論
- 生体膵臓組織スライスはアイレット生理を研究する上で価値あるツールです。
- この方法はアイレット機能における免疫相互作用の理解を深めることができます。
- 将来の研究はこれらの知見を基に膵臓疾患に対処することができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Live pancreatic tissue slices enable direct observation of islet-immune cell interactions within a preserved native microenvironment, offering a physiologically relevant system for mechanistic de-risking in diabetes target validation. This approach supports predictive confidence by maintaining tissue viability and underlying pathologies such as type 1 and type 2 diabetes, allowing R&D teams to assess therapeutic hypotheses in a disease-relevant context. The method bridges discovery biology and translational research by providing quantitative, real-time readouts of islet function and immune cell dynamics critical for go/no-go decisions in early diabetes drug discovery.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing immune cell infiltration and its direct impact on islet granule integrity and insulin release.
- Operational Value: Preserves native tissue architecture and cellular interactions, reducing mechanistic ambiguity in target validation for immunomodulatory diabetes therapies.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by linking immune cell activity to functional islet decline, providing a biomarker-aligned readout for target engagement.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts from calcium indicators and insulin tetramer staining to assess dose-dependent compound effects on islet function.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and imaging protocols, ensuring reproducible baseline measurements across experimental runs and model systems.
- Scalability: Compatible with time-lapse microscopy and z-stack acquisition, enabling longitudinal monitoring of immune cell dynamics over several hours.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Maintains underlying pathologies from human and mouse pancreatic tissue, allowing study of type 1 and type 2 diabetes mechanisms in a disease-relevant system.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation by preserving intercellular interactions critical for immune-mediated islet dysfunction.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables visualization of effector T-cell interactions with insulin antigens via CD8 and insulin tetramer co-staining, supporting mechanism-based go/no-go decisions.
Pipeline & Workflow Integration
The live pancreatic tissue slice method fits within the discovery continuum from target validation through preclinical research, providing a disease-relevant system that maintains tissue viability and microenvironment for mechanistic studies of islet-immune interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling real-time observation of immune cell impact on islet physiology, clarifying pathways involved in diabetes pathogenesis.
- Screening: Delivers assay-ready tissue slices with quantitative outputs from glucose-stimulated calcium flux and insulin tetramer binding, facilitating reliable compound evaluation.
- Analytics: Generates XYZT time-lapse data and z-stack optical sections, allowing teams to quantify cellular responses and immune cell localization over time.
- Translational Research: Maintains disease-relevant pathologies and native microenvironment, supporting continuity from discovery through preclinical validation of immunomodulatory mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying islet function across multiple disease models and therapeutic modalities, reducing redundant model development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct visualization of islet-immune interactions in intact tissue.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via controlled slicing, incubation, and imaging protocols that maintain slice viability and function.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immune cell activity to functional islet decline, reducing late-stage biological risk in diabetes drug development.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on their ability to mitigate immune-mediated islet dysfunction in a disease-relevant system.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue handling, vibratome sectioning, and confocal microscopy for live imaging of immune cell dynamics.
- Dependent on instrumentation including a vibratome, confocal microscope with laser detectors (405nm, 488nm, 638nm), and stage-top incubator for environmental control.
- Necessitates cross-team standardization of slice preparation, buffer composition (Krebs-Ringer bicarbonate with D-glucose and trypsin inhibitor), and incubation conditions to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different model systems (human vs. mouse) or disease states (T1D vs. T2D) to maintain tissue viability and pathological relevance.
- Includes practical limitations such as the need for protease inhibitors to preserve slice integrity and the technical challenge of maintaining optical clarity during long-term time-lapse imaging.
