Name: バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: 学ぶバキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の大量生産法。SF9細胞を用いてミリグラム単位のタンパク質を効率的に調製し、生化学・構造生物学研究に応用する。

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著者らは、ダリア・バルシテ・ラブジョイが、バキュロウイルス発現ベクターシステムから発現したPRMTタンパク質ファミリーと協力したすべてのSGCの同僚と、原稿に関する貴重なフィードバックと批判的なコメントを提供してくれたことに感謝したいと考えている。
SGCは、AbbVieから資金を受け取る登録された慈善団体(番号1097737)です。 バイエルAG、ベーリンガー・インゲルハイム、ジェネンテック、オンタリオ・ゲノミクス研究所を通じたゲノム・カナダ[OGI-196]、革新的医薬品イニシアチブ2共同事業を通じたEUとEFPIA[EUbOPEN助成金875510]、ヤンセン、メルク・クガア(カナダと米国の別名EMD)、ファイザー、タケダ、ウェルカムトラスト 106169[Z14]/Zz1

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</ol>

著者らは利益相反を宣言しない。

昆虫細胞におけるBEVSの利点の1つは、翻訳後修飾機械の能力に焦点を当て、リン酸化、ミリストレーション、グリコシル化などのより複雑な改変を可能にします。哺乳動物タンパク質の非常に効率的な折りたたみと共に、これらの修飾は、生理学的に関連する下流実験16に適した大量の改変および折り畳まれたタンパク質を促進する。
ここでは、バキュロウイルス発現プラットフォームにおけるPRMTタンパク質の複数の構築物の発現スクリーニングと大規模なPRMTタンパク質産生の成功に不可欠な要素を強調するBEVSの詳細なプロトコルを説明しました:1)通常の、調整可能でプログラム可能なマルチチャネルピペットを使用して、24と96の間で生物学的材料を転送する細胞培養プレートとブロック組換えウイルスの集合体,組換えウイルスのウイルス量の増幅およびタンパク質発現スクリーニングブロックの調製。2) 組換えウイルスの生成のための高性能かつ費用対効果の高いトランスフェクション試薬。3) バキュロウイルスに感染した昆虫細胞(SCBIIC)の大規模タンパク質産生のための懸濁液培養4)大量の2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコを使用してSf9懸濁液培養液と2.5 Lタネアシェイクフラスコと5L試薬ボトルを大規模タンパク質製造に利用。
変換およびトランスフェクションのステップに関する特別な考慮事項と根拠。 商用プロトコルでは、1つの変換14に対して100μLのコンピテントセルを使用することを推奨していますが、市販のDH10Bac E.のコンピテントセルの変換効率は1 x 108 cfu/ μg DNAと同じくらい高いので、4μLしか使用しなくなっています。これは、各変換剤がバクミドDNA単離のために単離された白色組換えコロニーを得るのに十分です。24ウェルトランスフェクションプレート中の接着性Sf9細胞を、無血清昆虫培地の0.5mLで2 x 105/mLの細胞密度で播種した。このボリュームは、井戸の作業面のカバレッジを確保するのに十分です。同時に、トランスフェクションミックスを希薄化しすぎ、トランスフェクション効率を高めます。トランスフェクション試薬はSf9細胞に対して無毒であり、培地交換は必要ありません。メディアの変化の代わりに、10%(v/v)FBSを含む培地の追加1.5 mLをトランスフェクションプレートに4〜5時間トランスフェクションタイムで添加し、細胞増殖を促進します。両方のトランスフェクション試薬のトランスフェクション効率が高い。それでもX-tremeGene 9では、トランスフェクトされた細胞の感染の兆候(図2)はJetPrime試薬より10〜12時間早く現れるので、プロトコルの次のステップの作業スケジュールに応じてこれらの試薬の中から選択します。
タンパク質検査発現スクリーニングは、トランスフェクションプレートから採取し、P1と標識した初期組換えウイルスの量が、タンパク質発現スクリーニングに使用する制限因子である場合にP2ウイルスで設定することができる。
小規模から大規模なカルチャ に移行する場合の考慮事項。 歴史的に、最適な細胞増殖はSf9細胞維持およびスケールアップ生産の懸濁液培養において高い空域を必要とすると考えられていた。しかし、2014年には、培養容器の高い空域は、これまで考えられていた17よりも重要ではないと報告されました。揺れプラットフォームの軌道投げに適宜調整された揺れ速度を用いて設置された培養容器は、より長い時間の間小さな気泡を作成し維持することによって、高充填体積懸濁液培養中でも十分な酸素移動を提供する。このアプローチにより、市販の昆虫細胞は、高い細胞生存率を犠牲にすることなく、細胞の倍率の正常範囲内でより高い揺れ速度で培養することができる。
このように、6年前、細胞維持時に揺れフラスコ中の懸濁培養量を増加させ始め、揺れの状態を調整・監視しながらタンパク質製造用の異なるタイプの培養容器を導入した(図6)。これらの培養容器に最適な条件を確立するために、細胞の生存率、サイズと形状、凝集の状態、細胞の感染性とともに、細胞の倍加時間などのSf9細胞培養パラメータを監視しました。
例えば、Sf9細胞維持のために、2.8Lフェルンバッハシェイクフラスコでは、27°Cで150rpmで揺れるSf9懸濁液細胞の0.8Lの代わりに2Lを培養し、細胞生存率はほとんどの時間で99%に近く、均一に形成された健康な分割細胞を有する。スケールアップ生産では、25°Cの低温で高速145rpmで揺れる5L試薬ボトル内の4Lの細胞に感染します。 内蔵の揺れプラットフォームを備えた最も一般的に使用されるインキュベーターは、6 x 2.8 Lシェイクフラスコまたは6 x 5 L試薬ボトル、または10 x 2.5 Lタネールシェイクフラスコを保持できます。したがって、1つの揺れプラットフォームの容量は、フェルンバッハシェイクフラスコと試薬ボトルを1/3に充填すると、2.8 Lフェルンバッハシェイクフラスコを使用して4.8 L対12 L、5 L試薬ボトルを使用して10 L対24 Lである(図6)。大量の培養容器におけるサスペンション細胞培養の維持とスケールアップ生産は、生産量の限界を克服し、大規模なプラットフォームを採用しています。したがって、これは、バイオリアクターや生産パイプラインの限られたスペースにアクセスできるラボに非常に便利です。
このプロトコルは、適切な樹脂を利用し、SGCの発表された論文6 に記載されているように、PRMT4、7、9、およびHisタグ付きPRMT5-MEP50複合体およびPRMT6のフラグタグ付きタンパク質に関する精製バッファーを改変することにより、異なる親和性タグを有するタンパク質構築物の製造および精製に容易に適応することができる。我々は、タンパク質のPRMTファミリーのためのBEVSプロトコルを記述するが、同じアプローチは、他のタンパク質ファミリーに適用することができます。

