Name: 呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: 学ぶRSVヌクレオカプシドのin vitro組み立て法。リン酸タンパク質PをシャペロンとしてRNA非依存的Nタンパク質を共発現し、電子顕微鏡で構造を確認します。非分節型負鎖RNAウイルス研究に応用可能です。

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エモリーの梁研究室の研究プログラムは、米国国立一般医学研究所(NIGMS)、国立衛生研究所(NIH)の賞番号R01GM130950、エモリー大学医学部の研究スタートアップ基金によって支援されています。著者は、梁研究室のメンバーが有益なサポートと批判的な議論を行っていることを認めています。

1. 分子クローニング
注:リガーゼ独立クローニング(LIC)は、RSVビシストロニック共発現コンストラクトプラスミドを作るために使用されました。LICは、1990年代初頭に開発された方法であり、T4 DNAポリメラーゼの3'-5'Exo活性を使用して、ベクターとDNAインサート21,22との相補性を持つオーバーハングを作成する。構築物は、オープンリーディングフレーム(ORF)のN末端で10x Hisタグで構成される2BT-10ベクターDNAを使用して作られました(図1)。
<ol><li>SSPI消化を用いてLICベクターの線形化を行う。<ol>
<li>SSPI 10Xバッファーの10 μL、5 U/μLの濃度で4μLのSSPI酵素、5μgのベクターミニプレップDNAの等価容量、滅菌ddH2O~100 μLを組み合わせます。</li>
		<li>37°Cで3時間消化をインキュベートする。</li>
		<li>ベクターDNAの抽出のために1.0%アガロースゲルでダイジェストを実行します。</li>
		<li>ゲル抽出キットを使用して、抽出と精製を行います。ベクターDNAの最終容積をddH2Oの30μLで中断し、-20°Cで保存します。</li>
	</ol></li>
	<li>N1-391フォワードプライマー、N1-391リバースプライマー、P 1-126フォワードプライマー、およびP1-126リバースプライマーを使用して、N 1-391およびP1-1-126用のDNAインサーを準備する(表1)。 注:55°Cと60°Cの間の融解温度を確保するために線形化されたベクトルと十分な重複があります。 逆プライマーについては、同じ理由で線形化ベクトルの逆相補鎖と十分な重複がある。<ol>
<li>表2および表3の条件を用いてDNAインサートのPCR増幅を行う。</li>
		<li>増幅したDNAインサートを抽出します。前のステップのPCR産物を1.0%アガロースゲルで実行し、ゲル抽出によってバンドを抽出して精製します。抽出したDNAの最終容積を15μLのddH2Oで中断する。</li>
	</ol></li>
	<li>T4 DNAポリメラーゼ処理のベクターおよび挿入DNA(表4) 注:ベクターDNAと挿入DNAに対して、治療を個別に行う必要があります。<ol>
<li>混合物を室温で40分間インキュベートする。その後、75°Cでポリメラーゼを20分間加熱不活性化する。反応混合物を-20°Cに保存する。</li>
	</ol></li>
	<li>LICベクトルと挿入ベクトルをアニールします。<ol>
<li>2 μLのLICベクターDNAと2 μLの無菌ddH 2 Oでネガティブコントロールを設定します。</li>
		<li>0.2 mLチューブに、以前のT4 DNAポリメラーゼ反応からの2μLのDNA挿入DNAと2μLのLICベクターDNAを組み合わせます。</li>
		<li>室温で10分間焼鈍反応を行います。</li>
		<li>25 mMの濃度で1.3 μLのEDTAで反応を焼き付けます。</li>
		<li>反応を100μLの大腸菌Top10の有能な細胞に変換し、アンピシリン選択プレート23、24にプレートします。</li>
	</ol></li>
	<li>正の構造を特定します。<ol>
<li>プラスミドミニプレップ溶液を準備します。これは、LB培地でコロニーピッキングと接種を介して行うことができます。通常、3コロニーで十分である。</li>
		<li>混合物を一晩37°Cでインキュベートする。</li>
		<li>4,560 x gで10分間遠心分離し、上清を捨てます。</li>
		<li>P1バッファーの250 μLでペレットを再懸濁し、スピンミニプレップキットを使用してプラスミドミニプレップを準備します。</li>
		<li>AseIまたは他の制限酵素を用いて、ミニプレップ製品の消化分析を行います。</li>
		<li>0.8%アガロースゲルにサンプルをロードし、消化されたプラスミドを実行します。UVランプの下でゲルを分析します。</li>
		<li>正の製品の順序を検証するには、シーケンス サービスを使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>共発現DNA挿入物を取得する。<ol>
<li>PCRを行い、以前に構築した2BT-10 N1-391 および2BT-10 P 1-126をテンプレートとして使用して、N1-391 およびP1-126 を得る。</li>
		<li>表 2 および表 3 の PCR 条件を使用して、表2および表 3の PCR 条件を使用して、1 番目の PCR を N1-391 から N 1-391を取得する 1番目の PCR を実行し、N1-391フォワード プライマーおよびリバース プライマー 5'-GTGAAGATCCGGCTGATGCAATGCGGGGGGCG CGCCGCGATCGCGGATCC-3'.</li>
		<li>フォワードプライマーを使用して2BT-10 P1-126コンストラクトからP1-126を得るために2番目のPCRを実行する:5'-CCGCCGCATTGCATCAGCAGGATCTCACTGC AGGACTCGAGTCTAGA-3'とP1-126 リバースプライマー( 表2 および 表3のPCR条件を使用)</li>
		<li>最後に、前の2つのPCR反応の混合産物に対してオーバーラップPCRを行い、N1-391 とP1-126をマージする。N1-391 フォワードプライマーとP1-126 リバースプライマーを使用します。表 5 および 表 6の PCR 条件を使用します。</li>
	</ol></li>
	<li>ベクターとDNAインサートに結合します。<ol>
<li>ステップ1.3のプロトコルに従ってT4 DNAポリメラーゼとの重複PCR産物を処理する。</li>
		<li>ステップ1.4のプロトコルに従ってLICベクターおよびPCR産物をアニールする。</li>
		<li>ステップ 1.5 のプロトコルに続く正の構造を特定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. タンパク質の発現と精製
注:37°Cでの培養細胞のNとPの両方の共発現の二カストロニック構築には大腸菌を使用するが、一晩で還元温度(16°C)で発現を行う。コバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーの組み合わせを介してタンパク質複合体を精製する(図2)。
<ol><li>タンパク質の生産には 大腸菌 BL21(DE3)株を使用してください。OD600が0.6 に達するまでLB(ルリアブロス)培地で37°Cで4 L細胞培養を成長させます。</li>
	<li>温度を16°Cに下げます。 1時間後、0.5 mMイソプロピル1-チオ-Dガラクトピラノシド(IPTG)を一晩で発現誘導する。</li>
	<li>4,104 x gで細胞を25分間遠心し、上清を捨てます。</li>
	<li>細胞ペレットを200 mLのリシスバッファーA(50mMリン酸ナトリウム、pH 7.4、500 mM NaCl、5 mMイミダゾール、10%グリセロール、および0.2%NP40)で再懸濁する。50 mLのリシスバッファーを使用して、1 Lの細胞培養から細胞ペレットを再懸濁した。</li>
