Name: HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-11-09T15:15:00.000+00:00
Duration: 5 min 33 s
Description: 学ぶHiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解のハイスループット細胞プロファイリング手法。生細胞内で分解動態を定量的に検出し、治療薬探索における化合物スクリーニングを効率化します。

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K.M.R、S.D.M.、M.U.、D.L.Dはすべてプロメガコーポレーションの従業員です。

1. HiBiT CRISPR標的タンパク質を溶解フォーマットで行い、オプションで細胞生存率蛍光解析を行ったエンドポイント分解試験
<ol><li>哺乳類接着細胞株または懸濁細胞株の調製およびプレーティング<ol><li>継代および細胞増殖に使用される適切な細胞培地で希釈することにより、細胞密度を2.22 x 105/mLに調整します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低3ウェルのプレートに細胞を分注します。細胞懸濁液のウェルあたり90 μL(20,000細胞)を96ウェルの白いプレートに分注します。384ウェルフォーマットの場合、細胞懸濁液のウェルあたり36 μL(8,000細胞)を384ウェルのホワイトプレートに分注します。</li>
	</ol></li>
	<li>化合物の調製と添加<ol><li>100%DMSO中で最終濃度の1,000倍で段階希釈したPROTACまたはデグレーダーテストコンパウンドプレートを準備します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。等量のDMSOを培地に添加し、無化合物DMSOコントロールとして使用する。</li>
		<li>96ウェルフォーマットの場合、10 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を90 μLの細胞に加えます。384ウェルフォーマットの場合、36 μLの細胞に4 μLの10xコンパウンドおよびコントロール溶液を追加します。</li>
		<li>プレートを37°Cおよび5%CO2 のインキュベーター内で所望の時間またはそれらの成長に最適な条件でインキュベートする。 注:これはエンドポイントアッセイであるため、複数の時点のテストでは、上記のステップ1.1.2で説明したように、各時点ごとに個別の分解プレートを準備する必要があります。化合物媒介分解を検出するためのインキュベーション時間は非常に変動し、化合物濃度にも依存する可能性があります。推奨される初期時点は 6 時間と 24 時間です。</li>
		<li>オプションの細胞生存率測定なしでエンドポイント発光検出を測定する場合は、以下のステップ1.3に直接進んでください。細胞生存率測定でマルチプレックスを行う場合は、以下の次のセクション1.4に進んでください。</li>
	</ol></li>
	<li>細胞の溶解測定<ol><li>HiBiT溶解測定の直前に、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍の溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(すなわち、ウェル数+ 10%)を考慮した追加の容量を含む、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬を細胞に加える。96ウェルフォーマットの場合、100 μLの細胞を含む各ウェルに100 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに40 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350rpmで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96または384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>オプションの細胞生存率マルチプレックス 注:この手順は、市販のCell力価-蛍光(CTF)キットを使用して実行されます(材料の表を参照)。<ol><li>目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、10 μLの基質を2 mLのアッセイバッファーに加えることにより、6x細胞生存率検出試薬溶液を調製します。アッセイする各ウェルに十分な6倍の試薬を準備し、ピペッティングエラーのための余分な容量(すなわち、ウェル数+ 10%)を含めます。</li>
		<li>調製した試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに100 μLの容量を含む各ウェルに20 μLの6x試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、40 μLの細胞を含む各ウェルに8 μLの6x試薬を追加します。マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合した後、37°Cのインキュベーターでプレートを30分間インキュベートします。</li>
		<li>目的の測定エンドポイント(すなわち、処理後6時間または24時間、ステップ1.2.3)で、蛍光を読み取ることができる機器(380-400nmEx/505nmEm)で蛍光を96または384ウェルフォーマットで測定します。</li>
		<li>溶解バッファー1 mLあたり20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2x溶解検出試薬を調製します。ピペッティングエラー(ウェル数+10%など)を考慮して、アッセイするウェル数に対して十分な2倍の検出試薬を準備します。</li>
