Name: テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-10T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 学ぶテープ法による組織マイクロアレイの手動構築法。FFPEドナーブロックから組織コアを採取し、パラフィン包埋して複数検体を同時解析する技術を解説。病理医との連携と三次元組織構造の理解が正確なサンプリングに不可欠です。

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この研究のための資金は、NIHが資金提供するAIDS and Cancer Specimen Resource(ACSR)バイオリポジトリ(www.acsr1.com)、UM1CA181255によって提供された。

すべてのドナーブロックは、収集中に非同定され、承認されたメイヨークリニックIRBプロトコル(PR16-000507およびPR2207-02)に準拠してTMA構築に使用された。
1. 病理学的レビュー
<ol><li>TMA構築に使用するFFPE組織ドナーブロックを取得する。</li>
	<li>新たに生成されたヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)染色スライド13 を、ボード認定病理学者による組織学的レビューのために選択された各FFPE組織ドナーブロックについて提出し、診断を確認し、組織に注釈を付ける。 注:H&E染色は、このプロトコルの場合と同様に、社内で実施することも、染色のために病理学的コアサービスラボに送ることもできます。TMAを構築する際に覚えておくべき最も重要な概念の1つは、FFPEドナーブロック内の組織が3次元(3D)構造であり、その形状、腫瘍含有量、および組織生存率は、ブロック深さの増加とともに大きく変化する可能性があることである。病理学者は、3D組織の2次元表現であるH&E染色組織切片のレビューに基づいて、組織コアを抽出するのに最適な領域を決定する必要があります。</li>
	<li>組織学的レビュー中は、病理学者がH&E染色スライド上の関心のある組織または関心のない組織を特定し、注釈を付けるようにしてください。スライドに注釈を付けるには、次の手順に従います。<ol>
<li>スライドマーキングペンを使用して、目的の組織を丸で囲みます。</li>
		<li>同じマーキングペンを使用して、丸で囲まれた領域内の避けるべき領域を消し取ります。</li>
		<li>マーキングペンを使用して、コアのサンプリングと抽出に最適と考えられる領域にマークを付けます。 注:組織の形状と組成は、ブロック内の組織の深さによって変化する可能性があることを覚えておくことが重要です。したがって、組織コアの組成は、コアが抽出された場所に応じて変化する可能性があり、これは継続的な病理学的指導の必要性を強調する。</li>
		<li>必要に応じて、病理学的レビューを支援するために、H&Esと一緒に疾患特異的免疫組織化学染色のための追加の組織を提出してください。このような染色剤の例には、HER2陽性乳癌14に対するERBB2染色、カポジ肉腫15に対するHHV−8、B細胞リンパ腫16に対するCD20、RNA品質のためのグローバルマーカーとしてのU617、エプスタイン−バーウイルス陽性を決定するためのEBER18、および間葉起源および組織品質管理マーカー19、20の確認としてのビメンチンが含まれる。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. TMA建設の準備
<ol><li>病理レビューが完了したら、TMA構築に使用するドナーブロックの最終リストを作成し、TMAマップを作成します(図1A)。TMAマップは、完成したTMAおよび結果のTMAから得られたスライドマウント組織サンプルのコアがどこに位置するかを概説する概略図である。</li>
	<li>方向を示すために、TMA マップが 3 x 3 または 4 x 4 行列などの偶数行列にコアを配置しないようにし、少なくとも 1 つの方向マーカーを含むようにします。 注:配向コアは、組織フリーカラー配向ツール21から採取されたコア、またはTMAのテーマから明確に異なる組織を含む組織ブロックであり得る。直立コアをプレキャストワックス型に挿入するレシピエント法とは異なり、テープ法は、逆立てた直立コアの周りに溶融ワックスを流し込むことによってTMAを作成します。この建設プロセスの逆転には、建設マップと呼ばれる 2 番目のマップが必要です。</li>
