Name: 小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-02-12T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: 学ぶC2C12筋芽細胞におけるshRNAを用いた細胞外マトリックスタンパク質遺伝子の安定ノックダウン法。筋管形成における遺伝子機能を長期的に解析可能にする実験プロトコルです。

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D.H.は国立衛生研究所(国立関節炎・筋骨格・皮膚疾患研究所、NIAMS、助成金番号AR070748)と、レニ&ピーター・W・メイ整形外科、アイカーン医学部からの種子資金によって支援されています。シナイ山。

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<li>Yi, C. E., Bekker, J. M., Miller, G., Hill, K. L., Crosbie, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+and+potent+RNA+interference+in+terminally+differentiated+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Specific and potent RNA interference in terminally differentiated myotubes.</a> Journal of Biological Chemistry. 278 (2), 934-939 (2003).</li>
<li>Antolik, C., De Deyne, P. G., Bloch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+cultured+myotubes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%27s+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of cultured myotubes.</a> Science's STKE. 2003 (192), 11(2003).</li>
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著者たちは開示するものは何もない。

ここでは、C2C12筋芽細胞におけるECMタンパク質の安定ノックダウンと、筋管へのC2C12筋芽細胞の分化の表現的分析のためのプロトコルを説明する。いくつかの要因が実験の結果を決定し、慎重に検討する必要があります。増殖期のC2C12細胞を維持することは、C2C12細胞をミオブラスト前駆体状態に保つための重要なステップである。一貫して筋管に分化するC2C12細胞の能力を保持することは、i)細胞の通過数、ii)ルーチンメンテナンス中の培養細胞の密度、およびiii)栄養能、細胞培養培地11、12、13の頻繁かつ定期的な補充を必要とする。いくつかの未知のメカニズムのために、より高い通過数C2C12細胞はまた、さらなる筋芽細胞融合11の可能性を失う。C2C12細胞の提供者からの指示は、これらの細胞を通路番号15まで維持することを示唆している。その後、分化電位が低下し、そのような細胞を用いた実験は、より一貫した筋管形...

細胞外マトリックス(ECM)タンパク質は、すべての組織に構造的なサポートを提供し、細胞と細胞間の通信を媒介し、細胞の運命を決定します。ECMの形成と動的なリモデリングは、組織および器官の恒常性を維持するために重要である1,2.ECMタンパク質をコードするいくつかの遺伝子における病理学的変異体は、筋ジストロフィーから擬似運動体のビルド3、4に至るまでの形型を有する筋骨格系障害を生じさせる。例えば、ADAMTSL2の病原体変異体は、極めて稀な筋骨格系障害のゲレオフィス性異形成を引き起こし、これは偽筋造り、すなわち骨格筋質量5の明らかな増加を呈する。マウスおよびヒトにおける遺伝子発現データと共に、骨格筋の発達または恒常性6,7におけるADAMTSL2の役割を示唆している。
ここで説明するプロトコルは、ADAMTSL2が細胞培養環境における骨格筋の発達および/または恒常性を調節するメカニズムを研究するために開発された。我々は、マウスC2C12筋芽細胞株においてADAMTSL2を安定的にノックダウンした。C2C12筋芽細胞および筋管への分化は、骨格筋分化および骨格筋生体工学のためのよく記述され、広く使用されている細胞培養モデル8、9である。C2C12細胞は、血清離脱後に明確な分化ステップを経て、培養中3〜10日後に多核化筋管の形成をもたらす。これらの分化工程は、MyoD、ミオゲニン、ミオシン重鎖(MyHC)などの異なるマーカー遺伝子のmRNAレベルを測定することによって確実に監視することができます。C2C12細胞で安定した遺伝子ノックダウンを発生させる利点の1つは、C2C12分化の後期段階で発現する遺伝子を、トランスフェクション後5〜7日間続く小干渉(si)RNAによって達成される一過性ノックダウンと比較して、より効率的に標的にできることであり、トランスフェクション効率の影響を受ける。ここで説明するプロトコルの第2の利点は、プルマイシン選択を用いたC2C12ノックダウン細胞のバッチの比較的高速な生成である。CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトや、ヒトまたは標的遺伝子欠損マウスからの一次骨格筋細胞前駆体の単離などの代替案は、技術的にはより困難であるか、患者の筋肉生検または標的遺伝子欠損マウスの入手可能性をそれぞれ必要とする。しかしながら、他の細胞培養ベースのアプローチと同様に、C2C12細胞の使用には、細胞培養のセットアップの2次元(2D)性質や未分化骨格筋前駆細胞10を維持するために重要な生体内微小環境の欠如などの骨格筋細胞分化モデルとしての使用には限界がある。