		<li>調製した溶解検出試薬をウェルに加える。96ウェルフォーマットの場合、すでに120 μLの容量を含む各ウェルに120 μLの2x溶解検出試薬を追加します。384ウェルフォーマットの場合、すでに48 μLの容量を含む各ウェルに48 μLの2x溶解検出試薬を追加します。プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで10〜20分間混合します。</li>
		<li>96ウェルまたは384ウェルプレートの発光を読み取ることができるルミネッセンスメーターでルミネセンスを測定します。</li>
	</ol></li>
	<li>分解と細胞生存率の定量化<ol><li>測定された時点でのDMSOコントロールからの相対光単位(RLU)を平均します。この値をターゲットのベースラインタンパク質レベルとして使用して、この同じ時点でテストされた他のすべての処理をこの値に正規化することにより、フラクショナル分解を計算します。たとえば、6時間でのDMSOコントロールウェルの平均RLUが10,000で、6時間での特定の化合物処理のRLUが5,000の場合、分別分解は5,000÷10,000 = 0.5と計算されます(式1)。 式1: <img alt="PROTACデータ分析のための分数RLU方程式。相対発光計算の図。" src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation "></li>
		<li>フラクショナルRLUからの劣化率を決定します。 式2: <img alt="生化学分析におけるフラクショナルRLUを用いた分解率計算式" src="/files/ftp_upload/61787/61787equ02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation "></li>
		<li>特定の時点でのフラクショナルRLUまたは%分解をプロットして、化合物の活性をランク付けします。</li>
		<li>オプションで、すべての処理の値をDMSOコントロールと比較することにより、細胞生存率アッセイ測定のための相対蛍光ユニット(RFU)データを分析します。DMSO対照と比較していずれかの処理でRFUの有意な低下が観察された場合、分解データを細胞生存率アッセイデータにさらに正規化して、細胞生存率の損失に対するタンパク質レベルの変化を決定することができます。</li>
	</ol></li>
</ol>2. HiBiT CRISPR標的タンパク質のリアルタイム速度論的分解とオプションの細胞生存率発光アッセイ
注:キネティックスクリーニングおよび分解を行う能力には、細胞内でのLgBiTタンパク質の共発現が必要であり、これは以前に説明されています18、19、63。これは、LgBiTベクターの一過性トランスフェクション、BacMam LgBiTの使用、またはLgBiT安定細胞株へのHiBiT CRISPR挿入を行うことによって達成できます。
<ol><li>接着細胞株のプレーティング。<ol><li>吸引によって細胞フラスコから培地を取り除き、DPBSで細胞を洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAで細胞を解離し、細胞をフラスコ底部から解離させます。浮遊細胞株については、セクション2.2に進んでください。</li>
		<li>血清含有細胞培養培地を使用してトリプシンを中和し、混合して細胞を回収して再懸濁し、細胞懸濁液を円錐管に移します。</li>
		<li>セルを125 x g で5分間スピンダウンします。細胞培養培地を廃棄し、等量の新鮮な細胞培養培地に再懸濁します。</li>
		<li>実験条件および対照条件ごとに最低限の三重ウェルでアッセイプレートに細胞をプレート化します。細胞密度を推定するための96ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地で密度を2 x 105 cells/mLに調整し、96ウェルプレートにウェルあたり100 μL(20,000細胞)を分注します。細胞密度を推定するための384ウェルフォーマットカウントでは、アッセイ培地中の密度を4.44 x 105 細胞/mLに調整し、ウェルあたり18 μL(8,000細胞)を分注します。</li>
		<li>プレートを37°C、5%CO2 で一晩、または成長に最適な条件でインキュベートします。</li>
	</ol></li>
	<li>浮遊セルのめっき<ol><li></li><li> </li></ol></li><li><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li><li></ol></li><li><ol><li> <img alt="PROTACデータ分析のための分数RLU方程式。相対発光計算の図。" src="/files/ftp_upload/61787/61787equ01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation "></li><li> <img alt="指数関数的減衰式、y =(y₀-Plateau)e^(-λt)+Plateau、数学的図。" src="/files/ftp_upload/61787/61787equ03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation "></li><li><li><li><li> </li></ol></li></ol>

プロメガコーポレーションは、HiBiTおよびNanoLucの技術とアプリケーションの特許を譲渡することにより、商業的所有者です。