	<li>TMA マップのミラー イメージを作成して、建設マップを作成します (図 1B)。建設マップには、完成したTMAの正しい位置に表示するために、建設中に各コアを配置する必要がある場所が示されています。建設マップを保存します。</li>
	<li>マップを作成したら、金属製のTMAベースモールドを準備します。使い捨ての紙市松模様のグリッドを使用して、コアの配置をガイドし、コアの分離を調整します。 メモ: 内部寸法が 26 mm x 20 mm の市販のメタルベース金型で使用するための、最大 40 コア (および 2 つの配向コア/ギャップ) 用の 6 x 7 (42 スポット) テンプレートグリッドは、補足 pdf に記載されています。用紙グリッドを印刷して切り取ります。</li>
	<li>市松模様のグリッドをサイズに合わせてカットし、両面スティックテープ(DSST)をグリッドの背面に貼り付けます。グリッドとDSSTテープを金属トレイに置き、グリッドの上、つまり金属ベースモールドの紙グリッドの上に2枚目のDSSTを追加します(図2A)。</li>
</ol>3. コアの配置
<ol><li>病理学的にレビューされたH&Eを対応する組織ブロックに重ね合わせ、病理学者のマーキングを使用して組織ブロックをパンチする場所を特定します(図2B)。</li>
	<li>FFPEドナーブロックを手動コアパンチ(図2C)を使用して適切な場所にパンチします。 注:コアパンチは、さまざまな直径で入手可能です。この方法は、直径2mmのハンドヘルドコアパンチを採用しています。<ol>
<li>再利用可能なコアパンチを使用する場合は、各ティッシュパンチの前後にクリーニングされていることを確認してください。</li>
	</ol>
</li>
	<li>コアパンチからコアを取り出し、ニードルピックを使用して、イジェクトしたコアをDSSTで覆われたグリッドの十字線に配置します(図2D)。コアをグリッド上に配置するときは、コアの組織端がDSST(組織フェースダウン)に接触するように反転して直立していることを確認してください。また、コアが建設マップで示されているようにグリッド上の適切な位置に配置されていることを確認します。</li>
	<li>すべてのドナーブロックがコアリングされ、コアが適切な位置に配置されるまで繰り返します。</li>
</ol>4. TMAの完了
<ol><li>ベンチトップオーブンの電源を入れ、78°Cに設定し、温度に達するのに十分な時間待ちます。</li>
	<li>構築するTMAごとに、45gのパラフィンペレットをオーブン耐性容器に溶かします。</li>
	<li>プラスチックカセットにラベルを付け、コアが入った金属製のベースモールドの上に置きます(図2E)。カセットを所定の位置に収めると、背の高いコアが傾いたり倒れたりするため、コアの高さは金属トレイの深さを超えてはなりません。</li>
	<li>カセットの入った金型をトレイの上に置き、オーバーフローをキャッチし、溶けたパラフィンをカセットを通してコアのトレイに静かに注ぎます(図2F)。</li>
	<li>溶融パラフィンがオーバーフローするのを許して、TMAの体内に気泡がないことを確認します。パラフィンが固化したら、パラフィンが埋め込まれ、パラフィンブロックにしっかりと結合されるように、パラフィンがカセットの上部に充填されていることを確認します。</li>
	<li>ブロックを動かしたり邪魔したりせず、室温で30分間冷却してください。その後、4°Cでさらに30分間冷蔵し、完全に固化させた。</li>
	<li>完全に固化したら、金属ベースモールドをコアのカセット結合パラフィンブロックから静かに分離する。 注:DSSTは、建設プロセスを通じて接着性を保持し、新しく形成されたパラフィンブロックに頻繁に取り付けられます。該当する場合は、DSST とグリッドを、完了した TMA ブロックの上部から慎重に取り外します。</li>
</ol>5. TMA の検証
<ol><li>TMAが構築されたら、ミクロトームを使用して新しく完成したTMAを切断します。1つ以上のフルフェース組織切片を切断する。</li>
	<li>セクションを温められたウォーターバスに移し、セクションをスライドマウントします。 注:新しく構築されたブロックは、多くの場合、すべてのコアを含むフルフェース組織切片を得るために、ブロックフェーシング(余分なパラフィンの切り取り)を必要とします。</li>
	<li>乾燥したら、H&E染色13 および必要に応じて追加の免疫組織化学染色のために、新しく切断されたスライドマウントTMAセクションを提出してください。</li>