タンパク質アルギニンメチルトランスレシエート酵素 (PRMTs) モノメチルまたは対称/非対称ジメチルの方法でのメチルアルギニン残基.繰り返しのRG/RGG/GRG配列は、ほとんどのPRMTで非常に好ましく、多種多様なタンパク質1,2に見られる。ヒストンや転写因子などのアルギニンメチル化タンパク質やスプライシング因子は、転写、スプライシング、クロマチン構造3、4を調節する。PRMTの基質および補因子利用、ターンオーバー、および運動論の多様な調節に関する知識の増加は、選択的阻害剤の生成と同様に、これらの酵素およびそれらの複合体5,6に機械化光を当てる。しかし、PRMTファミリーの全てのメンバーが同じ程度に研究されるわけではありません。たとえば、PRMT9 は、最近 PRMT ファミリ 1 のメンバであることが確認されたのです。これらのタンパク質の構造および酵素機能研究は、十分なミリグラム、組換えタンパク質の量が利用可能である必要があります。
エシェリヒア・コリ(大腸菌)原核生物発現系は、通常、所定のタンパク質7、8、9に対する複数の構成体を利用した発現スクリーニングの第一選択である。しかし、大腸菌系の発現は、PRMT5およびPRMT7(下記参照)に特に述べたように、常に活性な形態で十分な量のPRMTタンパク質をもたらすとは限らない。従って、大腸菌で発現できなかったか、真核生物発現機械によって製造される必要があるPRMTは、代替バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)における発現スクリーニングに適したベクターにサブクローニングされた。PRMT1、PRMT3およびPRMT8の発現サンプルは、インビトロアッセイおよび結晶学のために広く利用されているが、その二重メチルトランスファーゼドメインのMEP50結合パートナーを必要とするPRMT5、およびPRMT7および9のようなPRMTsのような、十分な量の活性タンパク質を得るために必要な昆虫細胞発現を必要とするPRMT5のような他のPRMTS。全体として、PRMT4、5、6、7、および9に対する標準化された中スループットメチルトランスファーゼアッセイは、昆虫細胞6においてBEVSを利用している。バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生物化学的、生物物理学的、および構造研究10、11、12に不可欠な翻訳後修飾を可能にする真核生物発現機械を必要とする組換えタンパク質を産生する汎用性の高いプラットフォームである。1983年にタンパク質発現13に対するバキュロウイルスの使用が最初に報告されて以来、いくつかのBEVSが市販されている。これらのプロトコルのほとんどは、発現プラスミドを昆虫細胞に移すさまざまな戦略を採用している。これらには、バクツーバク、フラッシュバック、バキュロゴールドブライト、バクベクトル-3000、バクマジック、バクパックなどが含まれます。我々のプロトコルは、BEVSで最も一般的に使用されるシステム、Bac-to-Bacシステム14に基づいており、目的のタンパク質をコードする遺伝子/cDNA(POI、ここではPRMT)を、部位特異的転置15を介して大腸菌の特殊株に維持されたバキュロウイルスゲノムに移すことを目的としています。
簡単に言えば、目的の遺伝子を含むプラスミド転写ベクターをDH10Bac E.大腸菌 の有能な細胞に変換し、組換えウイルスバクミドDNAを生成した。接着Sf9細胞は、次いでバクミドDNAでトランスフェクトされた。トランスフェクションの4~5日後、細胞培地中に分泌された最初の組換えバキュロウイルスを回収し、P1ウイルスとして標識した。P1バキュロウイルス株は、ウイルス増幅(すなわち、P2バキュロウイルス株の生成)およびタンパク質発現スクリーニングに使用された。発現スクリーニング結果に基づいて、タンパク質の最良の発現構築のためのP2ウイルスを同定し、大規模タンパク質産生のためのバキュロウイルス感染昆虫細胞(SCBIIS)の懸濁培養物を生成するために使用した。ここでは、当社の詳細なプロトコルについて説明し、試薬と培養容器の選択肢の背後にある根拠を説明し、より時間効率の高い、コスト効率の高いスケーラブルな方法論を開発し、所望の組換えタンパク質を十分に得るための戦略を支援します。