<table><tbody><tr><td>アセトン</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>191784</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1423</td><td></td></tr>アン<tr><td>ピシリン</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1760-5</td><td></td></tr>自動<tr><td>セルカウンターカウントII</td><td>Invitrogen</td><td>A27977</td><td></td></tr>ブラ<tr><td>ッドフォード試薬</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>P4205987</td><td></td></tr><tr><td>C2C12細胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>チャンバースライド</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>クロロホルム</td><td>フィッシャー ケミカル</td><td>183172</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (増幅グレード)</td><td>Invitrogen</td><td>18068015</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB374</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>VWR Life Sciences</td><td>19C2656013</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体 (IRDYE 800CW)</td><td>Li-Cor</td><td>C90130-02</td><td></td></tr><tr><td>ヤギ抗マウス二次抗体 (Rhodamine-red)</td><td>Jackson Immune Research</td><td>133389</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター(シェーカー)</td><td>Denville Scientific Corporation</td><td>1704N205BC105</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptoethanol</td><td>Amresco, VWR Life Sciences</td><td>2707C122</td><td></td></tr><tr><td>Midiprep プラスミド抽出キット</td><td>Qiagen</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>ミオシン4(ミオシン重鎖)</td><td>Invitrogen</td><td>14-6503-82</td><td></td></tr><tr><td>封入剤</td><td>2086310</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>241</td><td></td></tr><tr><td>非イオン性界面活性剤/洗剤</td><td>VWR ライフサイエンス</td><td>18D1856500</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>MP</td><td>199983</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>フィッシャー バイオ試薬</td><td>BP399-4</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン 抗生物質</td><td>GIBCO</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>ペトリディッシュ</td><td>コーニング</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>ポリプロピレンチューブ</td><td>フィッシャーブランド</td><td>149569C</td><td></td></tr><tr><td>プロテアーゼ阻害剤カクテル錠</td><td>ロシュ</td><td>33576300</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2956100</td><td></td></tr><tr><td>PCR (リアルタイム)</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359284</td><td></td></tr><tr><td>Reactionチューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>逆転写マスターミックス</td><td>Applied Biosystems</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>RIPAバッファー</td><td>Thermo Scientific</td><td>TK274910</td><td></td></tr><tr><td>sh制御プラスミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>07201820MN</td><td></td></tr><tr><td>sh 3086 プラスミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092578</td><td></td></tr><tr><td>sh 972プラスミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>TRCN0000092579</tr><tr><td>sh 1977 プラスミド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRCN0000092582</td><td></td></tr><tr><td>分光光度計 (Nanodrop)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NanoDrop One C</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green Reagent Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>743566</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Acros Organics</td><td>30145369</td><td></td></tr><tr><td>Trizol reagent</td><td>Ambion</td><td></td><td></td>254707</tr><tr><td>トリパンブルー</td><td>GIBCO</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td>フィ<td>ッシャーバイオ試薬</td><td>BP1421</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン EDTA 0.25%</td> <td>ギブコライフテクノロジーコーポレーション</td><td>2085459</td><td></td></tr><tr><td>水 (DEPC 処理およびヌクレアーゼフリー)</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>186163</td><td></td></tr><tr><td>ウェスタンブロッティング装置</td><td>バイオラッド</td><td>ミニプロティアンテトラセル</td><td></td></tr><tr><td>酵母エキス</td><td>フィッシャーバイオ試薬</td><td>BP1422</td><td></td></tr></tbody></table>

