パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

遺伝学研究は、ヒトゲノム配列の公開から大きな恩恵を受けています。パイロシーケンシングは、遺伝的変異だけでなく、RNA対立遺伝子の不均衡、DNA、メチル化状態、遺伝子コピー数の解析を可能にする独自のシステムです。このビデオでは、遺伝子解析のための基本的なパイロシーケンシング反応を示します。

こんにちは、ワシントン大学医学部内科のチャールズ・イービー博士とブライアン・ゲージ博士の研究室のクリスティー・キングです。今日は、パイロシーケンシングの手順をお見せします。この手順は、SNPの分析に使用される最も徹底的かつ簡単な方法の1つであるため、便利です。

ピロシーケンシングは、合成によるシーケンシングに基づいており、ヌクレオチドがオープンな3つのプライムDNA鎖に組み込まれるたびにピロリン酸が放出されることを利用します。プレートがロードされると、ヌクレオチドはソフトウェアによって提供される配列に基づいて組み込まれます 放出されると、ピロリン酸は反応に使用され、TPが放出されます。TPはルシフェラーゼによってルシファーをオキシルシファーに変換し、光の放出をもたらします。入射した光はCCDカメラによって収集され、パイロとも呼ばれるピークとして記録されます。

DNA鎖に取り込まれていないヌクレオチドは、バックグラウンドノイズを防ぐためにAPピラによって分解されます。この手順には、次の手順が含まれます。アッセイデザイン、品質管理のためのPCRゲル電気泳動、およびパイロシーケンシング。

それでは、パイロシーケンシングを始めましょう。パイロシーケンシングを行うためには、まずPCR産物を調製する必要があります。パイロシーケンシング用のPCRは、すべてのプライマーが約50サイクル使い果たされるようにするために、ほとんどのPCRよりも多くのサイクルを必要とします。

また、Pyroシーケンシングでは、PCRプライマーの1つがビオチン化されていることも必要です。最後に、内部プライマーも必要であることに注意することが重要です。効率的なアッセイ設計は、パイロシーケンシングを通じて提供されるソフトウェアを使用して実施し、汚染が存在しないことを確認することができます。

また、PCR産物が存在することを確認するためには、いくつかのサンプルとネガティブコントロールにゲルを泳動させる必要があります。パイロシーケンシングプレートを作成するには、12マイクロリットルのパイロシーケンシングプライマーミックスを96ウェルパイロシーケンシングプレートに加えます。これには、43.2マイクロリットルの内部プライマーと1396.8マイクロリットルのひざまずくバッファーの混合物が必要であり、パイロシーケンシングプレートを接着フィルムで覆います。

セットアップが96ウェルPCR製品の各ウェルに50分以上かかる場合は、240マイクロリットルのストレプトアビジンコーティングされた血清速度を含むSROスピードミックスの70マイクロリットルを追加します。トリス塩化ナトリウム、EDTAおよびトゥイーン20および3、600マイクロリットルの水でできている結合緩衝液の4、560マイクロリットルを追加し、蓋をしっかりと交換します。ビーズミックスを入れた96ウェルPCR産物プレートをプレートシェーカーに室温で5分間置きます。

ウェル間の相互汚染を防ぐために、蓋がしっかりと固定されていることを確認してください。このステップにより、連鎖球菌ENCを徹底的にひざまずかせ、PCRプライマーにあるビオチンタグにコーティングされたスフェロビーズをひざまずかせることができます。プレートを準備するためのワークステーションをセットアップします。

これには、試薬トラフ、PCR産物とビーズミックストレイ、パイロシーケンシングプライマートレイが含まれます。PCR産物とビーズミックスプレート、およびパイロシーケンシングプライマートレイが、ネガティブが同じ向きになるように適切に位置合わせされていることを確認してください。サンプルを移す前に、真空ツールを振ってください。真空ツールは、きれいな水でオフにして、その上にある可能性のあるビーズや破片を放出します。

残りの水を捨て、トラフを補充し、掃除機をオンにします。バキュームツールをトラフに入れたままにして、すべての水が取り除かれるまで(約30秒)待ちます。真空ツールのフィルターチップをPCRビーズミックスプレートのウェルに入れ、プレートからすべての液体が除去されるまでそのままにしておきます。

表面張力を防ぐために、穏やかなロッキングを使用する場合があります。液体がチューブを通って流れ始めたら、70%エタノールトラフに真空剤を入れます。フィルターチップがエタノールを5秒間吸い上げるのを待ちます。

DNAを一本鎖PCRに変性させる0.2モルの水酸化ナトリウムと洗浄バッファーについても繰り返します。PCR産物を洗浄し、中和するため。バキュームホースをバキュームツールから外し、バキュームツールを、ひざまずくバッファーミックスのパイロシーケンシングプライマーを含むパイロシーケンシングプレートに入れます。

バキュームホースが接続されたままの場合、パイロシーケンシングプレートに入れると、プライマーミックスが吸い込まれます。PCR製品を紛失する原因となるヒント。パイロシーケンシングプレートのウェルで真空の先端を静かに振るか揺さぶって、PCR産物を分散させます。