ここでは、分解化合物活性をエンドポイント溶解フォーマットまたは生細胞動態モードのいずれかでスクリーニングする2つの方法を紹介します。これらのアプローチは、同じ発光測定原理に基づいていますが、異なるレベルの詳細と理解を提供します。どちらのアプローチを選択するかは、スクリーニングの目標と化合物ライブラリのサイズに依存する可能性があります。検出可能な分解を観察するための大規模な化合物スクリーニングデッキまたは一次スクリーニングの場合、エンドポイント溶解スクリーニングは、ウェスタンブロットや質量分析などの他のエンドポイントアプローチが実用的でないか、適応が難しい場合、高感度で効率的なハイスループット互換性を提供します14。これらのスクリーンの開始点は、限られた数の濃度とタイムポイントで実行できます。試験に推奨される初期濃度は100nM〜10μMの範囲であり、効力が低い、透過性が低い、または場合によっては非常に強力な化合物を含む初期分解剤にはフック効果があることを考慮してください。さらに、4〜6時間での早期発症劣化と18〜24時間での潜在的または持続的な劣化を確立するために、少なくとも2つの異なる時点をテストすることをお勧めします。.高い分解効力とオンターゲットメカニズムを示す化合物は、4〜6時間の時間枠内で容易に観察されますが、後の時点でのみ観察される分解または明らかなタンパク質損失は、さまざまなメカニズムが原因である可能性があります。タンパク質の損失と細胞死による損失を切り離すことができるように、早期および後期の両方の時点で細胞生存率をモニタリングすることを強くお勧めします。あらゆるタイプの発光アッセイまたは蛍光アッセイと同様に、ライブラリー内の化合物がシグナルを妨害または阻害する可能性があるため、無関係の融合またはタンパク質レベルをモニタリングするための代替アプローチを使用したリード化合物との直交フォローアップ実験は、これらのアッセイにおけるRLUの喪失が標的タンパク質分解に直接関連していることを評価するために重要です。
ライブセルキネティックフォーマットで長期間にわたってスクリーニングする能力は、アッセイシグナルからバックグラウンド(S:B)に大きく依存します。 S:Bに寄与する因子には、数桁に及ぶ可能性のある標的タンパク質自体の発現レベル、ペプチド挿入用に選択された細胞株におけるLgBiT発現の効率、 そして、その様々な天然複合体における補完のためのタグ付けされた標的の利用可能性。エンデュラジンまたはビバジンのいずれかを使用したキネティックモードでの分解を正常に測定するために、S:B15で構成される一般的なカットオフ要件を確立しました。S:Bは、エンデュラジンまたはビバジン生細胞基質のいずれかの存在下で、LgBiTのみを発現する未編集の親細胞に対して、LgBiTを共発現するHiBiT編集細胞のベースラインシグナルを測定することによって決定されます。ビバジンはより高い発光シグナルを生成しますが、エンデュラジンよりも速く崩壊し、シグナル取得を24時間以下に制限する可能性があります。さらに、S:Bは、CRISPRプールとクローンのどちらを使用するかに大きく依存することもあります。CRISPR/Cas9エンジニアリングにより適しており、効率が高い細胞株のターゲットの場合、編集された細胞の不均一なCRISPRプール集団は、速度論的分析に十分なS:Bを有する可能性があります。CRISPRを介したゲノム統合の効率が悪いとS:Bが低いプールになる、より困難な細胞株のターゲットの場合、編集された集団を濃縮し、速度論的分析のために十分に高いS:Bを達成するために、CRISPRクローンを単離する必要があるかもしれません。これらのシナリオのいずれかについて、S:Bがエンデュラジンまたはビバジン基質のいずれかで15未満の場合は、エンドポイント溶解スクリーニングが推奨されます。
定量的パラメータによる分解プロファイルの決定を含む化合物のより良い理解と特性評価のために、生細胞でのリアルタイム速度論的分析が推奨されるスクリーニングアプローチです14、18。上記のエンドポイント分析と同様に、初期速度論的スクリーニングは、ハイスループット方式で100nM〜10μMの範囲の限られた濃度数で行うことができます。384ウェルフォーマットでは、100を超える化合物を1つのプレート上で1つの濃度で3回に分けて容易にスクリーニングできます。結果として得られる分解プロファイルは、観察された分解の程度だけでなく、分解速度、分解期間、およびタンパク質の潜在的な回収率に関するガイダンスを提供します14,18(図2および図3)。劣化プロファイルの形状も貴重な情報をもたらします。特異的で強力な分解剤は、数時間で標的タンパク質がプラトーに急速に変化することがよくありますが18,53、転写フィードバックや化合物毒性などの他のメカニズムは、通常、時間の経過とともにタンパク質のより直線的な損失をもたらします。これらの詳細とニュアンスはエンドポイント溶解分析では見落とされており、24〜48時間にわたるリアルタイム分析では、新しい化合物または未知の化合物のセット内で真のDmaxをキャプチャする時間を予測する必要はありません。
リアルタイムキネティクスはまた、化合物の有効性、化合物濃度が初期分解率にどのように影響するかをよりよく理解するための効率的な用量反応スクリーニングを可能にし、複数のパラメータに基づいて化合物をランク付けする可能性を提供します。劣化効力の古典的な測定には、見かけの劣化最大値に基づく特定の時点でのDC50 計算が含まれます。対照的に、効力を評価するための私たちの速度論的アプローチは、それが時間18でいつ起こるかに関係なく、各濃度での真の分解最大値を組み込んでいます。これを速度論的分解能の測定をDmax5018と呼びます。この方法で分析すると、低濃度で分解を開始する可能性があるため、処理後Dmaxに達するまでに時間がかかる化合物が説明されます。分解率とDmaxの両方で化合物をランク付けすることは特に有益です。最も強力な劣化剤の場合、これは低速だが強力な劣化剤を高速で強力な分解剤とさらに区別します。HiBiT CRISPR細胞株を利用した溶解細胞スクリーニングと生細胞動態スクリーニングは、標的タンパク質分解、化合物機能のより包括的な全体像をもたらし、主要な分解パラメータの強化を通じて初期活性評価から下流の化学的最適化までのスクリーニングプロセスを可能にする強力なアプローチです。