小ヘアピン(sh)rnaを用いたc2c12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

Stable Knockdown of Genes Encoding Extracellular Matrix Proteins in the C2C12 Myoblast Cell Line Using Small-Hairpin (sh)RNA

細胞外マトリックス (ECM) タンパク質は骨格筋の発達と恒常性に不可欠です。C2C12筋芽細胞のECMタンパク質をコードする遺伝子の安定したノックダウンは、骨格筋発達におけるこれらのタンパク質の役割を研究するために適用することができる。ここで、ECMタンパク質ADAMTSL2を一例として枯渇させるプロトコルについて、C2C12細胞における小さなヘアピン(sh)RNAを用いた。shRNAプラスミドのトランスフェクションに続いて、安定した細胞をピューロマイシンを用いてバッチ選択した。さらに、これらの細胞株の維持およびmRNA発現、タンパク質発現、およびC2C12分化による表現型分析について説明する。この方法の利点は、比較的速いC2C12ノックダウン細胞の生成と、細胞培養培地中の血清の枯渇時にC2C12細胞を多核化筋管に確実に分化することである。C2C12細胞の分化は、明視野顕微鏡法およびMyoD、ミオゲニン、またはミオシン重鎖(MyHC)などの正規マーカー遺伝子の発現レベルを測定することによってモニタリングされ、ミオチューブへのC2C12ミオブラスト分化の進行を示す。小干渉(si)RNAを有する遺伝子の一過性ノックダウンとは対照的に、C2C12の分化中または筋管成熟中に後に発現する遺伝子は、shRNAを安定して発現するC2C12細胞を生成することによってより効率的に標的化することができる。この方法の限界は、CRISPR/Cas9に基づく遺伝子ノックアウト戦略を用いて克服できる特定のshRNA、ならびに考慮すべきshRNAの潜在的なオフターゲット効果に応じて、ノックダウン効率の変動である。

ピューロマイシン耐性C2C12の選択は、非耐性、すなわちトランスフェクションされていない細胞の効率的な排除によるトランスフェクション後10-14日で達成することができる(図1B)。典型的には、細胞の80%以上が細胞培養皿から切り離され、これらの細胞は定期的な細胞維持の間に除去される。コントロールを発現するプロマイシン耐性C2C12細胞(スクランブル)shRNAはスピンドル形状を保持し、低い細胞密度で細長い細胞形態と筋管に分化する能力を有する。血清離脱時のC2C12分化は、明視野顕微鏡法および筋管マーカーミオシン重鎖(MyHC)の免疫染色によってモニターすることができる(図2)。MyHC陽性のミオチューブは、分化開始後3〜5日の間に観察される。Myotube は、MyHC 陽性細胞境界内に複数の DAPI 陽性核が存在する場合に示すように多核化されます。図3Aは、完全なDMEMで培養された安定し...

小さなヘアピン(sh)RNAを用いてC2C12筋芽細胞(ECM)タンパク質をコードする遺伝子を安定的にノックダウンするプロトコルを提供します。ADAMTSL2を例に、ミオチューブ分化に対するC2C12筋芽細胞間におけるmRNA、タンパク質、および細胞レベルのノックダウン効率の検証方法について説明します。

小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

Extracellular matrix (ECM) proteins are crucial for skeletal muscle development and homeostasis. The stable knockdown of genes coding for ECM proteins in ...