<table><tbody><tr><td>2.8L ナルゲン&nbsp;Fernbach Culture Flask, Polycarbonate,Nalgene</td><td></td> <td>29171-854</td><td>Sf9細胞の懸濁液培養の大規模維持用</td></tr><tr><td>24ウェルブロック RB</td><td>Qiagen</td><td>19583</td><td>4ml懸濁液のインキュベーション用&nbsp;Sf9細胞&nbsp;タンパク質の場合&nbsp;発現スクリーニング</td></tr><tr><td>4-20 基準 TGX Gel 26W 15 ul</td><td>Biorad</td><td>5671095</td><td>精製タンパク質のSDS-PAGe分析用</td></tr><tr><td>50ml 試薬リザーバー</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229290</td><td>&nbsp;希釈トランスフェクション試薬に用いるリザーバー&nbsp;そしてSf9細胞の懸濁液</td></tr><tr><td>96井戸の帽子のマット、正方形の井戸との使用のために、2つのmL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>381080</td><td>96の井</td></tr><tr><td>戸のブロック96の井戸のPCRの版</td>を覆うのに使用 <td>Eppendorf</td>の<td>30129300</td><td></td></tr><tr><td>バクト寒天</td><td>BD</td><td>214010</td><td>LB寒天の選択のための</td></tr><tr><td>paltesのAirporeテープシート</td><td>Qiagen</td><td>19571</td><td>蛋白質の表現のスクリーニング</td></tr><tr><td>のための24の井戸のブロックをカバーするためAllega X-15R 遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質 抗真菌薬 (100x)</td><td>Gibco</td><td>15240112</td><td></td></tr><tr><td>Bacmid DNA</td><td>社内</td><td>非カタログ項目</td> バ<td>キュロウイルス生産用バクミド DNA</td>、</tr><tr><td>Bluo-Gal、1g</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15519028</td><td></td></tr><tr><td>ベックマン JLA 8.1000</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>細胞培養プレート、24 ウェル、付属蓋、平底、滅菌済み</td><td>エッペンドルフ</td><td>30722116</td><td>ティッシュ&nbsp; 培養処理プレート</td></tr><tr><td>細胞再懸濁液 0.5&nbsp;L</td><td>ミリポアシグマ</td><td>LSKCRS500</td><td>バクミドDNA抽出</td></tr><tr><td>用セル&nbsp;溶解液 0.5&nbsp;L</td><td>ミリポアシグマ</td><td>LSKCLS500</td><td>バクミドDNA抽出用</td></tr><tr><td>CELLSTAR&nbsp;組織培養プレート、96ウェル</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655180</td><td>トランスフェクションミックス用</td></tr><tr><td>ClipTip 1250、フィルターリロード、滅菌</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>94420818</td><td>Tips for&nbsp; プログラム可能で調整可能なマルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>dNTP Mix (各 25 mM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1121</td><td></td></tr><tr><td>E1-ClipTip&nbsp;電子調整可能なチップ間隔マルチチャンネルイコライザーピペット、15〜1250 &mu;L</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4672090BT</td><td>プログラム可能で調整可能なマルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>E4&nbsp;XLS調整可能スペーサー6チャンネルピペット、20-300 &mu;L</td><td>Ranin</td><td>LTS EA6-300XLS</td><td>Ranin調整可能マルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>フィルターマイクロプレート、96ウェル、ポリプロピレン、25 &micro;mの超高分子量ポリエチレンの膜</td><td>Agilent</td><td>201005-100</td><td>表現のスクリーニングの蛋白質の浄化のため</td></tr><tr><td>フルバッフルのフラスコのキットTunair、2.5L</td><td>IBIの科学的な</td><td>SS-6003C</td><td>SF9細胞の懸濁液の文化の大規模な蛋白質の生産のため</td></tr><tr><td>Gentamicin 10x10ml</td><td>BioShop</td><td>15750078</td><td></td></tr><tr><td>熱不活化胎児のウシの血清</td><td>WisentのBiocenter</td><td>080-450</td><td></td></tr><tr><td>I-Max 昆虫培地 L-グルタミン 1 L</td><td>Wisent Biocenter</td><td>301-045-LL</td><td>無血清昆虫細胞増殖培地</td></tr><tr><td>インスタントブルー 超高速タンパク質染色</td><td>Expedeon Protein Solutions</td><td>ISB1L-1L</td><td>タンパク質ゲル(SDS-PAGE)染色用</td></tr><tr><td>Iptg、Ultra Pure、Dioxane Free、最小 99.5%</td><td>BioShop</td><td>IPT001.100</td><td></td></tr><tr><td>JetPRIMEトランスフェクション試薬&nbsp;付属品&nbsp;ジェットプライムバッファー</td><td>ポリプラストランスフェクション株式会社</td><td>114-01</td><td>バキュロウイルスを生成するためのSf9細胞トランスフェクション用</td></tr><tr><td>カナマイシンモノサルフェート</td><td>BioShop</td><td>KAN201.100</td><td></td></tr><tr><td>Lb