標的タンパク質分解は、低分子創薬で最も急速に成長している分野の1つとして浮上しており、癌治療のための免疫調節分子グルー化合物(IMiDなど)の治療の成功、およびキメラ化合物を標的とするタンパク質分解の有望な早期臨床試験データによって大きく支えられています1,2,3,4,5,6,7,8、9,10,11,12。標的タンパク質分解化合物は、E3リガーゼ機械タンパク質1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12を有する標的タンパク質を近接させることによって機能する。.この化合物誘導性のE3リガーゼへの標的タンパク質の動員は、ユビキチンプロテアソーム経路(UPP)を介した標的タンパク質のユビキチン化と分解につながります1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 .歴史的に、低分子創薬スクリーニングプログラムは、活性を評価し、化合物をランク付けするために、初期の生化学的アッセイに依存してきました。しかし、これは、究極の活性であるプロテアソームを介した分解が細胞イベントのカスケードに依存する標的タンパク質分解者にとって重大な課題を提示しています1、2、4、5、6、11、12、13、14、15、16、17、18.ターゲット分解を成功させるために必要なタンパク質複合体の複数の経路と複雑さにより、初期化合物の早期スクリーニングとトリアージのための細胞アッセイアプローチが必要です。現在、細胞環境の状況でハイスループット方式で標的タンパク質の分解を監視する技術の利用可能性は著しく不足しています14。ここでは、分解剤化合物10,11,18,19で処理した後の発光測定を介して標的タンパク質の損失を監視するために、CRISPR/Cas9内因的にタグ付けされたHiBiT標的細胞株18,19,20を使用したリアルタイムの動的生細胞またはエンドポイント溶解分解活性評価のプロトコルを提示します。
治療標的の分解を成功させ、創薬可能なプロテオームを拡大するために、原形質膜、リソソーム、ミトコンドリア膜、細胞質、および核に局在するものを含む、広範囲のタンパク質を破壊対象とすることができる多数のアプローチおよびタイプの分解剤が登場している21–57。最も広く研究されている化合物の2つの主要なクラスは、分子接着剤とタンパク質を標的とするシメラ2、4、5、6、7、12、26です。分子接着剤は一価であるため、通常はサイズが小さく、E3リガーゼ成分2,12,26に結合すると、標的タンパク質との新規タンパク質:タンパク質相互作用界面を促進します。それらは、最も一般的にはセレブロン(CRBN)E3リガーゼ成分2,12,26,55,56,57に結合する分解剤である。最近、DCAF15 58,59,60やDDB145へのCDK/Cyclinリクルートメントなどの他のE3リガーゼ機構を利用したエキサイティングな新しい例は、このクラスの化合物の拡大の可能性を示しています。対照的に、PROTACはより大きく、二価分子であり、標的結合リガンド(ほとんどの場合阻害剤)で構成され、化学リンカーを介してE3リガーゼハンドル1,3,4,5,7,13に架橋されます。そのため、これらの化合物は、E3リガーゼと標的タンパク質1,3,4,5,7,13の両方に直接結合することができる。多数のタンパク質がこれらの二価分子を介して分解されることが示されており、最も使用されているE3リガーゼハンドルは、CRBNまたはフォンヒッペルリンダウ(VHL)のいずれかをリクルートします1,3,4,5,7,13。しかし、タンパク質分解設計を標的とするキメラにおけるE3リガーゼリガーゼリクルートメントに利用可能なハンドルの数は急速に増加しており、このクラスの化合物の能力を拡大し、多様な標的クラスを分解し、細胞または組織タイプの特異性を高める可能性があります24,48,61,62.標的タンパク質と結合するための最小限の要件と組み合わせることで、たとえわずかな親和性であっても、分解化合物は創薬可能なプロテオームの拡大に有望です。
タンパク質喪失の細胞動態、および治療後の潜在的なタンパク質回収を特徴付けることは、分解化合物の機能と有効性を理解するために重要です。ウェスタンブロット抗体アッセイまたは質量分析を使用して、関連する細胞系における内因性タンパク質レベルの変化を研究することは可能ですが、これらのアプローチは、ハイスループットスクリーニングフォーマットに適応することが困難であり、定量能力が限られているか、または多くの時点で速度論的変化を測定する能力があります14。これらの課題に対処するために、我々は、11アミノ酸タグHiBiTのCRISPR/Cas9を介したゲノム挿入を利用する、内因性タンパク質レベルの変化をモニタリングするためのプレートベースの細胞発光システムを開発しました18,19,20。このペプチドは、その結合パートナーであるLgBiTに高い親和性で相補し、その基質の存在下で明るい発光を生成し18,19,20,63、それによってこれらのタグ付き内因性タンパク質を細胞またはライセートで発光させる18,19,20,63.ルミノメーター機器で測定された相対光単位(RRU)は、タグ付けされた標的タンパク質レベル18、19、20、63に正比例します。安定化ルシフェラーゼ基質の開発により、24〜48時間の時間枠にわたるリアルタイムの速度論的タンパク質レベル測定が可能になる18,53,64。これにより、初期分解速度、分解最大(Dmax)、および化合物処理後の回収率の定量分析を含む、任意の所与の化合物濃度における任意の所与の標的に対する完全な分解プロファイルの決定が可能になる18,53。ただし、分解化合物の大規模なライブラリをスクリーニングする場合は、エンドポイント分析をさまざまな薬物濃度と指定された時間で384ウェル形式で簡単に実行することもできます。
