テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ

組織マイクロアレイ(TMA)は、ドナーブロックと呼ばれるホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックから組織コアとして知られる小さな例示的な組織片を単一のパラフィンブロックに組み立てる重要な研究ツールである。テープ法は、直立したコアの周りにブロックを鋳造することによって構築プロセスを反転させる完全手動構築方法であり、したがって、理想的でないドナーブロックと互換性があり、安価で広く入手可能な使い捨てハンドヘルド組織マイクロアレイを使用する。このプロセスの多段階のワークフローは、Lee Wisner氏とBrandon Larsen博士によって実証されます。

TMAブロックを構築する際に覚えておくべき最も重要な概念の1つは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック内の組織が実際には3次元構造であるという事実である。ここでは、この概念を説明するのに役立つアニメーションを開発しました。ここで見ているのは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを描いたアニメーションで、ブロック内のその組織の3次元的性質を示しています。

ブロックの上部に組織が見え、その面積が非常に大きいことがわかります。いわばX線の視力を持ち、ブロックを通して見ることができれば、組織は実際にはそのブロックの奥深くで均一に形作られておらず、まるで海の氷山のように、表面に見えるものは実際には下にあるものを表していないかもしれません。その組織ブロック内には、表面に見えない追加の組織片が存在する可能性があります。

その組織の中心の奥深くに壊死または組織死の領域があるかもしれません。病理学者は、その組織ブロックの上部にある2次元セクションを実際にレビューし、そのスライドに注釈を付けて、関心のある組織を含む領域を示し、壊死または実際には関心のない他のタイプの組織を除外する必要があります。組織の適切なコアサンプリングを容易にするために、病理学者は3つのことをするべきである。

まず、スライドマーキングペンを使用して、病理学者はスライド上の関心のある組織にマークを付け、他の組織を避けることができます。第二に、その関心領域内に避けるべき領域がある場合、病理学者は同じマーキングペンを使用して、サンプリングすべきではない領域を消し去ることができる。そして最後に、好ましくは異なる色のペンを使用して、病理学者は、コアサンプリングおよびTMA構築のための関心領域内で理想的な領域をマークすべきである。

このプロセスが完了すると、コアサンプルが得られた場所からより深く組織組成が変化する可能性があり、アニメーションでこれを示すと、コアの位置によってそのコアの組成が決定され、組織の深さとそのブロック内に存在するものによって異なることに留意することが重要です。たとえば、ここで説明している最初のコアは、上半分の組織の一部をキャプチャしていますが、ブロック内のより深い部分には、そのコアが取得される場所に存在する組織がもはや存在しないため、パラフィンワックスのみがサンプリングされています。ここで示した 2 番目のコアは、その場所のブロックの深さ全体にわたって組織が存在するため、その全長に沿って組織をキャプチャしています。

第3のコアは、組織の一部を捕捉し、次いで、組織が存在しない中央にパラフィンワックスの一部を捕捉し、次いで、そのブロックの底部に組織があったその底端にもう少し組織を捕捉した。病理レビューが完了したら、TMA構築に使用するドナーブロックの最終リストを作成し、TMAマップを作成します。TMAマップは、完成したTMAおよび結果のTMAから切り取られたスライドマウント組織切片のコアがどこに位置するかを概説する概略図である。

方向付けの目的で、TMA マップが 3 x 3 または 4 x 4 の行列などの偶数行列にコアを配置しないようにし、少なくとも 1 つの方向マーカーを含むようにします。テープ方式は、溶融ワックスを逆芯材の周囲に流し込むことにより、施工工程を反転させるため、TMAマップの鏡像である施工マップと呼ばれる第2のマップの作成が必要となる。建設マップには、完成した TMA の正しい位置に表示されるように、建設中に各コアを配置する必要がある場所が示されます。

マップを作成したら、金属製のTMAベースモールドを準備します。コアの配置をガイドするには、使い捨ての用紙市松模様のグリッドを使用します。紙の市松模様のグリッドをサイズに合わせてカットし、グリッドの背面に両面テープを貼り付けます。

グリッドとテープを金属製のトレイに置き、グリッドの上に2枚目の両面テープを追加します。病理学的にレビューされたH&EスライドをパンチングするFFPE組織ブロックに重ね合わせ、病理学者のマーキングを使用して組織ブロックをパンチする場所を特定します。使い捨てまたは再利用可能なハンドヘルド手動コアパンチを使用して、FFPEドナーブロックを適切な領域にパンチします。

再利用可能なコアパンチを使用する場合は、各ティッシュパンチの前後にクリーニングされていることを確認してください。コアパンチからコアを取り出します。ニードルピックを使用して、取り出したコアを両面テープで覆われたグリッドの十字線に配置します。

