膵臓の生きた組織スライスにおける膵島機能と膵島免疫細胞相互作用の観察
2021年4月12日
本研究は、膵島の生理学と膵島免疫細胞相互作用の研究に生きた膵臓組織スライスを適用することを示す。
私たちのプロトコルは、免疫細胞相互作用が小水機能に与える影響に答えるのに役立ちます。膵臓の生きた組織スライス法は、膵島の生理学と機能を研究しながら、基礎となる病理および天然の微小環境を維持することを可能にする。この方法は、膵炎、I型糖尿病、II型糖尿病などの膵臓疾患の疾患プロセスに関する洞察を提供する可能性があります。
まず、ブレード幅を超えないように、サンプルホルダーのブロックを配置し、ビブラートメがゆっくりと動いたときにブレードが可能な限り少ない距離で進むことができるようにします。標本ホルダーにスーパーグルーのラインを適用し、接着剤ディスペンサーの端を使用して薄い層を作り、組織ブロックを接着剤に反転させ、組織に近い側が上向きになるようにします。ブロックを軽く押し下げ、接着剤を3分間乾燥させます。
次に、ねじでビブラートメにプレートを取り付け、ブレードがブロックの長さ、そしてかろうじてそれらの上を移動するようにブレードの高さと距離を調整します。ブロックを鉗子で軽く動かして接着剤が乾燥したことを確認し、ブレードが覆われるまで細胞外溶液でビブラートメトレイを満たします。ビブラートオムを120マイクロメートルの厚さのスライスを作り、それを開始し、その後、組織ブロックから外れるスライスを観察します。
彼らはそれらの下にペイントブラシや鉗子を配置することによってブロックから浮かぶときにスライスを持ち上げ、3ミリモルDグルコースとトリプシン阻害剤を含むクレブスリンガー重炭酸塩緩衝液にスライスを置きます。スライスを含むプレートをロッカーに置き、室温で25RPMで1時間インキュベートします。スライスを長く保つ必要がある場合は、スライスを15ミリリットルのスライス培地に入れ、プレートをインキュベーターに入れる。
同じ日の研究のために摂氏37度で調製したスライスをインキュベートするか、実験の前に少なくとも1時間摂氏37度まで一晩で摂氏24度で培養されたスライスを移します。記録の少なくとも1時間前に顕微鏡のスイッチを入れ、ステージトップインキュベーターを摂氏37度に平衡化します。ステージ上のスライスを含むカバーガラス底ペトリ皿を固定します。
明視野モードで10Xの目標を設定して顕微鏡を焦点を当て、スライス内のオレンジ色の茶色の楕円形を探すことによって、明るいフィールドモードを使用して島を見つけます。顕微鏡のタッチスクリーンコントローラのCSボタンを押して、顕微鏡を共焦点イメージングに切り替えます。反射率を使用して小島を表示するには、638レーザー検出器とPMT検出器をオンにします。
レーザーパワーを1~2%に設定し、ノッチフィルタをオフにします。405ナノメートルレーザーとPMT検出器を使用して、核酸染色を観察します。CD8抗体検出用のハイブリッド検出器と488ナノメートルレーザーおよびハイブリッド検出器はインスリン四量体を見る。
ステージコントローラのXとYノブを使用して、視野に関心のある小地を中央に配置します。目的の小地が見つかったら、20Xの目標に切り替えてズームインし、小子がフレームの大部分を占めます。小地のzスタックを取り、その後、細胞が生きていると任意の周囲の免疫細胞が焦点を当てている最高の光学セクションを見つけます。
XYZTモードで記録するように顕微鏡を設定し、数時間の期間にわたって20分ごとに選択したステップのZスタックを記録するように設定を最適化します。膵臓組織スライス中の膵島を、明視野と反射光顕微鏡を用いて可視化した。小島のインスリンは粒度を増加させ、大量の反射光の吸収を引き起こし、小島の視認性を高める。
生きたヒト膵臓組織スライスの生存率を染色によって評価した。生細胞は緑色で示され、死んだ細胞は青で示されます。生存率のもう一つの肯定的な指標は、観察可能な基底活動である。
生きた膵スライスに細胞透過性カルシウム指標を積んだとき、マウスとヒトの両方の膵臓スライスでグルコース刺激が観察された。グルコース刺激時の個々の細胞の蛍光も定量化した。インタクトおよび病気の小島は、ジチゾン染色および反射光顕微鏡を用いて観察された。