この原稿で提示されたプロトコルは、すべてのタイプの分解物に適用可能な、標的タンパク質分解化合物の細胞スクリーニング戦略を表しています。しかしながら、これらのプロトコルと共にHiBiT CRISPR細胞株を使用することは、タンパク質分解に限定されず、化合物の影響または耐性メカニズムを研究するために治療後に調節され得る内因性標的タンパク質レベルをモニタリングするための一般的なツールである20、65、66。これらの発光ベースの検出方法の前提条件は、内因性にタグ付けされたHiBiT標的細胞株であるCRISPRであり、内因性の標的発現とネイティブプロモーター制御を維持しながら、高感度の発光検出を可能にするため重要です18,19,20。ゲノムタグの挿入にCRISRP/Cas9を利用することにおいて、特にスケーラビリティ20および高感度の検出において、CRISPRプールまたはヘテロ接合性またはホモ接合性の対立遺伝子挿入を有するクローンを含む様々なフォーマットで、重要な進歩が見られた18,19,20。内因性タグ付けの代わりに細胞内でHiBiTまたは他のレポーター融合の外因性発現を使用することは可能ですが、タンパク質過剰発現を有する系を用いるには細心の注意を払う必要があります14,18。これらは、標的分解後に活性化される潜在的な転写フィードバックループを含む、真の化合物効力およびタンパク質回収ダイナミクス14,18を理解する上でのアーティファクトにつながる可能性があります。さらに、効力の低い初期段階の化合物は見逃され、スクリーニングで偽陰性として現れる可能性があります。タンパク質の損失は化合物誘発性の毒性および細胞死に起因する可能性があるため、ここに記載されているプロトコルには、強く推奨されていますが、分解プロトコルと組み合わせたオプションの細胞生存率発光または蛍光アッセイが含まれています。プロトコルには、溶解エンドポイントと生細胞動態スクリーニングの2つの主要なセクションがあります。これらの各セクションには、エンドポイントまたはキネティック形式でのマルチプレックス細胞生存率測定のオプションが含まれています。タグ付けされた内因性タンパク質の変化をモニタリングするには、細胞内のLgBiTによる補完が必要です。したがって、キネティックスクリーニングセクションは、一過性または安定な発現を介して達成することができ、生細胞発光測定を実行するために不可欠な、これを導入するための重要なプロトコルを参照します。ここで紹介するすべてのアプローチにより、化合物の迅速なランク順序付けと活性評価が可能になり、初期段階の化合物スクリーニング作業と鉛分解体のより迅速な同定が可能になります。
このプロトコルは、HiBiT CRISPR細胞株と組み合わせた分解化合物の研究用に設計されています。多数の標的に対するHiBiT CRISPR挿入の生成のためのプロトコルは、いくつかの最近の刊行物18、19、20に概説されている。

<table><tbody><tr><td>CellTiter-Glo 2.0 試薬</td><td>Promega</td><td>G9241</td><td>細胞生存率 発光アッセイ</td></tr><tr><td>CellTiter-Fluor 細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G6080</td><td>細胞生存率 蛍光アッセイ</td></tr><tr><td>CO2-independent medium</td><td>ThermoFisher</td><td>18045-088</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td>化合物の希釈および制御用</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Seradigm</td><td>89510-194</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>HEK293 LgBiT 安定細胞株</td><td>Promega</td><td>N2672</td><td>HiBiTとの相補により発光</td></tr>を生成する <tr><td>HiBiT CRISPR哺乳類細胞株</td><td>Promega</td><td></td><td>https://www.promega.com/crispr-tpd</td></tr><tr><td>ハイグロマイシンB溶液</td><td>Gibco</td><td>10-687-010</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>LgBiT BacMam</td><td>Promega</td><td>CS1956C01</td><td>HiBiTとの相補による発光の生成</td></tr><tr><td>LgBiT発現ベクター</td><td>Promega</td><td>N2681</td><td>HiBiTとの相補による発光の生成</td></tr><tr><td>Luminometer Plate Reader</td><td></td><td></td><td>発光と蛍光を測定できるルミノメーター(例:GloMax Discover System、Promega GM3000)</td></tr><tr><td>NanoGlo Endurazine生細胞基質</td><td>Promega</td><td>N2570</td><td>Kinetic HiBiT試薬</td></tr><tr><td>NanoGlo Vivazine生細胞基質</td><td>Promega</td><td>N2580</td><td>Kinetic HiBiT試薬</td></tr><tr><td>NanoGlo HiBiT溶解検出システム</td><td>Promega</td><td>N3030</td><td>Enpoint Lytic HiBiT試薬</td></tr><tr><td>Opti-MEM Reduced Serum Medium, no phenol red (ThermoFisher)</td><td>ThermoFisher</td><td>11058-021</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>組織培養プレート、白、96 ウェルプレート</td><td>Costar</td><td>3917</td><td>細胞</td></tr><tr><td>培養 組織培養プレート、白、384 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3570</td><td>細胞培養</td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300</td><td>細胞培養</td></tr></tbody></table>