ブロス (レノックス)、粉末微生物 Gro&</td><td>シグマ</td><td>L3022-1KG</td><td></td></tr><tr><td>マスターブロック96ディープウェル2.4mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>780285-FD</td><td>形質転換および発現スクリーニング手順に使用</td></tr><tr><td>最大効率DH10Bacコンピテントセル、0.5mL</td><td>サーモフィッシャー</td><td>10361012</td><td>バクミドDNA生成用コンピペット</td></tr><tr><td>mLINE 12チャンネルピペット、調整可能 30-300 uL</td><td>ザルトリウス</td><td>ザルトリウス725240</td><td>12チャンネルピペット</td></tr><tr><td>中和液、0.5&nbsp;L</td><td>ミリポア シグマ</td><td>LSKNS0500</td><td>バクミド DNA 抽出</td></tr><tr><td>用 ニューブランズウィック州&nbsp;Innova 44R、120V、軌道 2.5 cm (1 in)</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td>Sf9 細胞の懸濁液のインキュバイオン用シェーカーインキュベーター</td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td>タンパク質精製用</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>LS15140122</td><td></td></tr><tr><td>PYREX&nbsp;デロングシェーカー三角フラスコバッフル、コーニング&nbsp;500ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-500</td><td>For&nbsp; Sf9細胞の懸濁培養</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker Erlenmeyer フラスコ バッフル付き、コーニング&nbsp; 125ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-125</td><td>Sf9細胞の懸濁培養用</td></tr><tr><td>PYREX Delong Shaker 三角マイヤーフラスコ、バッフル付き、コーニング&nbsp; 250ml</td><td>Pyrex</td><td>4444-250</td><td>Sf9細胞</td></tr><tr><td>の懸濁培養用レッドセーフ&nbsp;核酸&nbsp;酸&nbsp;染色&nbsp;溶液</td><td>Froggabio</td><td>21141</td><td></td></tr><tr><td>RNase A、0.9&nbsp;mL</td><td>ミリポア シグマ</td><td>LSKPMRN30</td><td>バクミド DNA 抽出用懸濁液バッファー用</td></tr><tr><td>ロール &球形ガラスめっきビーズ</td><td>MPバイオメディカル</td><td>115000550</td>を成長させます<td>。寒天プレートの表面全体に細菌&nbsp;細胞の広がり&nbsp;</td></tr><tr><td>RT-LTS-A-300&mu;L-768/8 (先端)</td><td>ラニン</td><td>30389253</td><td>ラニンマルチチャンネルピペット</td></tr><tr><td>用ヒント S.O.C. 中</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>15544034</td><td></td></tr><tr><td>血清、細胞培養、ウシ胎児血清 (FBS)、ハイクロン、特徴付けられたカナダの</td><td>cytivalifesciences</td><td>SH3039602</td> 血清<td>フリーメディムに加えて、トランスフェクト細胞</td></tr><tr><td>Sf9 細胞</td><td>サーモフィッシャー</td><td>12659017</td><td>昆虫細胞</td></tr><tr><td>Sfx-Insect Cell Culture Media</td><td>Cytiva (Formerly GE Healthcare Life Sciences)</td><td>SH3027802</td><td>無血清昆虫細胞増殖培地</td></tr><tr><td>テープパッド</td><td>Qiagen</td><td>19570</td><td>テープパッド</td></tr><tr><td>Taq DNAポリメラーゼ ThermoPol Buffer - 2,000 units</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0267L</td><td></td></tr><tr><td>テトラサイクリン Hcl</td><td>BioShop</td><td>TET701.10</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー 0.4%ソリューション</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td>For&nbsp; 細胞生存率の評価</td></tr><tr><td>VITLAB&nbsp;試薬ボトル、スクリューキャップ付きPP、PP、BrandTech、5L</td><td>VITLAB</td><td>V100889</td><td>Sf9細胞の懸濁培養における大規模なタンパク質生産用</td></tr><tr><td>VWR&nbsp;デジタルミニインキュベータ</td><td>ーVWR</td><td>10055-006</td>接着<td>性Sf9細胞用インキュベーターVWR</td></tr><tr><td>&nbsp;インキュベーティングマイクロプレートシェー</td><td>カーVWR</td><td>97043-606</td>イン<td>キュベーター、24ウェルブロックのSf9細胞の懸濁培養用</td></tr><tr><td>VWRシャーレ</td><td>VWR</td><td>CA73370-037</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGene 9 DNA&nbsp;トランスフェクション試薬&nbsp;1.0 M</td><td>Roche</td><td>6365787001</td><td>Sf9細胞トランスフェクションによる組換えバキュロウイルスの生成</td></tr></tbody></table>

