Name: ゼブラフィッシュガストラの2光子顕微鏡を用いた深部および空間制御体積アブレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-07-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: 学ぶゼブラフィッシュガストラの2光子レーザーアブレーション法。特定細胞を深部で正確に破壊し、隣接細胞への影響を観察することで、集団細胞移動と機械的相互作用のメカニズムを解明する。

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<li>Farhadifar, R., Röper, J. -C., Aigouy, B., Eaton, S., Jülicher, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+cell+mechanics%2C+cell-cell+interactions%2C+and+proliferation+on+epithelial+packing%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The influence of cell mechanics, cell-cell interactions, and proliferation on epithelial packing.</a> Current Biology. 17 (24), 2095-2104 (2007).</li>
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著者らは競合する利益を宣言しない。

ここでは、非線形光学を使用して深く、空間的に明確に定義されたボリュームアブレーションを実行するプロトコルについて説明します。プロトコルの最も重要なステップは、過度の破片やキャビテーションを避けるために、アブレーションを可能にするのに十分なエネルギーを提供するが、あまりにも多くのエネルギーを提供する治療条件を見つけることです。標的部位での送達エネルギー量は主に依存する:(1)レーザー出口電力、(2)レーザーアライメントの品質、(3)光がアブレーション平面に到達するために通過する組織の性質、(4)アブレーション平面の深さ。したがって、各実験の前に、レーザー出口電力を測定し、基準値(プロトコルでは820 nmで300 mW)に調整し、適切なレーザーアライメントを確保することが重要です。これらの仮定の下で、治療条件は実験日から別の日に再現可能であるべきです。特定のサンプルタイプに最適なパラメータ(レーザーパワーと処理フレーム数)を定義するために、広範なテストを実施することをお勧めします。これらのパラメータは、すべての同様の実験で使用することができます。ここで説明する例(ガストルレーション中のポルターの切断)では、例えば、胚内の異なる深さで切り出...