hibit crispr細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

High-Throughput Cellular Profiling of Targeted Protein Degradation Compounds Using HiBiT CRISPR Cell Lines

分子接着剤やタンパク質分解を標的とするキメラを含む標的タンパク質分解化合物は、低分子創薬におけるエキサイティングな新しい治療法です。このクラスの化合物は、ユビキチン-プロテアソーム経路(UPP)を介して標的タンパク質をユビキチン化し、最終的に分解するために必要な標的タンパク質とE3リガーゼ機構タンパク質を近接させることにより、タンパク質分解を誘導します。しかし、ハイスループット方式での標的タンパク質分解のプロファイリングは、分解を達成するために必要な細胞経路の複雑さを考えると、依然として非常に困難です。ここでは、LgBiTタンパク質に高い親和性で補完する11アミノ酸HiBiTタグを持つ標的タンパク質のCRISPR/Cas9内在性タグ付けを使用して発光タンパク質を製造するプロトコルとスクリーニング戦略を提示します。内因性タグを有するこれらのCRISPR標的細胞株は、発光プレートベースのリーダーを使用して発光シグナルをモニタリングすることにより、リアルタイムのキネティックライブセルモードまたはエンドポイント溶解モードのいずれかで化合物誘発分解を測定するために使用できます。ここでは、さまざまなフォーマットで推奨されるスクリーニングプロトコルの概要を説明し、レート、Dmax、DC50、Dmax50の主要な分解パラメータの計算、および細胞生存率アッセイによるマルチプレックスについても説明します。これらのアプローチは、関連する細胞バックグラウンドにおける標的タンパク質の内因性発現と調節を維持しながら、初期段階の化合物の迅速な発見とトリアージを可能にし、リード治療化合物の効率的な最適化を可能にします。

単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質;CDK2、CDK4、CDK7、およびCDK10は、HEK293細胞のC末端にHiBiTで内因的にタグ付けされ、1μM濃度のパンキナーゼセレブロンベースのPROTACTL12-186で処理されました54 (図1A)。CDKタンパク質のレベルを異なる時点で測定し、DMSO対照に対するフラクショナルRLUを決定しました(図1A)。各CDKタンパク質は、化合物処理および様々な時点に応答して異なる程度の分解を示した(図1A)。CDKタンパク質がタンパク質損失に関して互いに直接どのように比較されるかを理解するために、図 1A の分別RLUを総分解%として計算し、 図1Bの各時点についてプロットしました。これは、2時間または4時間の早い時点でさえ、CDKファミリーのメンバーの一部が高レベルの分解を示し、時間の経過とともに上昇傾向にあることを示しています(図1B)。
速度論的分解分析を実証するために、BETファミリーメンバータンパク質のそれぞれ;BRD2、BRD3、およびBRD4は、LgBiTタンパク質18を安定に発現するHEK293細胞のN末端にHiBiTで内在的にタグ付けされました。次に、これらを3つの異なる濃度の汎BETプロタックで処理しました。セレブロンベースのdBET650(図2A)およびVHLベースのARV-77141(図2B)。速度論的測定値は24時間にわたって収集され、各濃度でのプロファイルから、BETファミリーメンバーの応答の違いは容易に明らかです。分解後化合物処理(図2A、B)により迅速な回復応答を開始するBRD2の能力は、他の汎BET PROTACで以前に観察されており、分解プロセスと競合する転写フィードバック応答に起因する可能性が高い18。
エンドポイント分析と速度論的分析の両方は、完全な複合用量反応治療で行うことができます。図3に示されているのは、4つの異なる分子接着剤化合物でLgBiTタンパク質を安定発現するIkaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の治療の速度論的用量反応分解プロファイルです2,26,55,57;レナリドマイド(図3A)、イベルドマイド(CC-220)(図3B)、サリドマイド(図3C)、およびポマリドマイド(図3D)。これらの分解剤は、化合物間および濃度系列全体で分解応答に大きな違いを示します(図3)。
図3の化合物の分解とランク順序を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率(図4A)、Dmax(図4B)、およびDmax50値(図4B)を含む主要な分解パラメータを計算しました。これらの分析は、イベルドマイド(CC-220)とポマリドマイドが非常に類似した急速な初期分解速度を有することを示していますが(図4A)、イベルドマイド(CC-220)は、直交研究で以前に見られたように最高の効力を持っています55,57(図4B)。イベルドマイドはそのような高い効力を示し、テストされたすべての濃度は50%を超える分解を示すため、イベルドマイドについて得られたDmax50値は、データを正確に適合させる際の制限に基づく推定値を表します。図3C、Dおよび図4Bのグラフから、レナリドマイドもサリドマイドも、試験した最高濃度でIkaros/IKZF1ターゲットを分解しません。サリドマイドで観察された分解がほとんどないため、分解痕跡を指数関数的減衰モデルに正確に適合させることができなかったため、この処理では分解速度を定量化できませんでした。最も強力な分解剤であるイベルドマイド(CC-220)55,57(図4B)。細胞生存率マルチプレックスアッセイは、試験した濃度について細胞生存率の損失を示さなかった(図4C)。