	<li>15分間、3秒間、3秒間超音波処理して細胞をライセします。その後、遠心分離細胞を37,888 x gで40分間用いた。 注:プロトコルは、-80°C冷凍庫で超音波処理する前に細胞を凍結することによって一時停止することができます。</li>
	<li>上清をコバルト重力カラム(直径xの長さ:2.5cm x 10 cm)に積み込み、5~10カラム体積(CV)のリシスバッファーで事前平衡化されたビーズの約10mLを使用します。</li>
	<li>5 CVのバッファーB(50 mM Tris-HCl pH 7.4、1 M NaCl、10%グリセロール、および5 mMイミダゾール)と5 CVのバッファーC(50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、10%グリセロール、および5 mMイミダゾール)でカラムを洗浄します。</li>
	<li>2 CVのバッファーD(50 mM Tris-HCl pH 7.4、500 mM NaCl、および250 mMイミダゾール)を使用してビーズからタンパク質を溶出します。</li>
	<li>Qカラムに対して溶出したタンパク質5xをQAバッファー(50 mM Tris-HCl pH 8.0、5%グリセロール)で希釈します。</li>
	<li>QAバッファーでQカラムの5mLを洗浄してカラムを平衡化し、その後、蠕動ポンプ(例えば、ウサギ)を使用して希釈したサンプルをQカラムにロードします。</li>
	<li>QAバッファーおよびQBバッファ(50 mMトリスHCl pH7.4、1.5 M NaCl、5%グリセロール)とともに、QカラムをHPLCマシンにロードします。流量を1 mL/minとして設定します。</li>
	<li>「ポンプ洗浄」プログラムを実行して、QBバッファで機械を洗浄し、QAバッファ(1~2 CV/各)を続けます。システムフローを3 mL/minに設定します。</li>
	<li>UV1 を 280 nm に、UV2 を 260 nm に設定します。分数を収集するために96深い井戸プレートを使用してください。</li>
	<li>溶出剤(QBバッファ)の段階的な勾配を用いた溶出タンパク質は、各濃度の3〜4CVを適用し、0%QBから始まる度に5%ずつ割合を増加させる。N0Pタンパク質複合体は15%QB緩衝液で出てこるだろう。</li>
	<li>すべてのタンパク質が溶出したら、100%QBバッファ(2 CV)でカラムを洗浄します。</li>
	<li>ゲル濾過Superdex 200増加10/300 GLカラム(直径x長さ:1.0 cm x 30 cm)でタンパク質を分離し、バッファーE(20 mM HEPES pH 7.4および200 mM NaCl)で平衡化します。</li>
	<li>SDS-PAGEでタンパク質含有分率を解析する。</li>
</ol>3. ウイルス特異的NCのインビトロアセンブリ
注:RSV特異的NC(N:RNA)のインビトロアセンブリを、調製したN0P複合体をRNAオリゴとインキュベートすることによって行った。次いで、SECクロマトグラフィーを用いて、N0Pと過剰RNAから組立体を分離した(図2)。
<ol><li>精製されたN0P複合体をRNAオリゴと共に1時間室温で1:1.5の分子比で混合してインキュベートし、通常1mg/mLの濃度でタンパク質N0Pの1mLは次のステップに十分である。同じ量のN0Pタンパク質のみを含む対照サンプルを設定します。</li>
	<li>ゲル濾過Superdex 200は、バッファE(20 mM HEPES、pH 7.4、200 mM NaCl)で10/300 GLカラムを増やす前平衡化します。</li>
	<li>サンプルを21,130 x g で15分間遠心し、降水量を取り除き、上清をSECカラムにロードします。</li>
	<li>N:RNAアセンブリサンプルとN0PコントロールサンプルのSECクロマトグラフィー画像を比較し、A260/A280比を組み合わせて、組み立てられたN-RNA、N-0 P、およびフリーRNAのピークを特定します。</li>
	<li>ピーク画分を収集するか、SDS-PAGEゲルを実行するか、グリッドを作成します。</li>
	<li>組立N-RNA複合体については、N-RNAピークの全ての分画を収集し、RNA抽出を行い、尿素PAGEゲルを実行して、最初のステップで混合およびインキュベートされたRNAと同じ特定のRNAの長さを再確認します。</li>
</ol>4. 負の染色グリッドを作る
注:負の染色電子顕微鏡(EM)は、分子を炭素膜に吸着し、重金属原子の層に埋め込む方法です。負の染色EMは高い画像コントラストを生み出し、粒子を見やすく計算的に整列させます。別の利点は、粒子を炭素膜に吸着させることが、通常、分子を誘導して、好ましい配向が少ないグリッドに付着させることである。分子が同じ向きにある場合、それらを構造的に異なるクラスに分離するのは簡単です。したがって、負の染色EMは、サンプル調製25、26を導く適切な技術である(図3)。
<ol><li>小さなガラスビーカーに5mLのddH2Oを電子レンジで加熱するか、沸騰するまでタングステンヒーターを使用する。</li>
	<li>ウラニルの37.5mgの量を量り、加熱されたddH2Oの5 mLに加えて0.75%ウラニルの形成染色溶液を作る。光から保護するために、アルミニウム箔で覆われたビーカーの下でかき混ぜます。</li>
	<li>染色液に4μLの10M NaOHを加え、光から保護された15分間撹拌を続けます。</li>
	<li>0.22 mm フィルターを使用して、テスト チューブにフィルターを適用します。</li>
	<li>グロー放電を使用して、連続カーボンコートEMグリッド親水性27を作ります。 メモ:グリッドは、電源に接続されたチャンバー内に配置されます。高電圧を印加すると、チャンバー内のガスがイオン化し、マイナスに帯電したイオンがカーボングリッドに付着して親水性になります。</li>
	<li>パラフィルムストリップをカットして折ります。パペット2滴のバッファーは、パラフィルムの片側のバッファの40μLを、もう一方の側に40μLの染色溶液の別の2滴をピレットします。</li>
	<li>EMカーボングリッドを作るためには、3 μLのタンパク質サンプルを1分間塗布します。</li>
	<li>ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロットします。 注:グリッドはバッファで2倍、1xは各ステップの後に0.75%ウラニルフォーマット染色溶液をブロットして洗浄されます。</li>
	<li>0.75%ウラニルフォーマット染色液の2番目のドロップで30秒間グリッドサーフェスを保持します。</li>
	<li>余分な汚れ溶液を除去し、グリッドを空気乾燥させるために、ブロッティング紙に対してグリッドをブロットします。</li>
	<li>イメージングの前にグリッドボックスにグリッドを保存します。</li>
</ol>

<ol><li>Whelan, S. P., Barr, J. N., Wertz, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+and+replication+of+nonsegmented+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription and replication of nonsegmented negative-strand RNA viruses.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 283, 61-119 (2004).</li>
<li>Lamb, R. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamb%2C+RA+%22Fields+virology%22">Fields virology</a>. Knipe, D. M., Howley, P. M. , Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins. (2013).</li>