振とうまたは揺さぶられたら、パイロシーケンシングプレートからバキュームツールを取り外し、バキュームツールをホースに再接続し、ツールをきれいな水に入れて次のプレートのために洗浄します。Pyroシーケンシングプレートをヒートブロック上に80°Cで2分間置きます。2分後、プレートをヒートブロックから取り出し、涼しい面に置きます。

冷却すると、粘着フィルムを使用してプレートを覆うことができますが、プレートが蒸発を防ぐために15分以内に実行されない限り。そして今、パイロシーケンシングを始める時が来ました。パイロシーケンシングの最初のステップは、アッセイの詳細をコンピューターに入力することです。

シンプレックスエントリーの下で、新しいエントリーを選択し、ID名や分析する配列などのアッセイ情報を入力します。これはアッセイ設計ソフトウェアによって提供され、SNPとコントロールベースの周りの配列を提供する品質管理選択ディスペンセーションオーダーを可能にします。最後に、ヒストグラムを選択して、ピグラムがどのように見えるべきかを視覚的に示します。さあ、スニップランに入ります。

「snip runs」タブと「general」タブで、ラン名を入力し、ランの装置パラメータを選択します。Setupタブで、アッセイエントリーを選択し、プレートをクリックしてドラッグします。選択したアッセイをプレートに入力するには、プレート全体を使用する必要はなく、分析のために異なるウェルを不活性化できるだけでなく、同じプレート上で多くの異なるアッセイを実行することができることに注意することが重要です。

[表示] タブをクリックし、を選択します。走る。このページには、分析に必要なヌクレオチド、酵素、および基質の適切な量がリストされています。使用前に、ヌクレオチドまたはキャピラリーと試薬の両方の先端を清掃してください。

先端に水を入れ、先端の上部に圧力を加えて、先端の詰まりがないか確認します。先端の底から水が噴き出さない場合は、空にして数回補充し、水を無理やり通してみてください。または、先端が詰まったままの場合は、先端を超音波処理することもできます。

捨てて新しいヒントを手に入れましょう。酵素と基質は、使用前に水で再懸濁する必要があります。気泡が振られるとチップの詰まりやディスペンスが不安定になる可能性がある場合は、未使用の再懸濁酵素と基質をマイナス20°Cで保存できます。

将来、マイクロフュージチューブ内のキャピラリー分注チップに使用する場合は、ヌクレオチドとteバッファーP 8で1対1の希釈を行います。使用前によく混ぜてください。ヌクレオチドチップと試薬チップに、ソフトウェアが推奨する量に応じて適切な量を充填します。

チップの側面に液体をそっと分注して、気泡がチップにピペッティングされて詰まりするのを防ぎます。ヌクレオチド分注チップに気泡がないか必ず確認してください。気泡がある場合は、気泡が表面化するまでチップの側面を軽くたたくか、清潔なピペットチップで気泡を取り除きます。

カートリッジを充填した後、テストプレートを実行します。カートリッジをパイロシーケンシング装置に、テストプレートを96ウェルプレートプラットフォームに置きます。プレート上に粘着フィルムを貼ることで、試薬とヌクレオチドの分注が見やすくなります。

画面の左側にあるインストゥルメントタブを選択し、[管理]をクリックします。ドロップダウンメニューからインストゥルメントを選択します。[テスト] をクリックすると、警告が表示されます。

テストプレートが装置に配置されていることを確認していただくようお願いします。[OK]をクリックします。完了したら、テストプレートを取り外し、プレートの中央に、4つのヌクレオチド、酵素、および基質を表す6つのウェルの上に液体の点があるはずです。

小さなドットが6つ未満の場合は、詰まりが発生しているため、先端をチェックして詰まりがないか取り除く必要があります。プレートをPyro Sequencing 96ウェルプレートプラットフォームに置きます。すべてのレバーを閉じ、個々のプレートの[実行]をクリックします。

酵素基質をセットアップして実行すると、ヌクレオチドが所定の順序で分注されます。Pyro Sequencerによってランが解析されたら、次はランを調査します。青い井戸は、通過する遺伝子型とパイロを表しています。

オレンジ色の井戸は人間の介入を必要とし、目的の井戸をクリックして予測ヒストグラムを開くことで編集できます。遺伝子型は、合格、不合格、またはチェックされ、遺伝子型自体が適切に変更されます。井戸を編集すると、プレートマップに暗い円が表示されます。

ネガティブコントロールはネガティブとスコア付けする必要があります。ネガティブウェルには非特異的なピークが存在する可能性がありますが、通常は内部プライマーのループが原因です。そこで、ヒトゲノムの多型をpy配列する方法を示しました。

DNA Pyroシーケンシングは、幅広いアプリケーションに適応できるため、他のシーケンシング手順よりも有用です。また、低濃度のDNAや劣化したDNAなど、あらゆるソースからのDNAを処理できる堅牢性も備えています。この手順を行う際には、まず良質でクリーンなPCR製品から始めることを忘れないようにすることが重要です。

各アッセイにネガティブコントロールを含め、すべての試薬が良好であることを確認してください。というわけで、これだけです。ご覧いただきありがとうございます、そしてあなたの実験に頑張ってください。