	<li>染色されたTMA H&E切片を病理学的レビューのために提出する。 注:TMA病理学レビュー中、ボード認定病理学者、好ましくはTMAドナーブロックをレビューしたのと同じ病理学者がTMA H&E染色コアをレビューし、目的の組織が実際に存在することを確認する。ステップ1.3.4で追加の組織または疾患特異的免疫組織化学染色剤がドナーブロックレビューのために提出された場合、これらの染色剤をTMA切片上で繰り返し、病理学的レビューのためにTMA H&Eと共に提出すべきである。</li>
	<li>TMA病理学的検証レビューの結果を記録する。</li>
</ol>

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</ol>

開示するものは何もありません。

TMA構築プロセスの最も重要な構成要素の1つは、TMAコアが得られるFFPEドナーブロックの病理学的レビューである4。レビュー中、理事会認定の病理学者が、各ドナーブロックからの代表的なH&E染色組織切片を検査する。H&Eは、対応するドナーブロックの最良の表現であるように、新しく切断された組織切片を使用して生成されることが不可欠です。FFPE組織がブロック深さと広範な切片化によって組織プロファイルが大きく変化する可能性がある3次元構造であることを考えると、古いH&Esの使用は推奨されません。これは、H&Eが生成されてから発生した可能性があり、FFPEブロックの表現が不正確になる可能性があります。レビュープロセスは、適切な症例の選択、コアを取得するべき組織領域の同定、ならびにコアを収集する際に避けるべき領域の特定に不可欠である。病理学的レビューがない場合、不適切な組織を含む確率は有意に増加する。このような組織を含めることは、構築されたTMAをその意図された目的に無効かつ不適当にする可能性がある。重要なことに、このような効果のないTMAを無意識のうちに使用すると、虚偽で誤解を招くデータにつながる可能性が非常に高くなります。これは、FFPE組織のプロファイル、したがってそれらの誘導体コアが深さの増加とともに著しく変化する可能性があるという知識と相まって、構築されたTMAブロックの生涯を通じて病理学レビューを継続することの重要性を強調する。理想的には、H&Esは15番目 または20番目の セクションごとに生成して、コアの組織プロファイルの変化を確実にキャプチャして記録する必要があります。少なくとも、H&Eはプロジェクトの開始時と終了時に生成およびレビューされ、これらの潜在的な変更を監視する必要があります。これらの点と研究ツールとしてのTMAの重要性に照らして、病理学的レビューがTMA構築プロセスおよびTMAブロックの寿命を通してしっかりと組み込まれていることが不可欠です。
FFPEブロックは、研究目的でリリースされる前に、日常的な診断処理中に広範囲に分割されることがよくあります。その結果、ドナーブロック深さ、したがってドナーブロックコア長は、しばしば4mmの理想的なレシピエント法よりも小さい。ここでは、テープ法構築プロトコルを使用してTMAを構築する方法を示しましたが、その主な利点は、理想的でないFFPE組織ブロックのコアとの互換性です。テープ法は大きな研究価値があり、TMAブロックを構築するための安価で便利でアクセス可能な方法を提供しますが、その課題と限界がないわけではありません。1 つの TMA ブロックに 100 ~ 1,000 個のコアを収容できる自動受信方式と手動受信方式の両方と比較して、テープ方式9 を使用して構築された TMA には最大 40 コアを推奨します。別の制限は、建設の容易さに関するものである。レシピエント方式では、パンチングされたコアはプレキャスト型に挿入されるだけで、各コアを個々のウェルに包み込むことでコアの安定性が得られ、コアのマイグレーションを防止し、規則性の高いコアの配置と分離22を促進する。さらに、受信者メソッドは、完全に手動、半手動、および完全に自動化されるというオプションの利便性を提供します。対照的に、手動テープ法は、ニードルピックを使用して手で各コアを慎重かつ穏やかに配置する必要があります。テープ法にプレキャスト金型がないため、レシピエント法で経験される非常に規則的な配置と分離が妨げられますが、この欠陥は市松模様のグリッドを含めることによって克服されます。ブロックエッジの配置を避けるために、市松模様のグリッドを金属トレイの中央に貼り付けることが重要ですが、コアを所定の位置に保持するパラフィンが不足している場合、コア損失のリスクが高まります。