細胞間相互作用は、開発において重要な役割を果たします。細胞は、直接の隣人、または遠く離れた細胞が知覚できる信号を提供し、それによってその運命および/または行動に影響を与えます。これらの信号の多くは、自然の中で化学的です。例えば、よく特徴付けられる誘導事象では、ある細胞群は、別の細胞集団の運命に影響を与える拡散性分子を生成する1。しかし、他の信号は機械的です。細胞は、隣人が知覚し、2に応答する彼らの隣人に力と制約を発揮します。
生体内での細胞間相互作用の重要性を研究する一つの方法は、細胞を除去し、その後の発達を観察することです。残念ながら、細胞を除去または破壊する利用可能な技術は限られています。細胞は、針または小さなワイヤーを使用して外科的に3,4を除去することができるが、そのような治療は侵襲的であり、あまり正確ではなく、通常は実体顕微鏡下で行われ、顕微鏡下での即時のイメージングを防ぐ。さらに、深部細胞を標的とすることは、上層部の組織に穴を開け、望ましくない摂動を生み出すことも意味します。遺伝的にコード化された光化物は、KillerRedのような、光照明を介して細胞死を誘導するために使用されてきた5。光化剤は、光照射時に活性酸素種を生成するクロモフォアです。彼らの主な制限は、細胞が動いている場合に達成するのが難しいかもしれない長い光のイルミネーション(約15分)を必要とし、即座ではないアポトーシスを通じて細胞死を誘発することです。
最後に、レーザーアブレーションは、過去15年間で開発され、広く使用されています 6,7,8,9,10,11,12.レーザービームは標的細胞/組織に焦点を合わせる。それは加熱、光切除、またはプラズマ誘発アブレーションを通してそのアブレーションを誘発する;関係するプロセスは、電力密度と露光時間13に依存します。ほとんどのアブレーションプロトコルは、高エネルギーにUVレーザーを使用します。しかし、UV光は両方とも生体組織によって吸収され、散乱される。したがって、深部細胞を標的化するには高いレーザーパワーが必要であり、その後、より表面的で平面外の組織に損傷を与える。これは、表面構造にUVレーザーの使用を制限し、その比較的低い軸解像度を説明します。非線形光学(いわゆる2光子顕微鏡)は、非線形の光特性を使用して、赤外線領域内の約半エネルギーの2つの光子を有する蛍光色素を励起する。アブレーションに適用する場合、これには3つの主な利点があります。まず、赤外線は生体組織14によるUV光よりも散乱が少なく、吸収が少なく、必要なレーザーパワーを増加させることなく、より深い構造に到達することを可能にする。第二に、フェムト秒パルスレーザーの使用は、プラズマ誘導を介してアブレーションを作成し、加熱に反して、空間的に拡散しない非常に高い電力密度を提供します15。第3に、プラズマ形成を誘導する電力密度は、焦点のみで到達する。これらの特性のおかげで、2光子レーザーアブレーションは、周囲の組織環境に影響を与えることなく、深部細胞を正確に標的化するために使用することができます。
集団移動は、細胞と細胞の相互作用が基本的な発達過程の優れた例である。集合的な移行は、隣接するセルが 1 つの cell16 の動作に影響を与えるセル移動として定義されます。これらの相互作用の性質(化学的または機械的)およびそれらが細胞の移動に与える影響は大きく異なり、多くの場合、完全には理解されていません。細胞を除去し、これが他の人にどのような影響を与えるかを観察する能力は、これらの集合的なプロセスをさらに解明する上で重要です。数年前、ゼブラフィッシュの胃の中でポルスターの移動が集団移住であることを、外科的アプローチを用いて確立しました17。ポルスターは、胚18の後側の第1の内在化細胞を構成する細胞群である。 Tg(gsc:GFP) トランスジェニックラインで緑色に標識されたこれらの細胞は、胚の深部、エピブラスト細胞のいくつかの層の下に位置する。胃の間、このグループは軸性中胚の延長を導き、胚の形成者から動物の極19、20、21、22、23 に移動する(図1A)。私たちは、細胞が動物の極の方向に彼らの移動を向けるために彼らの隣人との接触を必要とすることを確立しました。しかし、この集団移動の細胞および分子塩基をよりよく理解するには、いくつかの細胞を除去して、これが残りの細胞にどのような影響を与えるかを確認する必要があります。そこで、2光子顕微鏡を用いて大体積と深いボリュームのアブレーションを開発しました。ここでは、このプロトコルを使用して、その真ん中にポルスターを切断し、Histone2B-mCherryで標識された核を追跡することによって細胞移動の結果を観察することを実証する。

