パイロシーケンシング：正確なジェノタイピングのための簡単​​な方法

ヒトゲノム配列の公開により、遺伝学研究は大きな恩恵を受けてきました。パイロシーケンシングは、遺伝的変異だけでなく、RNAのアレル不均衡、DNAメチル化状態、および遺伝子コピー数を解析できる独自のシステムです。このビデオでは、遺伝子解析のための基本的なパイロシーケンシング反応について実演します。

こんにちは。ワシントン大学医学部内科、Charles Eby博士とBrian Gage博士の研究室のKristy Kingです。本日は、パイロシーケンシングの手順について説明します。この手法は、SNPを分析するための最も徹底的かつ簡便な方法の一つであるため、非常に有用です。

パイロシーケンシングは合成によるシーケンシングに基づいており、オープンな3'末端DNAストランドにヌクレオチドが取り込まれるたびにピロリン酸が放出されることを利用しています。プレートがロードされると、ソフトウェアによって提供される配列に基づいてヌクレオチドが取り込まれます。放出されたピロリン酸は、ATPの放出を伴う反応に利用され、そのATPがルシフェラーゼによってルシフェリンをオキシルシフェリンに変換することで光が放出されます。検出された光はCCDカメラによって収集され、パイロ（pyros）としても知られるピークとして記録されます。

バックグラウンドノイズを防ぐため、DNA鎖に取り込まれなかったヌクレオチドはAP pyraによって分解されます。この手順は、アッセイ設計、品質管理のためのPCRゲル電気泳動、およびパイロシーケンシングの各ステップで構成されます。

それでは、パイロシーケンシングについて解説します。パイロシーケンシングを行うには、まずPCR産物を調製する必要があります。パイロシーケンシング用のPCRでは、すべてのプライマーをほぼ使い切ることを確実にするため、通常のPCRよりも多くのサイクル数（約50サイクル）が必要です。

パイロシーケンシングでは、PCRプライマーのいずれか一方がビオチン化されている必要があります。最後に、内部プライマーも必要であることに留意してください。コンタミネーションが存在しないことを確認するため、パイロシーケンシングで提供されるソフトウェアを用いて効率的なアッセイ設計を行うことができます。

PCR産物が存在することを確認するため、いくつかのサンプルと陰性対照を用いてゲル電気泳動を行う必要があります。パイロシーケンシングプレートを作成するには、96ウェルパイロシーケンシングプレートに12 µLのパイロシーケンシングプライマーミックスを加えます。これには、43.2 µLの内部プライマーと1396.8 µLのアニーリングバッファーの混合液が必要です。パイロシーケンシングプレートを粘着フィルムで覆います。

セットアップに50分以上かかる場合は、96ウェルPCR産物プレートの各ウェルに、240 µLのストレプトアビジンコートSeroBeads、560 µLの結合バッファー（Tris、塩化ナトリウム、EDTA、Tween 20で構成）、および3,600 µLの水を含有するSROスピードミックス70 µLを添加し、蓋をしっかりと閉めます。ビーズミックスが入った96ウェルPCR産物プレートをプレートシェーカーに置き、室温で5分間振盪させます。

ウェル間のクロスコンタミネーションを防ぐため、蓋がしっかりと固定されていることを確認します。このステップにより、strep ENCでコーティングされたspherosビーズが、PCRプライマーにあるビオチンタグに十分に結合します。プレート調製のためのワークステーションを準備します。

これには、試薬トラフ、PCR産物およびビーズ混合用トレイ、ならびにパイロシーケンシングプライマー用トレイが含まれます。PCR産物およびビーズ混合用プレートとパイロシーケンシングプライマー用トレイを正しく配置し、ネガティブが同じ方向を向いていることを確認してください。サンプルを移送する前に、電源を切った状態でバキュームツールを清浄水中で振り、付着している可能性のあるビーズや不純物を除去してください。

残りの水を捨て、トラフに再度満たし、バキュームをオンにします。すべての水が除去されるまで（約30秒間）、バキュームツールをトラフに入れたままにします。バキュームツールのフィルターチップをPCRビーズミックスプレートのウェルに入れ、プレートからすべての液体が除去されるまでそのままにします。

表面張力による影響を防ぐため、緩やかに揺らしても構いません。液体がチューブ内を流れ始めたら、バキュームを70%エタノールの槽に浸します。フィルターチップにエタノールを5秒間吸い込ませてください。

0.2 M 水酸化ナトリウム（DNAを単鎖PCRに脱自然化させる）および洗浄バッファーについても同様の操作を繰り返します。これにより、PCR産物を洗浄および中和します。真空ホースを真空ツールから取り外し、パイロシーケンシングプライマーを含むアニーリングバッファー混合液が入ったパイロシーケンシングプレートに真空ツールを配置します。

真空ホースがまだ接続されている場合、パイロシーケンシングプレートに挿入すると、プライマーミックスが吸引されてしまいます。これにより、チップ内のPCR産物を失うことになります。真空チップをパイロシーケンシングプレートのウェル内で静かに振るか揺らし、PCR産物を分散させてください。