また、レシピエント方式で可能な小さなコア分離は、手動コア配置とニードルピックが隣接するコア間に収まる必要があるため、テープ方式では達成できないことにも注意する必要があります。コアは、DSSTで覆われたグリッドに接触するコアの表面積またはフットプリントが最小で、自立した直立した方法で配置されます。このセットアップは、レシピエント法よりもコアの安定性が大幅に低く、溶融パラフィンを注ぐときにコアの転倒や移行のリスクが高まります。実際、プロトコルの最も重要なステップの1つは、溶融パラフィンを注ぐことです。パラフィンが完全に液体であることを確認し、注ぎが最小限の乱流で穏やかに行われることを保証するために、オーブンから取り出したときにこれを迅速に行うことが不可欠です。興味深いことに、Chenらは、レシピエントブロックを作成するときおよびドナーブロックコア23を挿入するときに針を導くためにブランクパラフィンブロックの上に置かれた、直径2mmの穴が均等に分布した7 x 11のステンシルに似た、非常に斬新な補助装置を開発しました。このような装置は、レシピエントブロックの構築を支援するように設計されているが、テープ方式に容易に適合させて、配置をガイドし、分離を調整し、建設プロセス中のコアの安定性を高めることができる。
コア安定性の最も重要な効果の1つは、テープ方式TMAに含まれるコアの数である。これは、コアの数が増えるにつれて、増加するコア数に対応するためにコアの直径を小さくする必要があり、その結果、DSSTに付着するコアフットプリントが減少するためです。テープ法TMA構造では、直径の小さいコアは特に不安定で、非常に穏やかなパラフィンを注いでも転倒しやすいことが分かっているので、最小コア直径1mmが推奨されます。16 G針(コア直径1.1 mm)と直径4 mmのパンチを使用した2つの異なる社内方法を調査した最近の研究では、1.1 mm(26.5%)でかなりの組織損失が発生しましたが、4 mmコアでは発生しませんでした24。これは、小さなコアが建設中だけでなく、作業に問題があることを示しているようです。さらに、直径が小さいほど元のドナーブロックや大きなコアを表さない可能性があり、病理学的解釈が困難になり、ドナー組織表現が不正確になる可能性が高くなります。
オリエンテーションブロックの包含と配置は、TMA構造において非常に重要です。しかし、これはテープ方式で構築されたTMAにとって特に重要です。これは、テープ方式が建設プロセスを反転させ、それによって空間的見当識障害のリスクが高まるという事実に由来します。各ブロックに最大3つの向きのコアを含め、ブロックの向きを最適にするためにサンプルコアから離れて配置することをお勧めします。配向コアは、構築されたTMAまたは組織フリーカラー配向ツール21のテーマから明確に異なる組織を含む組織ブロックから採取されたコアとすることができ、ここで、後者は、非病理学者にとって特に有用である。非規則的なマトリックスパターンのコア配置と組み合わせることで、オリエンテーションコアは見当識障害のリスクを最小限に抑えます。
テープ法とレシピエント法を用いて構築されたTMA間のコア長の顕著な違いは、構築方法を選択する際の意思決定プロセスにドナーブロック深さを含めることに起因する。ここで概説するプロトコルは、ドナーブロックの深さがそれぞれ<4mmおよび4mmの場合に、TMAがテープ法およびレシピエント法を使用して構築される閾値を採用している。建設方法の選択にドナーブロック深さを含めることは普遍的ではないことに注意することが重要です。TMAはドナーブロックの深さに関係なくどちらの方法を使用しても構築することが可能であるが、より高いコアは、テープ法を用いたTMA構築中にプラスチックカセットの配置を妨げたり、転倒または傾斜させたりする可能性がある。意思決定プロセスに基準を含めるか省略するかは、ラボで利用可能なアメニティ、コスト、および所望の最終製品によって異なります。このプロトコルのパラメータの下では、テープ法構築TMAから得ることができるスライドマウントTMAセクションの数は、レシピエント法構築TMAから得られるものよりも有意に少ない。FFPE組織を再ブロックしてドナーブロックの深さを増加させ、レシピエント法と適合させることは可能であるが、リブロック内で同じ組織配向を達成する可能性は低い。次に、これは、フルフェース切片を得るために、広範囲のブロック対向を必要とする場合があり、これはおそらく有意な組織喪失を含むであろう。ブロックを向いた後、テープ法で構築されたTMAは、すべてのコアが存在する約50のスライドマウントTMAセクションを生成します。ただし、正確な数はブロックごとに異なり、TMAの構築に使用されるコアの長さと切断されるセクションの厚さ(5μm対4μm)によって異なります。さらに、コアの長さが異なるため、TMAが徐々に切断されるため、コアは異なる時間に消耗することにも注意する必要があります。継続的な病理学的レビューの必要性を再強調する属性。