このプロトコルは、myotube の形成または成熟の後期段階でアップレギュレートされる細胞外マトリックスタンパク質などのタンパク質の機能を研究できるため、重要です。この方法は、特定のshRNAと、それぞれの分析ツールを使用して、C2C12細胞の関心のある遺伝子をノックダウンするために使用することができます。この方法の主な利点は、成熟したミオチューブでも、目的の遺伝子を継続的に抑制できるC2C12細胞を生成していることです。この手順の最も重要な局面は、C2C12細胞を未分化状態に維持することであり、これは、日常的な細胞培養中の低細胞密度を意味する。トランスフェクションの前日、6ウェルプレートの完全DMEM当たり2ミリリットル当たり1ミリリットル当たり50〜4個のC2C12細胞に種を6ウェルプレートで播種し、摂氏37度および5%CO2で一晩インキュベーションした後に40〜50%の合流を達成する。翌朝、25ミリモル塩化ナトリウム100マイクロリットルを1つの1.5ミリリットル反応チューブに1つの培養チューブに組み合わせ、未分化C2C12細胞培養液のPEIストック溶液を37°Cで5分間培養します。次に、プラスミドDNAの3マイクログラムと15ミリモル塩化ナトリウム100マイクロリットルを組み合わせて、摂氏37度で5分間のインキュベーションを行います。インキュベーションの最後に、希釈した各PEI試薬の全容を各希釈プラスミド溶液と合わせて、摂氏37度で25分間のインキュベーションを行います。インキュベーション中に、C2C12細胞培養物の上清を抗生物質や血清を使わずにDMEMに交換してください。インキュベーションの終わりに、各トランスフェクションミックスの全容を液滴の各ウェルに加え、細胞培養皿を連続的に移動させる。培養インキュベーターで6時間後、各ウェルの培地を完全なDMEMに交換する。トランスフェクションの24時間後、各ウェルの完全なDMEMを、1ミリリットル当たり5マイクログラムのピューロマイシンを補充した選択培地に置き換え、細胞培養インキュベーターに10〜14日間、または安定したC2C12細胞が観察されるまで戻す。次に、ピューロマイシンの1ミリリットル当たり5マイクログラムの存在下で、低細胞密度培養中のピューロマイシン耐性C2C12細胞を拡大し、将来の使用のために細胞の6〜10バイアルを凍結保存する。分化のためにC2C12細胞を調製するために、種子1.5倍10〜5番目の安定したピューロマイシン耐性C2C12細胞を12ウェルプレートで1ミリリットルの選択培地で12ウェルプレートで、培養物が95%コンフルエントになるまで摂氏37度と炭酸ガス5%でインキュベートする。分化を誘導するには、カメラを搭載した反転した明視野顕微鏡で、ミオチューブ形成後2日ごとに無血清DMEMに各ウェルの培地を交換します。分化した細胞のミオシン重鎖免疫染色の場合、500マイクロリットルの完全なDMEMを8ウェルチャンバースライド上に500マイクロリットルの第4のピューロマイシン耐性C2C12細胞に5回10回播種し、細胞を細胞培養インキュベーターに戻す。細胞が95%の合流度に達したら、各ウェルの選択培地を500マイクロリットルの無血清DMEMに交換してください。適切な実験時点で、各ウェルの分化細胞を1回5ミリリットルのPBSで3回リンスし、細胞をPBSあたりPBSで200マイクロリットルの4%パラホルムアルデヒドで固定する。15分後、PBSあたり5分間、200マイクロリットルの5モルグリシンをインキュベートした後、1回の洗浄ごとに新鮮なPBSで細胞を3回洗浄します。インキュベーションの終了時に、細胞を1%の非イオン界面活性剤の200マイクロリットルで10分間透過させる前に、細胞を3回洗浄します。次に、PBSで5%のウシ血清アルブミンの200マイクロリットルを持つ非特異的抗体結合部位を1時間ブロックし、続いてPBSで3回のスッシュを行う。最後の洗浄後、細胞に200マイクロリットルのミオシン重鎖抗体を室温で2時間ラベル付けします。3回のPBSを洗い流した後、適切な二次抗体を用いて細胞を室温で2時間インキュベートし、光から保護する。3回の最終の打ち上げの後、PBSを吸引し、DAPIとカバースリップを添加した取り付け媒体の1滴で細胞を取り付ける。次に、適切なフィルターセットを使用して、蛍光顕微鏡で各チャンバを観察します。