<table><tbody><tr><td>25倍水浸対物レンズ</td><td>Olympus</td><td>XLPLN25XWMP2</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A8963,0500</td><td></td></tr><tr><td>データ分析ソフトウェア:Matlab</td><td>Math Works</td><td></td><td></td></tr><tr><td>電気光学変調器(EOM)</td><td>ConOptics</td><td>350-80LA</td><td></td></tr><tr><td>胚培地(EM)ソリューション</td><td></td><td></td><td>ウェスターフィールド、M.ゼブラフィッシュの本。ゼブラフィッシュ(Danio rerio)の実験室使用に関するガイド、第5版。オレゴン大学出版局、ユージーン(書籍)。(2000年)。</td></tr><tr><td>環境チャンバーチャンバー</td><td>Okolab</td><td>H201-T-UNIT-BL</td><td></td></tr><tr><td>EOM ドライバー</td><td>ConOptics</td><td>302RM</td><td></td></tr><tr><td>蛍光源</td><td>Lumencor</td><td>SOLA</td><td></td></tr><tr><td>ガラス底皿</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td></td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>ハーバード装置</td><td>300085</td><td>外径 1.0 mm、内径 0.58&nbsp;mm</td></tr><tr><td>ガラスピペット</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>チップは火で磨かれるべき</td></tr><tr><td>グリーン/アブレーションレーザー</td><td>Spectra Physics</td><td>Mai Tai HP DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>Histone2B-mCherry mRNA</td><td></td><td></td><td>Synthesized from pCS2-H2B-mCherry plasmid (Dumortier& al. 2012)</td></tr><tr><td>画像解析ソフトウェア: IMARIS</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImSpector software</td><td>Abberior装置開発チーム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>射出成形</td><td>Adapative Science Tools</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダーチップ</td><td>エッペンドルフ</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>マイクロマニピュレーター</td><td>成重</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>マイクロピペットプーラー</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE SP6 転写キット</td><td>Invitrogen</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー</td><td>15140-122</td><td>10,000 ユニット ペニシリンと 10 mgストレプトマイシン / ml</td></tr><tr><td>光電子増倍管 (PMT)</td><td>浜松</td><td>H7422-40</td><td></td></tr><tr><td>PicoPump (エアインジェクター)</td><td>ワールド精密機器</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>レッドレーザー</td><td>スペクトル物理学</td><td>OPO/Insight DeepSee</td><td></td></tr><tr><td>RNAse 注射用フリーウォーター</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td></td></tr><tr><td>スプレッドシートソフトウェア: Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>Tg(gsc:GFP) ゼブラフィッシュライン</td><td></td><td></td><td>Doitsidou, M. et al. ケモカインSDF-1による原始生殖細胞移動のガイダンス。セル。111 (5), 647&ndash;59, DOI: doi.org/10.1016/S0092-8674(02)01135-2 (2002).</td></tr><tr><td>TriM Scope II顕微鏡</td><td>La Vision Biotech</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ゼブラフィッシュガストラの2光子顕微鏡を用いた深部および空間制御体積アブレーション

Deep and Spatially Controlled Volume Ablations using a Two-Photon Microscope in the Zebrafish Gastrula

形態形成は、組織や器官に細胞を整理するために多くの細胞の動きを伴います。適切な開発のためには、これらすべての動きを緊密に調整する必要があり、証拠を蓄積することは、少なくとも部分的には機械的相互作用を通じてこれが達成されることを示唆している。胚でこれをテストするには、直接的な物理的摂動が必要です。レーザーアブレーションは、機械的な制約を緩和したり、2つの細胞集団を互いに物理的に分離することを可能にする、ますます使用されるオプションです。しかし、多くのアブレーションは、限られた軸解像度と組織の浸透を提供する紫外線(UV)レーザーで行われます。2光子顕微鏡を用いて深く、有意で、空間的に明確に定義された容積を取り下げるための方法をここに記載する。アブレーションは、軸性メセンドームの緑色蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックゼブラフィッシュラインで実証され、上にある外胚葉または下層の黄身細胞に影響を与えることなく軸性の間皮を切断するために使用される。細胞の挙動は、アブレーションの前後のライブイメージングによって監視されます。アブレーションプロトコルは、数ミクロンから100ミクロン以上のスケールで、任意の細胞タイプまたは組織上の異なる発達段階で使用することができます。

その途中でポルスターを切断するために、ヒストン2B-mCherry mRNAを注入した Tg(gsc:GFP) 胚を、ステップ4で説明したように70%エピボリー段階に取り付けた。このポルスターはGFPの発現により同定され、その胚は、ポルスターの平面が光軸に対して垂直になるように取り付けた(図1B)。胚をこの位置から離すと、手順が複雑になります。光はアブレーション平面に到達するためにより多くの組織を通過する必要があり、アブレーション平面は胚軸に対して傾きます。すべての細胞核が正しく標識されていることを確認した後、10分前アブレーションタイムラプスを記録し、アブレーション前の細胞の動きを捕捉した(図1E および 図3A、 ムービーS1)。
ポルスターは形態学的に同定され、その真ん中に位置する15μm x 200 μmの長方形領域は、ポルスターの全深部を断ち切...