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えprmtタンパク質の生産

Production of Recombinant PRMT Proteins using the Baculovirus Expression Vector System

タンパク質アルギニンメチルトランスレシエージ (PRMTs) 多くの細胞プロセスで役割を果たすタンパク質の多種多様なメチル酸アルギニン残基.PRMTは、単一またはジメチル化アルギニングアニジノ基を対称的または非対称にすることができる。これらのタンパク質の酵素学は、高品質の組換えタンパク質のミリグラム量を必要とする複雑で激しく調査された領域です。 オートア・カリフォルニカ 多核多核体ウイルス(AcMNPV)および スポドプテラ・フルギペルダ 9(Sf9)昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、PRMT1、2、および4〜9を含む多くのPRMTの発現スクリーニングおよび産生に使用されている。ドメインや切り捨てられた断片、フルレングスタンパク質を含むこれらのタンパク質の複数の構造の発現を同時にスクリーニングするために、24および96ウェルプレートおよびブロックと組み合わせた調整可能でプログラム可能なマルチチャネルピペットを利用したスケーラブルな方法を適用しました。全体として、これらの方法の調整により、バクミドDNA、組換えウイルス、およびタンパク質発現スクリーニングの大規模な生成が可能になりました。Sf9細胞懸濁液の大量充填量の培養容器を使用して、単一バッチの大規模タンパク質生産のための生産パイプラインのスペース制限を克服するのに役立ちました。ここでは、生化学的、生物物理学的、および構造的研究のための機能的PRMTの効率的かつ費用対効果の高い発現のための詳細なプロトコルについて説明する。