<img alt="CDK分解速度論,RLU対時間のフラクショナルグラフと分解率の棒グラフ,HiBiTアッセイ" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> 図1:パンキナーゼPROTACによるCDKエンドポイントの分解と毒性、TL12-18654。(A)CRISPR/Cas9を介してC末端のHiBiTと融合し、1 μM TL12-186 PROTAC 54で2時間、4時間、8時間、および24 時間処理で分解を評価した内因性CDK標的タンパク質のパネルを選択します。値は、各時点で測定されたDMSOコントロールに対するフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。(B)(A)から算出されたCDK標的タンパク質のパネルの分解率、2、4、8、および24時間の時点で観察された各ファミリーメンバーの分解量を表す。エラーバーは、3つのテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="BETファミリーの劣化プロファイル。用量反応グラフ;HiBiT-BRD2 / BRD3 / BRD4;複合比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 図2:BETデグレーダーdBET650 およびARV-77141を用いたBETファミリーメンバーの速度論的分解選択性のプロファイリング。内因性BETファミリーメンバーであるBRD2、BRD3、およびBRD4の速度論的分解プロファイルで、CRISPR/Cas9を介してN末端にHiBiTでタグ付けされ、1 nM(左)、10 nM(中央)、または100 nM(右)dBET650 (A)またはARV-77141 (B)プロタックの単一濃度で処理します。値は、各運動時点でDMSOコントロールから計算されたフラクショナルRLUとして表されます。エラーバーは、4回のテクニカル反復の平均のSDを表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Ikaros IKZF1-HiBiT 用量反応チャート。レナリドマイド、イベルドマイド、サリドマイド、ポマリドマイド。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 図3:分子接着剤パネルを用いたIkaros/IKZF1-HiBiTの生細胞動態分解線量反応プロファイル2,26,55,57。LgBiTタンパク質を安定に発現するJurkat細胞をCRISPR/Cas9を用いて操作し、Ikaros/IKZF1のC末端にHiBiTペプチドをタグ付けした。細胞を、4つの異なる分子グルー化合物2、26、55、57のDMSOを含む8点用量反応濃度系列で処理した:(A)レナリドマイド、(B)イベルドマイド(CC−220)、(C)サリドマイド、または(D)ポマリドマイド。発光は5分ごとに合計19.5時間測定されました。(A〜D)からの相対光単位(RLU)データは、ステップ2.4.1で説明したようにフラクショナルRLUに変換され、時間の関数としてグラフ化されました。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="イカロスの分解速度と細胞生存率の研究:濃度応答グラフ、薬効の比較。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61787/61787fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 図4:Ikaros/IKZF1-HiBiTの分解率とDmax50の計算、およびマルチプレックス細胞健康アッセイ。 図3の速度論的分解データを使用して、定量的劣化パラメータを計算しました。(A)分解率および(B)分解最大値(Dmax)は、示された分子糊化合物2、26、55、57について各薬物濃度でグラフ化される。(B)各化合物のDmax50値は、ヒルスロープを1に拘束した用量反応モデルを使用して計算され、ターゲットの分解化合物の順序をランク付けするために使用できます。(C)図3Bからのイベルドマイド(CC-220)55,57分解用量応答を用いた細胞生存率アッセイを、速度論的分解測定の完了時にエンドポイント測定として実施した。エラーバーは、3つのテクニカル反復のSDを表します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61787/61787fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、標的タンパク質に融合した抗体フリーの内因性タンパク質検出タグを発現させるためにCRISPR/Cas9を使用して操作された生細胞におけるタンパク質分解動態の定量的発光検出について説明しています。定量的劣化パラメータ、レート、Dmax、DC 50、およびDmax50を計算および取得するための詳細な手順が含まれています。

HiBiT CRISPR細胞株を用いた標的タンパク質分解化合物のハイスループット細胞プロファイリング(英語)

Targeted protein degradation compounds, including molecular glues or proteolysis targeting chimeras, are an exciting new therapeutic modality in small ...