胚発生には、細胞運動の大規模な調整が必要です。2光子励起媒レーザーアブレーションは、深部細胞の大群の空間制御3次元アブレーションを可能にする。さらに、この技術は、生体内で細胞を機械的環境 で 摂動する一括的に遊動する反応をプローブすることができる。

Morphogenesis involves many cell movements to organize cells into tissues and organs. For proper development, all these movements need to be tightly ...

胚の中では、細胞は互いに相互作用し、化学的および機械的な情報を交換する。これらの相互作用を調査する効率的な方法の 1 つは、いくつかの細胞を殺し、隣接するセルの結果を監視することです。我々が記述する方法は、我々は正確に隣接する組織を損傷することなく、胚内であっても、細胞をアブラ化することができます。第1レーザーをアブレーション波長820ナノメートルに、2番目のレーザーをmCherryイメージング波長1,160ナノメートルに設定して2光子顕微鏡を用意します。光路上の可動ミラーを使用して、2つのレーザービームを入口と出口に合わせ、820ナノメートルで最初のレーザーの最大出力を測定します。目的の下にパワーメーターを置き、黒い部屋を閉じ、パワーメーターで最初のレーザーパワーを100%スタートデータ収集に設定し、レーザーシャッターを開いて出力電力を測定し、300ミリワットに達するために必要なレーザーパワーの割合を計算します。1 番目のレーザーを 920 ナノメートルの GFP 励起波長に設定し、電力を 7%に設定して、2 番目のレーザーパワーを 15%に調整して、緑と赤の線の PMT 検出器をアクティブにし、緑と赤の線 PMT 感度を 65 に設定します。視野を 400 x 400 マイクロメートルに、画像解像度を 512 x 512 ピクセルに、スキャン周波数を 800 ヘルツに調整します。3D 時間経過イメージング モードを選択し、フォルダーを作成し、自動保存をアクティブにして、各取得後にデータを保存します。暖房室を組み立て、摂氏28度に設定します。チャンバーと目標が暖かくなるまで少なくとも10分待ちます。蛍光体型顕微鏡の下で、GFPを発現する70%のエピボリーで胚を同定する。プラスチック製のパスツールピペットを使用して、アガロースコーティングされた皿の中で3〜4つの選択された胚を移し、慎重に細かい鉗子でそれらをデコール化する。小さなガラスバイアルに、2%アガロースを含むペニシリンストレプトマイシン胚培地の溶液を1ミリリットル加え、42°Cの予熱した乾燥ブロックヒーターにバイアルを入れます。火で磨かれたガラスピペットを使用して、デコリオネート胚をバイアルに移し、アガロースにあまりにも多くの胚培地を加えないように注意する。残りの胚培地をピペットから捨てます。胚を吸引し、ガラス底皿のスライドを覆うのに十分なアガロースと一緒に戻った。皿のガラススライドに胚でアガロースを吹き飛ばし、胚が空気や皿のプラスチック側に触れていないことを確認します。その後、ガラススライドの周りのチャンバーをアガロースで満たします。まつげを使用して、ターゲット領域が上部になるように胚を向けます。5分後、アガロースが完全にセットされたら、ペニシリンストレプトマイシン胚培地を数滴加えてガラススライドに加える。熱い部屋の目的の下にガラス底皿を置きます。チャンバーを閉じる前にペニシリンストレプトマイシン胚培地に目的を浸します。スライダを動かして、光のパスをオキュラーに設定します。蛍光灯をオンにします。胚を見つけ、その表面に焦点を当てます。蛍光灯をオフにし、ライトパスをPMTに設定してから、黒いチャンバーを閉じます。ライブイメージングを開始し、軸中軸を見つけます。良い信号を持っている、レーザーパワーを調整します。赤いチャネルを使用して、ステージを胚の最上部に移動し、Z がゼロに等しい位置を割り当てます。1分のタイムステップと2マイクロメートルのZステップを選択してください。軸中隔の上に15マイクロメートル、軸中隔の下15マイクロメートルで最後のスライスに最初のスライスを設定します。アブレーション前の映画の10〜15分を記録します。