病気の小島は、免疫細胞浸潤と細胞死のために粒度を失い始める。免疫細胞集団は、CD8抗体およびインスリン四量体染色を使用して同定することができる。共染色は、細胞がインスリン抗原を特異的に標的とするエフェクターT細胞であることを示す。
この手順で覚えておくべきことの最も重要なことは、溶液プロテアーゼ阻害剤のスライスを常に保持することです。この手順に従って、免疫細胞実験における多数の機能性を、免疫細胞相互作用および小子機能の効果を研究することを可能にすることができる。
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概要
本研究では、膵臓組織の生切片を、膵島生理学および膵島と免疫細胞の相互作用の研究に適用する方法を提示します。この手法により、本来の微小環境を維持したまま、膵島の機能性を検討することが可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 免疫学
背景
- 膵島細胞はグルコース代謝において重要な役割を果たします。
- 免疫細胞との相互作用は、膵島機能に影響を与える可能性があります。
- これらの相互作用を理解することは、膵疾患の治療に取り組む上で不可欠です。
- 生組織切片は、細胞の生理学的コンテキストを維持します。
研究目的
- 免疫細胞の相互作用が膵島機能に及ぼす影響を調査すること。
- 1型および2型糖尿病などの膵疾患に関する知見を提供すること。
- 組織の病理学的状態および微小環境を保持する手法を開発すること。
使用した手法
- 生膵臓組織切片の作製。
- 精密な切断のためのビブラトームの利用。
- 組織ブロック固定のためのシアノアクリレート系接着剤（スーパーグルー）の適用。
- 膵島と免疫細胞の相互作用のリアルタイム観察。
主要な結果
- 生体膵臓組織切片法は、膵島生理を効果的に維持する。
- 免疫細胞の相互作用が膵島機能に著しく影響することが示された。
- このアプローチにより、潜在的な病理の研究が可能になる。
- 得られた知見は、膵疾患の治療戦略に寄与する可能性がある。
結論
- 生きた膵臓組織切片は、島細胞の生理学を研究するための貴重なツールである。
- この手法により、島細胞機能における免疫相互作用への理解を深めることができる。
- 今後の研究では、これらの知見に基づいて膵臓疾患への対策を講じることが可能である。
よくある質問
産業上の重要性
生存膵臓組織スライスを用いることで、保存された天然の微小環境内で膵島と免疫細胞の相互作用を直接観察することが可能となり、糖尿病のターゲットバリデーションにおけるメカニズム的なリスク低減のための生理学的に適切なシステムを提供します。このアプローチは、組織の生存能および1型および2型糖尿病などの基礎となる病理を維持することで予測の信頼性を高め、研究開発チームが疾患に関連したコンテキストで治療仮説を評価することを可能にします。本手法は、膵島機能と免疫細胞ダイナミクスの定量的かつリアルタイムなリードアウトを提供し、初期の糖尿病創薬における意思決定（go/no-go決定）に不可欠な、探索生物学とトランスレーショナルリサーチの橋渡しとなります。
バイオファーマR&Dにおける戦略的応用
初期探索およびターゲットバリデーション
- 科学的価値：免疫細胞の浸潤と、それが膵島顆粒の完全性およびインスリン放出に与える直接的な影響を可視化することで、治療仮説の検証を可能にする。
- 運用の価値：天然の組織構造と細胞間相互作用を保持し、免疫調節糖尿病治療法のターゲット検証におけるメカニズム上の曖昧さを低減する。
- 予測的価値：免疫細胞の活性と機能的な膵島の低下を関連付けることで、ポートフォリオの選別を支援し、ターゲットエンゲージメントに関するバイオマーカーに沿った読み出し指標を提供する。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- 科学的価値： カルシウムインジケーターおよびインスリン四量体染色の定量的な蛍光読み取り値を生成し、膵島機能に対する化合物の用量依存的な影響を評価します。