BEVS プロトコルの概要を図 1に示します。PRMTの複数発現構築物は、全長、ドメイン、および切り捨てられた断片を含む、構造ゲノミクスコンソーシアム(SGC、トロント)で生成され、比較的高い発現レベル7,9で可溶性および安定性タンパク質を同定するための成功率を高めようとして社内戦略に従った。関心のある読者は、発現クローンに組み込まれた遺伝子配列のセグメントとして「断片」を設計するSGCの定義と方法論を検討し、PFAMアノファクタ化された構造ドメインとしての「ドメイン」、および発現ベクターでクローン化された断片としての「構築」を検討することが奨励される。このプロトコルで提示されるPRMTの発現構築物は、pFastBac1ベクターの誘導体であるpFBOH-MHLベクターにクローン化されたポリヒスチジンタグタンパク質の産生に関するものである。図4では、Sf9細胞での4mLの産生後に採取したペレットから精製されたPRMT1、2、4-9のHisタグ付き可溶性構築物のSDS-PAGE分析を提示する(ステップ3.1.4)。フルレングス(FL)PRMT1およびPRMT9は、このゲルでは提示されておらず、FL PRMT1は大腸菌から製造されているので、BEVSから製造されたFL PRMT9はFlagタグ6によって精製されている。PRMT1、FL PRMT4、およびすべてのPRMT8コンストラクトの切り捨てられた構成体は比較的高い収率を示すが、タンパク質溶出物は共精製汚染物質の分画を含む。これらの構成体は、精製プロトコルのさらなる最適化を必要とする。したがって、分析結果を浄化したリセートを用いたインキュベーションの段階でのニッケルビーズの量の減少など、スケールアップ生産からこれらのタンパク質の純度を向上させるためには、さらなるアプローチが必要です。洗浄バッファー内のイミダゾール濃度の増加;TEVプロテアーゼによるHisタグの切断、続いてNi-affinity樹脂への適用;サイズ排除やイオン交換クロマトグラフィーなどの追加の精製ステップ。PRMT2の構築物は、強力な汚染バンドを伴う他のタンパク質および全長PRMT2タンパク質と比較して有意に低い収率を示す。スケールアップ生産とIMACおよびサイズ排除などの精製の2つのステップは、FLタンパク質の共精製汚染物質の持続的存在と共に、この構造の低発現レベルを確認した。純粋なタンパク質は、その義務結合パートナーであるMEP50で製造および精製されたPRMT5複合体について得られた。PRMT9の切り捨てられた構造は、他のPRMTと比較して、ほぼ2〜3倍の低い発現レベルを有し、1.5mg/Lに近い。それにもかかわらず、この構成体の組換えウイルス株はスケールアップ生産に用いられ、回折結晶が得られ、このタンパク質に対してPRMT4、6、および7と共に構造が解された(図5)。
スケールアップ産生については、対応するP2ウイルスを使用してSf9昆虫細胞の懸濁液培養に感染した。このステップは、上清中の感染細胞およびP3ウイルスを含むバキュロウイルス感染細胞の50/100/200 mLを生成する。大規模なタンパク質生産のために、2LのSf9細胞を150rpm、27°Cでそれぞれ2.8 Lのフェルンバッハ振動フラスコで培養した(図6)。生産日に、2 LのSf9細胞(細胞生存率&gt;97%)2.5 Lタネアシェイクフラスコまたは4 Lの5L試薬ボトルでは、4 x 106/mLの細胞密度に希釈した。これらの細胞は、バキュロウイルス感染昆虫細胞の懸濁培養液の10-12 mL/Lに直接感染し、145rpmで25°Cの低温でインキュベートした。バキュロウイルス感染昆虫細胞の懸濁培養による生産バッチの直接感染は、ウイルス量増幅における手間のかかるステップを大幅に減少させ、感染細胞の余分な取り扱いを除き、価価およびウイルス分解の減少を回避した。SF9細胞培養の維持およびスケールアップ生産は、1つのバッチで大規模なタンパク質生産を採用するために大量の培養容器で行われている(図6)。
全長PRMT 4、5(MEP50との複合体)、6、7、およびバキュロウイルス媒介生産プラットフォームから産生される9タンパク質は、SGC6での運動特性評価および阻害剤化合物スクリーニングに使用されている。結晶構造を解いて、タンパク質PRMT 4、6、7、および9の全長または切り捨てられた形態のタンパク質データバンク(PDB)に、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて堆積させた。これらのPRMTの発現プラスミドは、Addgeneプラスミドリポジトリに堆積し(AddgeneはSGCの配布パートナーであり、https://www.addgene.org/)、研究コミュニティに利用可能である(図5)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig01.jpg"> 図1: バキュロウイルス発現プロセスの手順の概略図図 この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig01large.jpg" target="_blank">図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig02.jpg"> 図2:バキュロウイルス感染および感染していないSf9細胞 感染の兆候は、昆虫細胞の構造変化であり、例えば、細胞径の25〜50%の増加、拡大細胞核、均一に丸みを帯びた形状、増殖の喪失、および培養皿表面への付着、ならびに細胞生存率の低下である。白スケールバー200 μm。ここで提示される感染の徴候は、トランスフェクション試薬、JetPrimeおよびX-tremeGene 9の両方を使用してトランスフェクション細胞のために同じです。示される特定の例は、ジェットプライムトランスフェクション試薬に対するものである。(A) コントロールとして感染していない Sf9 細胞。(B) バキュロウイルス感染Sf9細胞 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig03.jpg"> 図3:試験発現タンパク質を迅速に精製するための結合板アセンブリ詳細については、手順3.2.1-2<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください、テキストを</a>参照してください。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig04.jpg"> 図4:タンパク質発現スクリーニング結果 異なるPRMTおよびPRMT5-MEP50複合体に対応するP1組換えウイルスに感染したSf9懸濁培地の4mLにおけるバキュロウイルス媒介タンパク質産生のタンパク質発現スクリーニング結果。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig05.jpg"> 図5:構造ゲノミクスコンソーシアム(SGC)での結晶構造研究に用いられるPRMT4,6,7,9の発現構造の概要 結晶構造は、タンパク質の完全な長さまたは切り捨てられた形態のタンパク質PRMT 4、6、7、および9のタンパク質データバンク(PDB)に、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて解いて堆積した。これらのPRMTの発現プラスミドは、Addgeneプラスミドリポジトリに堆積し、研究コミュニティに利用可能です(AddgeneはSGCの配布パートナーです https://www.addgene.org/)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62510/62510fig06.jpg"> 図6:異なる培養容器におけるSf9昆虫細胞の維持とタンパク質産生:(A)2.8 Lフェルンバッハフラスコ細胞維持およびタンパク質産生72%の充填量を使用すると、1つの揺れプラットフォームでスループット率が2.5倍に向上します。(B)タネールシェイクフラスコ(この写真では10個中9本のフラスコのみ)と80%の充填量の試薬ボトルは、揺れプラットフォームの生産能力を大幅に向上させます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62510/62510fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>