<li>Collins, P. L., Fearns, R., Graham, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus%3A+virology%2C+reverse+genetics%2C+and+pathogenesis+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Microbiology+and+Immunology%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus: virology, reverse genetics, and pathogenesis of disease.</a> Current Topics in Microbiology and Immunology. 372, 3-38 (2013).</li>
<li>Fearns, R., Deval, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+antiviral+approaches+for+respiratory+syncytial+virus+and+other+mononegaviruses%3A+Inhibiting+the+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Antiviral+Research%22%5BJournal%5D)">New antiviral approaches for respiratory syncytial virus and other mononegaviruses: Inhibiting the RNA polymerase.</a> Antiviral Research. 134, 63-76 (2016).</li>
<li>Grosfeld, H., Hill, M. G., Collins, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+replication+by+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+is+directed+by+the+N%2C+P%2C+and+L+proteins%3B+transcription+also+occurs+under+these+conditions+but+requires+RSV+superinfection+for+efficient+synthesis+of+full-length+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">RNA replication by respiratory syncytial virus (RSV) is directed by the N, P, and L proteins; transcription also occurs under these conditions but requires RSV superinfection for efficient synthesis of full-length mRNA.</a> Journal of Virology. 69 (9), 5677-5686 (1995).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+metapneumovirus+polymerase+phosphoprotein+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the human metapneumovirus polymerase phosphoprotein complex.</a> Nature. 577 (7789), 275-279 (2020).</li>
<li>Horwitz, J. A., Jenni, S., Harrison, S. C., Whelan, S. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+rabies+virus+polymerase+complex+from+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure of a rabies virus polymerase complex from electron cryo-microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (4), 2099-2107 (2020).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+the+respiratory+syncytial+virus+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of the respiratory syncytial virus RNA polymerase.</a> Nature Communications. 11 (1), 368(2020).</li>
<li>Abdella, R., Aggarwal, M., Okura, T., Lamb, R. A., He, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+paramyxovirus+polymerase+complex+reveals+a+unique+methyltransferase-CTD+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Structure of a paramyxovirus polymerase complex reveals a unique methyltransferase-CTD conformation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (9), 4931-4941 (2020).</li>
<li>Gilman, M. S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Respiratory+Syncytial+Virus+Polymerase+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the Respiratory Syncytial Virus Polymerase Complex.</a> Cell. 179 (1), 193-204 (2019).</li>
<li>Liang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+L+Protein+of+Vesicular+Stomatitis+Virus+from+Electron+Cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structure of the L Protein of Vesicular Stomatitis Virus from Electron Cryomicroscopy.</a> Cell. 162 (2), 314-327 (2015).</li>
<li>Jenni, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+Vesicular+Stomatitis+Virus+L+Protein+in+Complex+with+Its+Phosphoprotein+Cofactor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Structure of the Vesicular Stomatitis Virus L Protein in Complex with Its Phosphoprotein Cofactor.</a> Cell Reports. 30 (1), 53-60 (2020).</li>