ライブイメージングでは、ポルスター輪郭を見つけ、関心のある電気光学変調器領域、またはEOM-ROIツールを使用して、ポルスターの幅にまたがる20ピクセルの大きさの長方形を描き、長方形をポルスターの真ん中に配置します。高い面と最も低い平面の軸方向の位置を確認し、ROI がどの平面の卵黄セルにも重ならないようにします。退避する Z 位置の最低位置にステージを配置します。最初のレーザー波長を820ナノメートルに設定し、300ミリワットの出口電力を得るために、先に計算された電力の割合を入力します。イメージング周波数を 200 ヘルツに設定し、最初のレーザーイメージング EOM をゼロに設定します。ROI処理モードを選択した後、EOMをオフにして、ゼロフレームの直後に処理を開始するように設定します。イメージングモードをTimelapseにして、自動保存を無効にします。時間ステップで高速モードを選択した後、処理フレーム数とフレーム数を、目標とする深さに対応する値に調整します。イメージングを開始します。EOM治療中にPMTへのシャッターが閉じるので、取得は黒でなければなりません。次に、ステージを次の Z 位置に上げ、同様にアブレーションを実行します。ポールスターの上部に到達するまで、すべての Z 位置で繰り返します。アブレーションのプロセスが完了したら、最初のレーザーを920ナノメートルに設定し、以前に選択したイメージングパワーに調整します。最初のレーザーイメージングEOMを100にして、フルフィールドモードを選択します。イメージング周波数は800ヘルツにする必要があり、EOMは、すべての平面がアブレートされているかどうかを確認するために、ライブモードでスタック全体を調べる前にオフにする必要があります。アブレーションが確認されたら、イメージングモードとして3D時間経過を選択します。自動保存を再アクティブ化し、40〜60分間、アブレーション後のムービーの録画を開始します。アブレーション後のムービーで、対象となる細胞が効果的に失われたかどうかを確認します。ポルスター全体のアブレーションは胚に害を与えてはならないので、アブレートされた胚の正常な形態は受精後24時間で観察することができる。レーザーアブレーションの成功した結果では、重ね合う組織は基礎構造のアブレーションの影響を受けませんでした。あまりにも激しい治療、またはあまりにも少ない治療は、レーザーアブレーションの失敗をもたらしました。アブレーションが失敗した例は、ポルスターの上の焦点面の自己蛍光破片によって明らかであったポルスターの上の細胞がアブレーションされていることを示しています。別の効果のない試みでは、細胞は漂白されたが、アブレートされなかった、と低蛍光信号はまだ無傷の細胞輪郭を明らかにする。最後に、レーザー治療が不十分なため、一部の細胞は漂白さえされなかった。気泡の形成は、あまりにも強いレーザー処理によって誘発されるキャビテーションによるものである。Zスタックは、細胞質GFPと核mCherry信号の両方を記録し、成功したアブレーションで40分間毎分捕獲された。さらに、ポルスターの前半分に属する核はマゼンタドットでマークされ、アブレーションの前後に時間をかけて追跡されます。マイグレーション持続性の尺度として、アブレーション前後の細胞の方向自動相関が検討された。ポルスターの前部に属する細胞は、アブレーションの前に持続的な動きを示し、アブレーション後に大幅に減少し、集団方向移動の喪失を示した。レーザーを適切に調整し、レーザーパワーを測定することは、再現性のある結果を得るために重要です。また、最初のアブレーション後の画像でアブレーション効率を確認することも重要です。我々は、胚内の細胞の移動を導く細胞と細胞相互作用の役割を疑問視するためにレーザーアブレーションを使用する。しかし、この手順は、細胞や組織を正確にアブレートする必要がある他の多くの質問に簡単に適応することができ、潜在的に生物の深部に置かれる可能性があります。

deep-spatially-controlled-volume-ablations-using-two-photon

Research

JoVE Journal

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