このアプローチにより、タンパク質分解の細胞モニタリングと分解性化合物の迅速なスクリーニングが可能になります。分解のダイナミクスは、細胞内で高感度かつ定量的に監視できるため、主要な分解パラメータを正確に決定できます。これらの方法により、分解剤化合物の活性のHTSプロファイリングが可能になり、治療薬の早期発見段階でのトリアージが可能になります。また、内因性標的レベルの調節を研究したい人には、増加しているか減少しているかにかかわらず、洞察を提供します。この手順を実演するのは、私の研究室の研究者であるCelia Bisbachです。まず、哺乳類の接着細胞または懸濁細胞を調製し、プレーティングします。細胞密度を1ミリリットルあたり5番目の細胞の10倍の2.22倍に調整し、実験および制御条件ごとに最低3ウェルのプレートに分注します。100%DMSO中に1000倍の濃度で、段階希釈したPROTACまたは分解剤テストコンパウンドプレートを調製します。次に、細胞培養培地で最終濃度の10倍に希釈します。同量の DMSO を培地に添加して、化合物を含まない DMSO コントロールを作成します。プレート内の細胞に適切な量の10倍化合物またはコントロール溶液を加え、プレートを5%二酸化炭素中で摂氏37度でインキュベートします。エンドポイントの発光シグナルを測定するには、溶解バッファー1 mLごとに20 μLの溶解基質と10 μLのLgBiTタンパク質を添加して、2倍溶解検出試薬を調製します。すべてのウェルをアッセイするのに十分な試薬を準備します(ピペッティングエラーを考慮した追加の容量を含め)。調製した溶解性検出試薬を細胞に加え、プレートをマイクロプレートボルテックスミキサーで350 RPMで10〜20分間混合します。96ウェルプレートまたは384ウェルプレートを読み取ることができるルミノメーターでルミネセンスを測定します。細胞生存率マルチプレックスを使用する場合は、溶解試薬を添加する前に行ってください。目的のエンドポイント測定の30〜40分前に、アッセイバッファーの2ミリリットルに10マイクロリットルの基質を添加して、6倍細胞生存率検出試薬溶液を調製します。調製した試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーで短時間混合します。次に、プレートを摂氏37度のインキュベーターで30分間インキュベートします。目的のエンドポイントで、96または384ウェルフォーマットの蛍光を読み取ることができる装置で蛍光を測定します。前述のように2倍溶解試薬を調製します。次に、試薬をウェルに加え、マイクロプレートボルテックスミキサーでプレートを10〜20分間混合します。混合後、ルミノメーターを使用して発光を測定します。単一濃度エンドポイント溶解分解分析を実証するために、いくつかのCDK標的タンパク質をHiBiTで内因的にタグ付けし、パンキナーゼセレブロンベースのPROTAC TL12-186で処理しました。CDKタンパク質レベルは異なる時点で測定され、フラクショナルRLUが決定されました。CDKタンパク質がタンパク質損失の点でどのように直接比較されるかを理解するために、フラクショナルRLUを総分解率として計算しました。BETファミリーメンバータンパク質に、LgBiTタンパク質を安定して発現するHiBiT細胞およびHEK293細胞に内因的にタグを付けることにより、速度論的分解解析を行いました。次に、細胞を3つの異なる濃度のpan-BET PROTACで処理しました。セレブロンベースの dBET6 と VHL ベースの ARV-771 です。ここでは、4つの異なる分子接着剤化合物で処理したLgBiTタンパク質を安定して発現するIkaros IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat細胞の運動学的用量応答分解プロファイルを示します。化合物間および濃度シリーズ全体での分解応答に大きな違いが観察されます。化合物の分解と順位を定量的に評価するために、用量反応プロファイルを使用して、分解率、分解最大、Dmax50値などの主要な分解パラメータを計算しました。細胞生存率マルチプレックスアッセイでは、試験した濃度で細胞生存率の低下は示されませんでした。このプロトコルで最も重要なステップは、DMSO制御への正規化によるフラクショナルRLUまたはパーセント劣化を決定することです。このプロトコルに従って、表現型アッセイを実施して、特定のタンパク質の損失が細胞の健康または機能にどのように影響するかを理解することができます。さらに、これらのHiBiT細胞株は、NanoBRET技術を用いたタンパク質相互作用や低分子結合の研究にも使用できます。

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