<li>Renner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleocapsid+assembly+in+pneumoviruses+is+regulated+by+conformational+switching+of+the+N+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Nucleocapsid assembly in pneumoviruses is regulated by conformational switching of the N protein.</a> Elife. 5, 12627(2016).</li>
<li>Cox, R. M., Plemper, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+organization+of+paramyxovirus+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Virology%22%5BJournal%5D)">Structure and organization of paramyxovirus particles.</a> Current Opinion in Virology. 24, 105-114 (2017).</li>
<li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleocapsid+into+a+bullet+shape%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Self-organization of the vesicular stomatitis virus nucleocapsid into a bullet shape.</a> Nature Communications. 4, 1429(2013).</li>
<li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+mechanism+for+RNA+encapsidation+by+negative-strand+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Common mechanism for RNA encapsidation by negative-strand RNA viruses.</a> Journal of Virology. 88 (7), 3766-3775 (2014).</li>
<li>Jamin, M., Yabukarski, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsegmented+Negative-Sense+RNA+Viruses-Structural+Data+Bring+New+Insights+Into+Nucleocapsid+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Virus+Research%22%5BJournal%5D)">Nonsegmented Negative-Sense RNA Viruses-Structural Data Bring New Insights Into Nucleocapsid Assembly.</a> Advances in Virus Research. 97, 143-185 (2017).</li>
<li>Wan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+assembly+of+the+Ebola+virus+nucleocapsid%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure and assembly of the Ebola virus nucleocapsid.</a> Nature. 551 (7680), 394-397 (2017).</li>
<li>Mendes, A., Kuhn, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+Nucleocapsid+Packaging+and+Assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Alphavirus Nucleocapsid Packaging and Assembly.</a> Viruses. 10 (3), (2018).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+trackable+assembly+of+RNA-specific+nucleocapsids+of+the+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">In vitro trackable assembly of RNA-specific nucleocapsids of the respiratory syncytial virus.</a> Journal of Biological Chemistry. 295 (3), 883-895 (2020).</li>
<li>Aslanidis, C., de Jong, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation-independent+cloning+of+PCR+products+%28LIC-PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR).</a> Nucleic Acids Research. 18 (20), 6069-6074 (1990).</li>
<li>Li, C., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+independent+cloning+irrespective+of+restriction+site+compatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Ligation independent cloning irrespective of restriction site compatibility.</a> Nucleic Acids Research. 25 (20), 4165-4166 (1997).</li>
<li>Hanahan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+transformation+of+Escherichia+coli+with+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Studies on transformation of Escherichia coli with plasmids.</a> Journal of Molecular Biology. 166 (4), 557-580 (1983).</li>
<li>Green, R., Rogers, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+chemically+competent+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Transformation of chemically competent E. coli.</a> Methods in Enzymology. 529, 329-336 (2013).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Ohi, M., Li, Y., Cheng, Y., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+Staining+and+Image+Classification+-+Powerful+Tools+in+Modern+Electron+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Procedures+Online%22%5BJournal%5D)">Negative Staining and Image Classification - Powerful Tools in Modern Electron Microscopy.</a> Biological Procedures Online. 6, 23-34 (2004).</li>