ウェスタンブロッティングによる細胞培養におけるノックダウン効率を評価するために、第1シードは、6ウェルプレートで完全DMEM当たり2ミリリットルの第5のピューロマイシン耐性C2C12細胞に10回10回を科した。24時間後、PBSで培養液をリンスし、2ミリリットルの無血清DMEMで細胞の分化を開始した。適切な実験時点で分泌されたタンパク質を解析するために、各ウェルから1ミリリットルの無血清条件培地を個々の1.5ミリリットル反応チューブに集めて遠心分離を行います。遠心分離後、調整された培地上清の1ミリリットルを新しい1.5ミリリットル反応チューブに移し、チューブあたり非イオン性界面活性剤中のトリクロロ酢酸391マイクロリットルでタンパク質を沈殿させる。30秒間の渦の後、氷上で10分間培養します。インキュベーションの終わりに、遠心分離によって沈殿したタンパク質をペレットにし、新鮮な氷冷アセトンと1回の洗浄でタンパク質ペレットを3回洗浄する。最後の洗浄後、ペレットを室温で3~4分間空気乾燥してから、チューブ当たり50マイクロリットルのSDS-PAGEサンプルバッファーに再懸濁します。その後、標準的なプロトコルに従ってウェスタンブロット分析の前に摂氏95度で5分間サンプルを沸騰させます。細胞内および膜結合タンパク質分析のために、各ウェルの細胞層を1井戸あたり2ミリリットルのPBSでリンスし、細胞スクレーパーを使用してPBSの1ミリリットルの体積で細胞を慎重に取り除きます。遠心分離のために個々の1.5ミリリットルのチューブに細胞を移し、続いて遠心分離を介して1回の洗浄につき1回のPBS 1ミリリットルで3回の洗浄を行う。最後の洗浄後、EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル試薬を添加した200マイクロリットルのリシスバッファーで細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間インキュベーションします。インキュベーションの終わりに、23キロヘルツの動作周波数で10の出力設定で氷上で15秒間サンプルを超音波処理し、遠心分離によって細胞の破片を除去する。上清を新しい1.5ミリリットル反応チューブに移し、標準的なプロトコルに従ってタンパク質濃度を決定します。100マイクログラムのタンパク質と5X SDS-PAGEサンプルバッファーを1サンプル当たり60マイクロリットルの合計容量で組み合わせ、サンプルを摂氏95度で5分間沸騰させます。次に、目的の標的タンパク質の存在についてウェスタンブロッティングによりサンプルを分析します。プロマイシン耐性C2C12細胞の選択は、非耐性細胞の効率的な排除のためにトランスフェクションの10〜14日以内に達成することができる。典型的には、C2C12細胞の80%以上がこの期間中に細胞培養皿から剥離し、定期的な細胞維持の間に除去される。コントロールまたはADAMTSL2 shRNAを発現するプロロマイシン耐性C2C12細胞は、低細胞密度でスピンドル状の細長い細胞形態を保持し、またミオチューブに分化する能力を保持します。血清離脱時のC2C12分化は、ミオチューブマーカーミオシン重鎖に対する明視野顕微鏡および免疫染色によって監視することができる。ミオシン重鎖陽性筋管は分化開始後3~5日の間に観察され、多核化され、細胞境界内に複数のDAPI陽性核が存在することによって観察される。増殖条件下での遺伝子発現データが示すように、トランスフェクションのノックダウン効率は40〜60%ウェスタンブロット分析を行い、得られた細胞ライセートにおけるノックダウンの成功を確認することができ、例えばC2C12細胞からは、制御shRNA発現細胞と比較してADAMTSL2を標的とするshRNAを安定的に発現する。選択プロセス中に、非トランスフェクトC2C12細胞のすべてを排除するのに十分な高さの間にピューロマイシン濃度を維持するようにしてください。このアッセイにより、C2C12分化の5~10日後に誘発された場合でも、筋肉の発達の後で発現する細胞外マトリックスタンパク質の機能を決定することができます。RNA抽出試薬とβ-メルカプトエタノールは、フームフードで処理し、適切な安全プロトコルに従ってトリクロロ酢酸を処理する必要があることを覚えておいてください。見てくれてありがとう、そしてあなたの実験で幸運。