シェーキングまたはロッキングが完了したら、パイロシーケンシングプレートから真空ツールを取り外し、真空ツールをホースに再接続して、次回のプレートに使用できるよう、きれいな水に入れて洗浄します。パイロシーケンシングプレートをヒートブロックに載せ、80 °Cで2分間加熱します。2分後、プレートをヒートブロックから取り出し、冷却面に置きます。

冷却後、プレートを15分以内に分析しない場合は、蒸発を防ぐために粘着フィルムでプレートを覆ってください。これでパイロシーケンシングを開始します。パイロシーケンシングの最初のステップは、アッセイの詳細をコンピュータに入力することです。

simplexエントリで、新規エントリを選択し、ID名および分析する配列を含むアッセイ情報を入力します。この配列はアッセイ設計ソフトウェアによって提供され、品質管理を可能にします。次に、SNP周辺の配列とコントロール塩基を提供する分注順を選択します。最後に、ピコグラムの想定される外観を視覚的に確認するため、ヒストグラムを選択します。これで、SNPランを入力する準備が整いました。

「snip runs」および「general」タブで、ラン名を入力し、そのランに使用するインストゥルメントパラメータを選択します。「setup」タブで、アッセイ項目を選択し、プレート上をクリップしてドラッグします。プレートに任意のアッセイを入力する際、プレート全体を使用する必要はなく、解析から除外したいウェルを無効化できるほか、同一プレート上で多くの異なるアッセイを実行できることに留意してください。

「view」タブをクリックし、「Run」を選択します。このページには、ランに必要なヌクレオチド、酵素、および基質の適切な量が表示されます。ヌクレオチドまたはキャピラリー用チップと試薬用チップの両方を、使用前に洗浄してください。

チップに水を満たし、チップの上端から圧力をかけて、チップに詰まりがないか確認します。チップの先端から水が飛び出さない場合は、水を捨ててから数回満たす動作を繰り返し、水を強制的に通過させます。それでも詰まりが解消されない場合は、チップを超音波処理してください。

チップを廃棄し、新しいものと交換します。酵素と基質は、使用前に水で再懸濁させる必要があります。激しく振ると気泡が生じ、チップの詰まりや分注の不均一を招く可能性があるため、未使用の再懸濁済み酵素および基質は-20°Cで保存してください。

マイクロ遠心チューブ内のキャピラリー分注チップを将来的に使用するため、ヌクレオチドとTEバッファーP8を1:1で希釈します。使用前に十分に混合してください。ソフトウェアで推奨される量に従い、適切な容量のヌクレオチドおよび試薬をチップに充填します。

チップ内に気泡が入り込んで閉塞の原因となるのを防ぐため、液体はチップの壁面に沿ってゆっくりと分注してください。ヌクレオチド分注用チップに気泡がないか必ず確認してください。気泡がある場合は、気泡が表面に浮き上がってくるまでチップの側面を軽く叩くか、清潔なピペットチップで気泡を取り除いてください。

カートリッジの充填後、テストプレートを用いてランを実行します。カートリッジをパイロシーケンサーに設置し、テストプレートを96ウェルプレートプラットフォームに配置します。プレートに粘着フィルムを貼付することで、試薬およびヌクレオチドの分注状況を容易に確認できます。

画面左側の「Instrument」タブを選択し、「Manage」をクリックします。ドロップダウンメニューから対象の装置を選択してください。「Test」をクリックすると、警告が表示されます。

テストプレートが機器にセットされているかを確認するよう求められます。「OK」をクリックしてください。完了後、テストプレートを取り出すと、プレート中央の6つのウェルに、4種類のヌクレオチド、酵素、および基質に対応する液滴が付着しているはずです。

小さなドットが6個未満の場合は、詰まりが発生しているため、チップを確認し、詰まりを除去する必要があります。プレートをパイロシーケンシング96ウェルプレートプラットフォームに設置します。すべてのレバーを閉じ、個別のプレートの「run」をクリックしてください。

ランの設定を行い、酵素、基質、およびヌクレオチドが規定の順序で分注されるようにします。パイロシーケンサーによる解析が完了したら、ランの結果を確認します。青色のウェルは、ジェノタイプとパイロシーケンスの結果が合格であることを示しています。

オレンジ色のウェルは人的介入が必要であり、該当するウェルをクリックして予測ヒストグラムを開くことで編集が可能です。ジェノタイプを「合格（passed）」、「不合格（failed）」、「確認（checked）」としてマークしたり、ジェノタイプ自体を適切に変更したりできます。ウェルが編集されると、プレートマップ上に濃い色の円が表示されます。

陰性コントロールは陰性と判定されるべきです。陰性ウェルに非特異的なピークが現れることがありますが、これは通常、内部プライマーのループ形成によって引き起こされます。以上で、ヒトゲノムにおける多型をpy sequenceする方法について説明しました。

DNAパイロシーケンシングは、幅広いアプリケーションに適応できるため、他のシーケンシング手法よりも有用です。また、低濃度や分解が進んだDNAを含む、あらゆるソースからのDNAを処理できる十分な堅牢性を備えています。この手順を行う際は、良好でクリーンなPCR産物から開始することが重要である点に留意してください。

各アッセイに陰性対照を含め、すべての試薬が適切であることを確認してください。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。