<li>Aebi, U., Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+glow+discharge+unit+to+render+electron+microscope+grids+and+other+surfaces+hydrophilic%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Electron+Microscopy+Technique%22%5BJournal%5D)">A glow discharge unit to render electron microscope grids and other surfaces hydrophilic.</a> Journal of Electron Microscopy Technique. 7 (1), 29-33 (1987).</li>
<li>Green, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Access+to+RNA+encapsidated+in+the+nucleocapsid+of+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Access to RNA encapsidated in the nucleocapsid of vesicular stomatitis virus.</a> Journal of Virology. 85 (6), 2714-2722 (2011).</li>
<li>Alvarez Paggi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conformational+switch+balances+viral+RNA+accessibility+and+protection+in+a+nucleocapsid+ring+model%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Biochemistry+and+Biophysics%22%5BJournal%5D)">A conformational switch balances viral RNA accessibility and protection in a nucleocapsid ring model.</a> Archives of Biochemistry and Biophysics. 671, 77-86 (2019).</li>
<li>Green, T. J., Zhang, X., Wertz, G. W., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+vesicular+stomatitis+virus+nucleoprotein-RNA+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the vesicular stomatitis virus nucleoprotein-RNA complex.</a> Science. 313 (5785), 357-360 (2006).</li>
<li>Tawar, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+nucleocapsid-like+nucleoprotein-RNA+complex+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a nucleocapsid-like nucleoprotein-RNA complex of respiratory syncytial virus.</a> Science. 326 (5957), 1279-1283 (2009).</li>
<li>Galloux, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+viral+phosphoprotein+binding+site+on+the+surface+of+the+respiratory+syncytial+nucleoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a viral phosphoprotein binding site on the surface of the respiratory syncytial nucleoprotein.</a> Journal of Virology. 86 (16), 8375-8387 (2012).</li>
<li>Milles, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-Assembly+of+Measles+Virus+Nucleocapsid-like+Particles%3A+Kinetics+and+RNA+Sequence+Dependence%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+Interntional+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Self-Assembly of Measles Virus Nucleocapsid-like Particles: Kinetics and RNA Sequence Dependence.</a> Angewandte Chemie Interntional Edition English. 55 (32), 9356-9360 (2016).</li>
<li>Desfosses, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+cryo-EM+structures+of+RNA-specific+measles+virus+nucleocapsids+provide+mechanistic+insight+into+paramyxoviral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Assembly and cryo-EM structures of RNA-specific measles virus nucleocapsids provide mechanistic insight into paramyxoviral replication.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (10), 4256-4264 (2019).</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスの既知のヌクレオカプシド様粒子(NCLP)構造は、細菌または真核生物発現系15、16、17、18、19において過剰発現した場合に、組み立てられたNCLPsが宿主細胞RNAを有する複合体Nであることを示す。これまでの研究では、RNase A消化、高塩洗浄、または異なるpHバッファを調整して非特異的細胞RNA28,29を除去するなど、さまざまな方法でRNAフリーNを得ようと試みてきた。ただし、上記の方法はいずれも、ウイルス固有の NC のアセンブリに対して正常に使用することはできません。RNAフリーRSV Nを得るために、RNase A消化、高塩(1.5M ...