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Research

JoVE Journal

Genetics

遺伝学

E4orf4誘導細胞死へのACFのクロマチンリモデリング因子の寄与を測定した。プロトコルはドキシサイクリン治療がACFユニットAcf1とSNF2hの条件付きノックダウンを誘導し、誘導細胞株でE4orf4誘導される細胞死を測定するためのDAPIアッセイを使用した細胞クローンの選択が含まれています。...

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このビデオでは、shRNAレンチウイルスベクターの形質導入を行い、不死化造血幹細胞および前駆細胞(iHSPC)で安定したノックダウン細胞株を得る方法を示します。...

Short Hairpin RNA-Mediated Gene Knockdown in iHSPCs In Vitro:特定の遺伝子発現のノックダウンのためのレンチウイルスベースのshRNA発現システムのiHSPCへのデリバリー

誘導性と目的の遺伝子のcDNAを過剰発現可逆またはshRNA媒介ノックダウンしたヒト細胞株を生成するために迅速かつ簡単な方法です。この方法は、確実に研究を可能にし、高度な再現性一過性トランスフェクションの方法または従来のノックダウン/ノックアウト戦略によって変更することは困難である細胞株を操作します。...

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のサイレンシング<em&gt; BRCA2</em&gt;ヒト培養細胞における新規BRCA2-調節される生物学的機能を同定するために、

このプロトコルでは、我々は、最適化されたC2C12細胞の維持、遺伝子トランスフェクション/形質導入、および筋細胞分化を含む、筋緊張性ジストロフィー1筋芽細胞モデルを確立する手順を提示します。...

C2C12筋芽細胞における筋強直性ジストロフィー1のモデル化

このプロトコルは、単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の募集に腫瘍細胞由来タンパク質の役割を研究するため特に癌細胞とその後続の使用で機能するテトにシステムを設定するためのスキームとして機能します。...

単球/マクロファージにおける腫瘍微小環境の採用を検討する癌細胞株における遺伝子発現の条件付きのノックダウン

骨格筋のカルタトキシン媒介損傷と自己送出型siRNAの注射を組み合わせて、衛星細胞における特定の遺伝子の機能的損失を調べるためのインビボ法について述べた。...

カーディオトキシン損傷による骨格筋再生中の衛星細胞機能の解析と生体内での自己送出型siRNAの注射

本研究では、特定のshRNAを使用して、PERK経路の2つの下流シグナル伝達成分である細胞保護カルシニューリンとアポトーシス促進型CHOPの発現をノックダウンします。反対に、これらは小胞体ストレスの誘導後の神経突起萎縮に対する初代皮質ニューロンの感受性を調節する。...

小胞体ストレスニューロンにおけるレンチウイルス送達特異的shRNAによる分子調節

ここでは、shRNAのレンチウイルス伝達を用いて樹状細胞(DC)の開発に関与する潜在的な転写因子をスクリーニングするためのプロトコルを提供し、 インビトロ...

足骨造茎および前駆細胞株における短いヘアピンRNA媒介遺伝子ノックダウンによる樹状細胞の発達に関する研究

このプロトコルは、ガイドRNAの設計からノックアウトクローンの細胞クローニングおよび特性評価まで、CRISPR/Cas9を使用してノックアウト筋芽細胞を生成する方法を説明しています。...

レンチウイルス媒介CRISPR/Cas9遺伝子編集を用いたノックアウト筋細胞株の開発

ここでは、高い、長期にわたる、安定したオンターゲットサイレンシング効率と、低いゲノムワイドなオフターゲット活性を持つ、遺伝子操作された転写抑制因子(ETR)の in vitro...

イン・ビトロ 標的エピジェネティックサイレンシングのための遺伝子操作転写リプレッサーの選択

学ぶC2C12筋芽細胞におけるshRNAを用いた細胞外マトリックスタンパク質遺伝子の安定ノックダウン法。筋管形成における遺伝子機能を長期的に解析可能にする実験プロトコルです。

小ヘアピン(sh)RNAを用いたC2C12筋芽細胞細胞株系の細胞外マトリックスタンパク質をコードする遺伝子の安定ノックダウン

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