共焦点顕微鏡を用いたゼブラフィッシュ幼生における選択的単一ニューロンレーザーアブレーション

脊髄運動ニューロンで蛍光タンパク質を発現する麻酔したトランスジェニックゼブラフィッシュ幼虫を含む予熱したアガロース溶液を取ります。

幼虫をアガロースリング付きのガラス皿に移します。

顕微鏡を使用して、幼虫を横向きにします。次に、アガロースを固化させ、幼虫を固定します。

麻酔を維持するために麻酔薬を含むバッファーを追加します。

皿を共焦点顕微鏡ステージに置き、明視野イメージングを使用して背側脊髄領域を特定します。

蛍光モードに切り替えて、蛍光運動ニューロンを視覚化します。

細胞体細胞の中心 Z 面を決定して、正確なアブレーション ターゲティングを行います。

光損傷を最小限に抑えながら、高解像度取得のためのイメージング パラメータを設定します。

目的の z 平面に焦点が合ったら、集束紫外レーザーを使用してターゲット ニューロン領域のアブレーションを実行します。

レーザーエネルギーは細胞構造を破壊し、蛍光の喪失と細胞死を引き起こします。不可逆的な蛍光損失により、周囲の細胞に影響を与えることなく正確なアブレーションが確認されます。

調整可能なピペットを使用して幼虫を引き上げ、先端の底まで沈めます。幼虫を予熱したアガロースに最小限の液体で落とし、次にアガロースで魚を引き上げ、事前に準備したガラス底の35ミリメートルの皿にすばやく分配します。解剖顕微鏡下で、標準的な絵筆を使用して、動物または複数の動物をアガロース内の側面に配置し、体と尾が平らになるようにします。

アガロースがしっかりと固まるまで、埋め込まれた魚を10〜15分間放置します。次に、トリカネを入れた約2ミリリットルの卵水を使用して、35ミリメートルのシャーレを慎重に補充します。幼虫が埋め込まれたシャーレを共焦点顕微鏡ステージに置き、明視野照明と40倍の倍率を使用して、動物の脊髄の背側に焦点を合わせます。適切な蛍光設定に切り替え、目的の構造を視覚化して、すべてのイメージングパラメータがその後のアブレーションに必要なものであることを確認します。

UVレーザーアブレーションの構造の厚さを決定するには、Zドライブを使用して、手動で上下に焦点を合わせて、目的の構造の上部と下部を確認します。アブレーションされるZ平面(セルの中心など)を手動で記録します。レーザーアブレーションを実行するには、ソフトウェアメニューの上部にあるドロップダウンメニューをクリックしてFRAPウィザードを開始します。

新しいウィンドウから、フォーマット、スキャン速度、平均化を選択して、アブレーションアプローチの画像パラメータを決定します。アブレーション用のZ面がまだ選択されていない場合は、ライブボタンを押して、蛍光構造、またはアブレーションする目的のZ面に焦点が合うまで、標本を通して焦点を合わせます。一般的な画像パラメータを設定したら、漂白ステップにアクセスして特定のアブレーション成分を制御し、漂白手順のために405ナノメートルレーザーをアクティブにして作動させます。

次に、ズームインオプションを使用して、スキャンフィールドを縮小することで選択したROIでの漂白強度を最大化し、滞留時間を最大化します。画像取得ウィンドウの描画ツールのいずれかを使用して、アブレーションの ROI を 1 つまたは複数選択します。たとえば、約4〜8マイクロメートルの円形描画ツールを使用して、軸索の丘をターゲットにします。

ROIを設定したら、タイムコースボタンを選択し、ROIがスキャンおよびアブレーションされるサイクル数を確認します。漂白前のフレームと漂白後のフレームを必要に応じて選択して、漂白プロセスの直前と直後の画像全体の概要を把握できます。

これらの設定により、研究者は複数の層を洗練できます。レーザー出力、スキャン速度、ライン平均化、関心領域のサイズ、および繰り返しの調整により、この技術は個々の細胞にストレスや死を引き起こす高い自由度を提供します。

必要なアブレーションパラメータをすべて確立したら、実験の実行を押して、アブレーションの効率を監視します。詳細については、テキストプロトコルを参照してください。