バキュロウイルス発現ベクターシステム(BEVS)は、生化学的、生物物理学的、および構造研究に使用されるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼ(PRMT)の発現スクリーニングおよび生産のための堅牢なプラットフォームです。物質のミリグラム量は、真核生物発現プラットフォームを必要とする関心のあるPRMTおよび他のタンパク質の大部分のために製造することができる。

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

Protein arginine methyltransferases (PRMTs) methylate arginine residues on a wide variety of proteins that play roles in numerous cellular processes. ...

このプロトコルの全体的な目的は、大規模な生産におけるタンパク質アルギニンメチルトランスワサーゼの複数の構築物の発現スクリーニングであり、培地での生化学的、生物理学的、および構造研究のためのタンパク質のミリグラム量を得るために、発現プラットフォームS、バキュロウイルス発現ベクター系のカバレッジにおけるコスト効率の高いモードである。アルマ・セイトヴァ博士は以下のステップを紹介します。指数関数的に増殖するSF9細胞を無血清昆虫培地で1mil当たり0.4百万の最終的な細胞密度に希釈し、滅菌試薬貯留槽に注ぎます。プログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用して、希釈されたSF9細胞の0.5ミルを24ウェルプレートの各ウェルに播種します。このボリュームは、井戸の作業面のカバレッジを確保するのに十分です。同時に、トランスフェクションミックスをあまり希釈しすぎないようにして、トランスフェクション効率を可能にします。プレートのウェルを細胞のみとしてラベル付けし、トランスフェクトされた細胞と非トランスフェクトされた細胞の比較のためのコントロールとして使用して、感染の潜在的な兆候を評価する。必要になるまでプレートを27度、約1時間でインキュベートし、細胞を細胞培養プレートに付着させます。無添加の昆虫培地と滅菌試薬の貯蔵槽に十分に混合されたトランスフェクション試薬を薄め、10秒間やさしく混ぜます。12チャネルピペットを使用して、希釈されたトランザクション試薬の102マイクロリットルを滅菌96マイクロウェルプレートに移します。組み換えバクミドDNAのマイクロリットル当たり0.2マイクログラムの10マイクロリットルを96ウェルマイクロウェルプレートの対応するウェルに移し、側面からプレートをタップして穏やかに振って混ぜます。トランスフェクションミックスを15~20分間インキュベートし、複雑な形成を行います。96と24ウェルプレート間の移動のために設計された調整可能な6チャンネルピペットを使用して、トランスフェクションミックスをトランスフェクションプレートの対応するウェルのドロップワイズにトランスフェクションミックスを重ね、27度で4時間インキュベートします。トランスフェクションミックスが細胞の単層に均等に分配されるように、インキュベーション時間中にプレートを数回ゆっくりと前後に揺らします。トランスフェクション時間の4~5時間後に、1.5ミルの無血清昆虫培地を加えます。熱不活性化牛血清の10%末端と1%の抗生物質と抗ミヒコティックでそれを補う。27度インキュベーターで細胞を72〜96時間インキュベートする。可能な場合は、トランスフェクションプレートを1日1回軽く揺らします。トランスフェクション後72~96時間のトランスフェクト細胞に明らかな感染の兆候を探します。トランスフェクションの4~5日後、転化した顕微鏡下でのコントロール細胞と比較して感染の兆候が明らかとなり、細胞培養培地に分泌される最初の組換えバキュロウイルスを収集する準備が整う必要があります。プログラム可能な電子マルチチャネルを使用して、P1ウイルスの収集、P1ウイルスの150マイクロリットルを有する24ウェルブロック内の懸濁細胞の感染における新種SF9細胞の感染を同時に可能にする。一括P1ウイルス株の残りの部分を15分間スピンダウンし、感染したSF9細胞の懸濁液培養で24ウェルブロックをAirPoaシートで覆います。