非セグメント化負感覚(NNS)RNAウイルスは、狂犬病、エボラ出血熱、および呼吸器間質ウイルス(RSV)1、2のような多くの重要なヒト病原体を含む。RSVは、世界中の幼児および高齢者における気管支炎および肺炎などの呼吸器疾患の主な原因である。現在、RSV4を予防または治療するための有効なワクチンや抗ウイルス療法は利用できません。ライフサイクルの一環として、RSVゲノムは、RSV RNA依存性RNAポリメラーゼによる複製の鋳型として、抗ゲノムを産生し、その結果、子孫ゲノムを生成する鋳型として機能します。ゲノムおよび抗ゲノムRNAはいずれも、核タンパク質(N)によって完全に封入され、ヌクレオキャプシド(NC)3を形成する。NCはRSVポリメラーゼによる複製と転写の両方のテンプレートとして機能するため、ポリメラーゼがRNA合成用テンプレートにアクセスするには適切なNCアセンブリが不可欠です。興味深いことに、NNSウイルスポリメラーゼの構造解析に基づいて、いくつかのNタンパク質が一過性にNCから解離して、RNA合成後にRNAに対してポリメラーゼのアクセスを可能にし、RNAに再結合することを仮説する6、7、8、9、10、11、12。
現在、RSV RNA重合アッセイは、短裸RNAテンプレート13,14に精製されたRSVポリメラーゼを用いて確立されている。しかし、裸のRNAテンプレートを使用する場合、RSVポリメラーゼによって生成された非プロセスおよび中止産物に観察されるように、RSVポリメラーゼの活動は最適に達しない。ウイルス特異的なRNAを用いるNCの欠如は、RSV RNA合成のさらなる機械化的理解のための主要な障壁である。したがって、本物のRNAテンプレートを使用することは、RSV RNA合成の基礎知識を進めるために重要な必要性になります。RSVおよび他のNNS RNAウイルスからのヌクレオカプシド様粒子(NCLPs)の既知の構造は、NCLPs中のRNAがランダムな細胞RNAまたは平均ウイルスゲノムRNA15、16、17、18、19であることを明らかにする。一緒に、主なハードルは、Nが宿主細胞で過剰発現したときにNCLPsを形成するために非特異的に細胞RNAにNが結合することです。
このハードルを克服するために、まずRNAフリー(N0)を取得し、本物のウイルスゲノムRNAをNCLP20に組み立てるプロトコルを確立しました。このプロトコルの原理は、Nをシャペロンと共発現させることにより組換えRNAフリーN(N0)を大量に得る、RSVホスフォタンパク質のN末端ドメイン(PNTD)である。精製されたN0Pは、RSV特異的なRNAオリゴを添加することによってNCLPに刺激され、組み立てることができ、そして組立プロセス中に、シャペロンPNTDはRNAオリゴの添加時に変位する。
ここでは、RSV RNA特異的なNCの生成と組み立てのためのプロトコルについて詳しく説明します。本プロトコルでは、分子クローニング、タンパク質調製、 インビトロ アセンブリ、および複合アセンブリの検証について説明する。我々は、分子クローニングのためのタンパク質共発現のためのバイシストロニック構築物を生成するためのクローニング戦略を強調する。タンパク質調製については、細胞培養、タンパク質抽出、タンパク質複合体の精製の手順について説明します。次に、RSV RNA特異的NCの インビトロ アセンブリの方法について検討する。最後に、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)と負染色電子顕微鏡(EM)を使用して、組み立てられたNCLPを特徴付け、可視化します。

<table><tbody><tr><td>アガロース</td><td>SIgma</td><td>A9539-500G</td><td>は、LIC法を使用してコンストラクトを作成し</td></tr>、<tr><td>アミコンウルトラ-15遠心フィルターユニット</td><td>ミリポア</td><td>UFC901024</td><td>濃縮タンパク質サンプル</td></tr><tr><td>アンピシリンナトリウム</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>5118.111317A</td><td>細胞培養用抗生物質</td></tr><tr><td>AseI</td><td>NEB</td><td>R0526S</td><td>は、LIC法コバルトを使用してコンストラクトを作成します</td></tr><tr><td>(高密度)アガロースビーズ</td><td>ゴールド</td>バイオ <td>H-310-500</td><td>Hisタグタンパク質の精製用</td></tr><tr><td>Corning LSE デジタルドライバスヒーター</td><td>CORNING</td><td>6885-DB</td><td>サンプルを加熱</td></tr><tr><td>dCTP</td><td>Invitrogen</td><td>10217016</td> LIC<td>法によるコンストラクト</td></tr>作成 <tr><td>dGTP</td><td>Invitrogen</td><td>10218014</td><td>LIC法によるコンストラクト作成</td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G5516-4L</td><td>溶液を作る</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-100G</td><td>溶液を作る</td></tr><tr><td>HiTrap Q HP</td><td>Sigma</td><td>GE29-0513-25</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma</td><td>I5513-100G</td><td>溶液を作る</td></tr><tr><td>IPTG (イソプロピル-ベータ-D-チオガラクトピラノシド)</td><td>GOLD