- 運用の価値： 組織標本の作製およびイメージングプロトコルを標準化し、異なる実験回やモデルシステム間での再現性のあるベースライン測定を保証します。
- 拡張性： タイムラプス顕微鏡観察およびz-stack取得に対応しており、数時間にわたる免疫細胞ダイナミクスの経時的なモニタリングが可能です。
トランスレーショナルおよび前臨床研究
- 疾患への関連性：ヒトおよびマウスの膵臓組織から得られる基礎的な病理学的特性を維持しており、疾患に関連したシステムで1型および2型糖尿病のメカニズムを研究することが可能です。
- トランスレーショナルな連続性：免疫介在性の膵島機能不全に不可欠な細胞間相互作用を維持することで、初期の発見段階での知見を前臨床検証へと結びつけます。
- リスク調整済み進展：CD8とインスリンテトラマーの共染色により、エフェクターT細胞とインスリン抗原との相互作用の可視化を可能にし、メカニズムに基づいたgo/no-go判断を支援します。
パイプラインおよびワークフローの統合
生膵臓組織切片法は、ターゲットバリデーションから前臨床研究に至る創薬の連続的なプロセスに適合しており、組織の生存能および微小環境を維持することで、膵島と免疫系の相互作用に関するメカニズム研究のための疾患関連システムを提供します。
- 探索生物学：免疫細胞が膵島生理に与える影響をリアルタイムで観察することを可能にし、糖尿病の発症に関与する経路を明らかにすることで、仮説検証を支援します。
- スクリーニング：グルコース刺激によるカルシウムフラックスおよびインスリン四量体結合からの定量的出力を備えた、アッセイ可能な組織切片を提供し、信頼性の高い化合物評価を促進します。
- 分析：XYZTタイムラプスデータおよびZスタック光学切片を生成し、細胞応答および免疫細胞の局在を経時的に定量化することを可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患に関連する病理および天然の微小環境を維持し、探索段階から免疫調節メカニズムの前臨床検証までの連続性を支援します。
- エンタープライズ再利用：複数の疾患モデルおよび治療モダリティにわたって膵島機能を研究するための再利用可能なプラットフォームを構築し、冗長なモデル開発を削減します。
運用および企業への影響
- 科学的価値： 無傷の組織において膵島と免疫細胞の相互作用を直接可視化することで、メカニズムの曖昧さを排除し、ターゲットバリデーションにおける予測信頼性を高めます。
- 運用上の価値： スライス片の生存能と機能を維持する、制御された切片作成、インキュベーション、およびイメージングプロトコルにより、標準化と再現性を確保します。
- 戦略的価値： 免疫細胞の活性と膵島の機能低下を関連付けることで、go/no-go判断を改善し、糖尿病治療薬開発における後期段階の生物学的リスクを低減します。
- ポートフォリオへの影響： 疾患に関連したシステムにおいて免疫介在性の膵島機能不全を軽減する能力に基づき、免疫調節候補物質のリスク調整後の優先順位付けを可能にします。
実施上の検討事項
- 免疫細胞のダイナミクスのライブイメージングには、組織の取り扱い、ビブラトームによる切片作成、および共焦点顕微鏡に関する専門知識が必要です。
- ビブラトーム、レーザー検出器（405nm、488nm、638nm）を備えた共焦点顕微鏡、および環境制御用のステージトップインキュベーターなどの装置に依存します。
- 再現性を確保するため、切片の調製、バッファー組成（D-glucoseおよびトリプシンインヒビターを含むKrebs-Ringer重炭酸緩衝液）、およびインキュベーション条件について、チーム間での標準化が必要です。
- 組織の生存能と病理学的妥当性を維持するため、異なるモデルシステム（ヒト対マウス）や疾患状態（T1D対T2D）に本手法を適用する際は、適応上の検討が必要です。
- 切片の完全性を保持するためのプロテアーゼインヒビターの必要性や、長期タイムラプスイメージング中の光学的な透明性を維持するという技術的課題などの実用上の制限が含まれます。