24 ウェル ブロックを 27 度でインキュベートし、245 RPM で 72 ~ 96 時間振動します。予定生産時間の4日前に、指数関数的に成長するSF9細胞を、1ミルあたり200万個の最終細胞密度で、1%末端の抗生物質および抗ミコティックを含む血清フリー昆虫培地のバッフルを含むバッフルを持つエルレンマイヤーガラスシェイクフロスに分割した。このステップは、産生バッチ中の新しい細胞の感染のために上清中の感染した昆虫細胞およびP2ウイルスの懸濁培養を生成する。対応するP2ウイルスを追加し、細胞増殖を遅くするために25度の低い温度で感染細胞をインキュベートし、1インチのストロークで軌道シェーカー上の165 RPMで揺れます。予定生産時間の4日前に、昆虫血清フリー培地中のSF9細胞を2.8リットルのフェルンバッハシェイクフラスコで1ミル当たり100万個の細胞密度に指数関数的に増殖させるSF9細胞の種子2リットル。150 RPMで揺れでフラスコを27度で振る。研究科学者アシュリー・ハッチンソンは次のプロトコルを実証します。指数関数的に成長するSF9細胞と昆虫血清フリー培地の4リットルを、1ミル当たり400万個の最終的な細胞密度に分割し、5リットル試薬ボトルを大量に使用します。感染したバキュロウイルスの懸濁液培養液を10~12ミルに加える。SF9細胞の感染培養物をシェーカーにインキュベートし、摂氏25度の低温で145RPMを72〜96時間振り出す。SF9細胞におけるバキュロウイルス即時産生におけるPRMTファミリーから発現するいくつかの組換えタンパク質のミリグラム量は、図5に見られるように生化学的生化学的な生物学的教育研究に使用される。SGCでは、結晶構造をタンパク質データバンクに全長または切り捨てられた形態のタンパク質PRMT4、6、7、および9に対して、様々な化学プローブおよび阻害剤を用いて解いた。これらのPRMTに対する発現プラスミドは、SGCによって遺伝子収集を加えるために堆積し、研究コミュニティに利用可能である。このビデオでは、バキュロウイルス発現系における大規模な生産におけるタンパク質アルギニンメチルトランスレシナーゼの複数の構成体の遠征スクリーニングを成功させるための重要な要素を強調しました。定期的に調整可能でプログラム可能なマルチチャンネルピペットを使用することで、プロセス全体が効率的よりも迅速になりました。細胞に対して高性能かつ少ない細胞毒性の使用は、組換えウイルスの生成のためのトランスフェクション試薬は、よりコスト効率の高い、そしてこの細胞処理トランスフェクションプロトコルにつながった。6細胞に感染したバキュロウイルスの懸濁培養によるタンパク質産生のための大規模バッチの感染は、重要なスターター増幅における時間のかかるステップにおける労働を大幅に減少させた。例えば、感染細胞の特殊培養でこれを遠心分離する。それはもちろん、ウイルスの分解の厳しい中で避けるために感染細胞の余分な取り扱いを除外しました。このスケールアップでの培養細胞維持を培養容器内でのサスペンション培養細胞維持は、生産量の限界を克服し、大規模なプラットフォームを採用するのに役立つ高い分野容積であった。これは、バイオリアクターへのアクセスや生産パイプラインの限られたスペースを持たないラボに非常に便利です。我々のプロトコルは、タンパク質アルギニンメチルトランスレーゼファミリーのタンパク質について説明されているが、同じアプローチは、生化学的生化学的指導研究のために十分な量のタンパク質を得るために発現プラットフォームを必要とする他のタンパク質ファミリーに適用することができる。

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

生物化学

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学ぶバキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の大量生産法。SF9細胞を用いてミリグラム単位のタンパク質を効率的に調製し、生化学・構造生物学研究に応用する。

バキュロウイルス発現ベクターシステムを用いた組換えPRMTタンパク質の生産

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