BIOTECHNOLOGY</td><td>1116.071717A</td><td>タンパク質の発現を誘導します</td></tr><tr><td>微量遠心分離機 チューブ</td><td>PCR Misonix</td>Sonicator XL2020用<td>VWR</td><td>47730-598</td></tr><tr><td>Ultrasonic Liquid Processor</td><td>SpectraLab</td><td>MSX-XL-2020</td><td>細胞溶解用超音波装置</td></tr><tr><td>ネガティブ染色グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>CF400-Cu-TH</td><td>ネガティブ染色グリッド作成用</td></tr><tr><td>ニューブランズウィック イノーバ 44/44R</td><td>エッペンドルフ</td><td>M1282-0000</td><td>細胞培養用シェーカー</td></tr><tr><td>Nonidet P 40代替</td><td>シグマ</td><td>74385-1L</td><td>作成ソリューション</td></tr><tr><td>OneTaq DNAポリメラーゼ</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>QIAquickゲル抽出キット</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td> 精製<td>DNA</td></tr><tr><td>SSPI-HF</td><td>NEB</td><td>R3132SLIC</td><td>法を使用してコンストラクトを作成</td></tr><tr><td>スーパー6増加10/300 GL</td><td>シグマ</td><td>GE29-0915-96</td><td>タンパク質精製</td></tr><tr><td>T4 DNAポリメラーゼ</td><td>Sigma</td><td>70099-3</td><td>LIC法によるコンストラクト作成</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Sorvall RC 6 Plus 遠心分離機</td><td>Fisher Scientific</td><td>36-101-0816</td><td>遠心分離機、最高速度 20,000 rpm</td></tr><tr><td>Trizma 塩酸塩</td><td>Sigma</td><td>T3253-250G</td><td>製造液</td></tr><tr><td>ギ酸ウラニル</td><td>電子顕微鏡 Sciences</td><td>22451</td><td>ネガティブ染色液</td></tr></tbody></table>

呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

Generation and Assembly of Virus-Specific Nucleocapsids of the Respiratory Syncytial Virus

本物のRNAテンプレートの使用は、ウイルス学における機械学的発見とアッセイの開発の両方を導くことができるウイルスRNA合成の基本的な知識を進めるために重要です。非セグメント化陰性感覚(NNS)RNAウイルスのRNAテンプレートは、呼吸間核ウイルス(RSV)のような、RNA分子のみではなく、むしろ核タンパク質(N)を封入したリボヌクレオタンパク質複合体である。本物のRNAテンプレートの重要性にもかかわらず、このようなリボヌクレオタンパク質複合体の生成および組立は洗練されたままであり、詳細な解明を必要とします。主な課題は、過剰発現したRSV Nが細胞RNAに非特異的に結合してランダムなヌクレオキャプシド様粒子(NCLPs)を形成することである。ここでは、まずNをシャペロンホスホ蛋白質(P)と共発現させ、次にRSV特異的RNA配列を用いてN0を組み立ててウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)を得ることでRNAフリーN(N0)を得るプロトコルを確立した。このプロトコルは、この伝統的に挑戦的なウイルスリボヌクレオタンパク質複合体の調製における困難を克服する方法を示しています。

RNAフリーN0Pタンパク質の精製 このプロトコルにより、大規模な可溶性ヘテロダイマーRSVN0P複合体が得られる。Pタンパク質のNおよびN末端部分の全長は、大腸菌のNタンパク質上の10X His-Tagと共に発現した。N0Pをコバルトカラム、イオン交換、およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製した。N0Pは全長NとN末端Pの両方を含むが、UV吸光度A260/A280比20に基づく細胞RNAは含まれなかった(図4)。
N-RNAの組立と陰性染色による検査 その後、精製されたN0Pを刺激し、特定のRNAオリゴでインキュベートすることによりヌセロプラスミド様粒子(NCLPs)に組み立てられることを実証しました。NCLPsを、室温で1:1.5の比でRNA...

呼吸合体ウイルス(RSV)RNA合成の詳細な機械分析のために、RNA非含核タンパク質(N0)をウイルス特異的ヌクレオキャプシド(NC)のその後のインビトロ集合体に対するRNAフリー核タンパク質(N0)の共発現にシャペロンホスホタンパク質(P)を利用するプロトコルを報告する。

The use of an authentic RNA template is critical to advance the fundamental knowledge of viral RNA synthesis that can guide both mechanistic discovery and ...