コアの組織端がテープに接触し、建設マップで示されている正しい位置にあるように、コアが反転して直立した状態で配置されていることを確認します。すべてのドナーブロックがコアリングされ、コアが適切な位置に配置されるまで繰り返します。すべてのコアが所定の位置に収まったら、プラスチック製のカセットにラベルを付け、コアが入っている金属製のベースの上に置きます。

カセットを所定の位置に収めると、背の高いコアが傾いたり倒れたりするため、コアの高さは金属トレイの深さを超えてはなりません。溶けたパラフィンをカセットを通してコアのトレイに静かに注ぎます。溶融パラフィンがオーバーフローして、TMAの本体に気泡がないことを確認します。

パラフィンがカセットの上部に充填され、カセットが埋め込まれ、固化したらパラフィンブロックにしっかりと結合するようにします。ブロックを室温で30分間冷却し、この間ブロックを動かさないでください。ブロックを摂氏4度でさらに30分間冷蔵し、完全に固化させます。

完全にセットされたら、メタルベースモールドを慎重に分離し、パラフィンブロックから両面テープを取り外します。TMA が構築されたら、ミクロトームを使用して新しい TMA を切断します。ブロックが適切に直面したら、フルフェイスの組織切片を収集します。

切片を予め温めた水浴に移し、組織切片をスライドマウントする。乾燥したら、H&E染色および必要な追加の免疫組織化学染色のために代表的な切片を提出してください。染色されたTMA切片を病理学的レビューのために提出する。

TMA検証のために、病理学者はTMAブロックからのH&Eスライドをレビューし、顕微鏡下で各円形スポットをレビューして、関心のある組織が存在するかどうかを確認する必要があります。構築プロセスの重要な要素は、TMAコアが得られるべき所与のドナーブロックにおける関心のある組織の同定である。この図の最初の列は、病理学者のマーキングを有する例示的なドナーH&Eを示す。

2番目の列は、H&E染色された組織のパンチングされた領域を示す。3番目の列は、1列目と2列に示した領域のドナーブロックから採取したTMAコアのH&E染色組織を示しています。病理学者は、一致したドナーブロックとTMAコアH&Eを一緒に表示して、関心領域が収集されたこと、および組織組成が同じであることを検証できます。

テープ方式による TMA の正常な完了には、2 つの主要なメトリックがあります。第1は、目視検査によって評価される、互いに離れた予想される位置および距離における組織コアドットの存在である。AとBに示す画像は、正常に完了した2つのテープ方式TMAと、対応するH&Eスライドを示しています。

これらのTMAブロックの目視検査は、コアが各TMAおよびそれらに対応するセクションに存在し、規則的に間隔を置いていることを示している。テープ工法構築プロセス中に生じ得る主要な構造上の問題のいくつかは、画像Cに示すように、凝固前に金属ベースの早期除去によるブロックおよびカセットの分離を含み、画像Dに示すように、埋め込まれたコアの転倒および/または配置ドリフトは、溶融パラフィンの過度に乱流の注ぎ込み中に起こり得る。 これは、接着力の乏しい両面スティックテープによって悪化する可能性がある。この図は、例示的なTMAである各コアについてのH&E染色を示す。

コアスポットの1つを除いてすべてがH&Eに存在します。この図はまた、コアの一部が完全な円形組織ドットとして存在し、他のコアが完全には存在しないことを示している。このような組織喪失は珍しくなく、すべてのコアを完全に明らかにするには、対向するブロックが不十分であることが原因である可能性があります。

あるいは、組織の不完全または完全な欠如の存在は、そのコアの組織品質の低下に起因する可能性があり、これは染色プロセス中に組織損失をもたらし得る。この次の図では、TMAをさらに検証するために、TMA切片に対して免疫組織化学およびRNA ISH染色を行った。ここに示すように、TMAを構築するために使用される組織に応じて様々な染色剤を使用することができる。

ビメンチンは品質管理として使用されます。U6はRNA品質の指標である。EBER は、EBV 状況を判別するために使用されます。

CD20とは、B細胞の存在を示すB細胞マーカーである。これらは、TMAの検証に役立ついくつかの汚れです。このビデオを見た後、テープ法を使用して組織マイクロアレイを作成する方法と、TMAが時間とリソースを節約する重要な研究ツールである理由を理解する必要があります。

また、TMA構築は理想的なプロセスではなく、継続的な病理学的指導とレビューは、建設プロセス中だけでなく、関心のある組織が実際にTMAセクションに存在することを確認するためにTMAセクションで実施される免疫組織化学的研究にとっても重要な要素であることを理解する必要があります。