この方法は、RNAフリーNタンパク質を得るために、1つのウイルスタンパク質P'をシャペロンとして別のウイルスタンパク質を用いて組換えウイルスタンパク質発現課題に取り組む様々な方法を利用する。RNAフリーのRSV Nタンパク質は、ウイルス特異的なRNAをインビトロでヌクレオキャプシドに組み立てる前に得られる。この方法は、他の非セグメントネガティブセンスRNAウイルスでも使用できる。ライゲーション独立クローニング法は、共発現構築物を取得するための迅速な技術である。なぜまたは選択性は、電子顕微鏡を染色し、生細胞で大規模な組み立てをチェックするための迅速な方法です。私たちはあなたに2つのヒントを与えたいと思います。まず、次のステップに移動する前に、各ステップの高い収率と固体の結果を取得します。第二に、クロマトグラフィーのための適切なプログラムを設定し、鉗子でグリッドを拾う練習。NおよびP共発現のバイシストロニック構造の場合、摂氏37度でLB培地中の大腸菌BL21DE3株細胞の4つの1リットル培養を成長させる。600ナノメートルの光学濃度が0.6に達したら、温度を16°Cに下げます。1時間後、一晩0.5ミリモルIPTGで処理することによりタンパク質発現を誘導する。翌朝、遠心分離によって細胞を収集し、200ミリリットルのリシスバッファーでペレットを再懸濁する。3秒間、パルスから3秒オフで、15分間超音波処理によって細胞をlyseします。遠心分離によりライセートを回収する。上清を2.5 x 10センチメートルのコバルト重力柱に積み込み、約10ミリリットルのビーズを使用します。5~10カラムのリシスバッファーで事前平衡化。そして、バッファーBの5カラムボリュームと5つのバッファCのボリュームでカラムを洗います。そしてQAバッファーの5つの1ミリリットルの量とQカラムを平衡化する。蠕動ポンプを使用して、希釈したサンプルをカラムに積み込みます。ロードされた Q カラムを、新鮮な QA および QB バッファとともに HPLC マシンに溶かします。ポンプ洗浄を実行して、QBおよびQAバッファの1~2ボリュームで機械を洗浄します。最後の洗浄後、流量を1分あたり1ミリリットルに設定し、UV1を280ナノメートル、UV2を260ナノメートルに設定し、96の深いウェルプレートを使用して分数を収集します。次に、溶出剤の各濃度の3〜4体積の段階的な勾配適用を使用して、タンパク質を溶出し、0%QB濃度から始まり、その割合を毎回5%増加させる。N-0 Pタンパク質複合体は、15%QB緩衝液濃度で溶出する。ゲル濾過によりタンパク質を単離し、1×30センチメートルの小規模精製カラムで、バッファーE.SDSページで画分を含むタンパク質を分析する。ウイルス特異的ヌクレオキャプシドアセンブリの場合、精製されたN-0 P複合体をRNAオリゴと共に、室温で1:1.5分子比で1時間混合してインキュベートします。バッファーE.と小スケール精製ゲル濾過カラムを事前平衡化し、遠心分離により任意の沈殿物を除去する。上清を、サイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードする。そして、タンパク質のサイズ排除クロマトグラフィー画像をRNAアセンブリと比較し、タンパク質単独の対照サンプルを核酸純度比を組み合わせて、組み立てられたNRNA、N-0 Pおよび遊離RNAであるピークを同定する。N RNA複合体を組み立てるには、NRNAのピーク画分をすべて収集し、RNA抽出を行い、尿素ページゲルを実行して特定のRNAの長さを再確認します。負染色電子顕微鏡用の負染色グリッドを作成するには、ヒートプレートを使用して5mLの二重蒸留水を沸騰させ、37.5ミリグラムのウラニル定量を水に加えて0.75%ウラニル定染色溶液を得ます。溶液をアルミホイルで覆われたビーカーに移します。そして、10モル水酸化ナトリウムの4マイクロリットルを追加します。光から保護された15分間撹拌した後、0.22ミクロンのフィルターを通して溶液を試験管にフィルター処理します。連続カーボン被覆電子顕微鏡グリッドを親水性にするには、電源に接続されたチャンバーにグリッドを配置し、負に荷電したイオンをグリッドに適用します。2インチのパラフィルムストリップを2枚切って折ります。ストリップの一端に蒸留水を2滴加えます。そして、もう一方の端に0.75%ウラニルの形成染色液の2つの40マイクロリットル滴。各グリッドに3マイクロリットルのタンパク質サンプルを加えます。1分後、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロックし、蒸留水滴にグリッドを2回浸します。そして、最初の染色液滴に一度。次に、2番目の染色液の液滴にグリッドを30秒間浸し、ブロッティングペーパーに対してグリッドをブロッティングして余分な汚れ溶液を除去し、イメージング前にグリッドを空気乾燥させます。このプロトコルを用いて、大規模な可溶性二量体呼吸合体ウイルスN0P複合体が得られる。大腸菌では、Pタンパク質のN及びN末端部分の全長がNタンパク質上の10XHisタグと共発現される。UV吸光度核酸純度比に基づいて、N0Pは全長NとN末端Pの両方を含んでいたが、細胞RNAは含まれなかった。精製されたN0 Pは、その後、刺激され、実証された特定のRNAオリゴとのインキュベーションを介して電子顕微鏡グリッド上の粒子のような核組み立てに組み立てることができます。タンパク質を精製する場合は、カラム精製中に気泡を避け、QAバッファーでサンプルを希釈してpHと塩濃度を調整してから、サンプルをカラムにロードします。グリッドを汚染しないように、電子顕微鏡グリッドを外側の端に保持するように注意してください。これは、それが左利きまたは右利きのヘリカル構造であるかどうか、非陽性RSVゲノムパッキングの質問を決定するのに役立ちます。これらの手順に従い、RSVポリメラーゼ活性アッセイのためのRNAテンプレートを認証して行うことができる。そして、このRSVウイルス特異的ヌクレオキャプシドは、高解像度のクライオEM分析に使用することができる。

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呼吸器間性ウイルスのウイルス特異的ヌクレオカプシドの生成と組み立て

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