受信者方式は、より退屈で迅速な建設プロセスを含む、テープ方式に比べて大きな利点と利点を提供しますが、テープ方式は経験豊富な高スループットラボを対象としていません。これは、平均的な実験室、特に資源が限られている環境にある研究室を対象としており、可変深さのドナーブロックにアクセスできますが、TMA建設サービスにはアクセスできません。しかし、将来のアプリケーションでは、ハイスループットラボで適格なサンプルのプールを強化し、ドナーブロックの再ブロッキングの必要性を排除するために、この方法の自動化が見られる可能性があります。結論として、記載されたTMAテープ法構築プロトコルは、高価な機器を必要とせずに、専門外の研究所で容易に確立することができる。しかしながら、新規使用者は、貴重な組織を用いたTMA構築に進む前に、テープ法技術に慣れるために、価値のないFFPE 組織ブロック、組織フリー着色配向ツール21、または組織のない着色パラフィンブロックを最初に使用すべきであることが推奨される。TMAブロックの構築と使用の両方者が知っておくべき潜在的な落とし穴がないわけではありませんが、この一見洗練されていない「自家製」TMA建設方法は、高品質で生物学的に関連するTMAを研究にもたらすことができます。実際、テープ法で構築されたTMAに由来するTMA切片は、ACSRバイオリポジトリで最も要求の厳しい組織サンプルの1つです。

ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織は、形態学的および免疫組織化学的タンパク質発現研究において広く使用されている1。しかし、発見研究はしばしば多数の組織上のいくつかのマーカーの検査を必要とし、貴重な組織を使い果たす可能性があります。1980年代に導入された組織マイクロアレイ(TMA)は、多くの異なるFFPE組織ブロックから小さな例示的な関心領域を単一のパラフィンブロックに組み立てる重要な研究ツールであり、多くの組織サンプルを同時に検査することを可能にする2。したがって、TMAは、非常に貴重で、しばしば希少な組織サンプルの過度の使用を回避しながら、多くの個々のサンプルで下流アプリケーションを実行することに関連するコストを削減します3,4。
TMAs5の構築には、自動化および半手動アプローチ6,7を含むいくつかの異なる技術が存在する。これらの後者のアプローチの大部分は、ドナーブロックから打ち抜かれた組織コアがプレキャスト型に挿入されるレシピエント法を使用する。しかし、この方法には、少なくとも厚さ4mmの「理想的な」ドナーブロックを使用することが推奨される6,7。残念なことに、ドナーブロック、特に研究のために利用可能になる前に臨床診断目的のために広範囲に切片化されたものは、厚さが4mm未満であることが多く、4mmの深さを達成するための再埋め込みが不可能または望ましくない場合、レシピエント法を用いたTMA構築での使用からそれらを除外する可能性がある。さらに、これらの手順は、多くの場合、ベンチトップの手動組織マイクロアレイまたは高価な自動装置を使用しており、平均的な研究室にとって容易にアクセスできないか、手頃な価格です。対照的に、両面粘着テープ法またはテープ法は、安価で広く入手可能な、再利用可能または使い捨てのハンドヘルド組織マイクロアレイ8、9、10を使用する非理想的なドナーブロックと互換性のある手動TMA構築方法である。この方法は、コアの長さに関係なく、完成時にTMAの上部と同一平面上にある反転直立コアの周りにブロックを鋳造することによって、構築プロセスを反転させる。その結果、すべてのサンプルが最初にセクション化されたときにTMAセクションに存在し、コンストラクタは最初からこれらの非理想的ブロックを最大限に活用することができます。したがって、テープ方式は、専門外の研究所にとって費用対効果が高く、実現可能な代替手段となります。
TMA構築には課題がないわけではなく、コアを抽出する組織領域を選択する際には注意を払わなければならず、病理学的レビューはTMA構築プロセス11,12の重要な部分となっています。したがって、このプロトコルは、TMAを構築して使用する個人が知っておくべきTMA構築に関連する病理学的落とし穴のいくつか、および病理学レビューがTMAブロックの生涯を通じて継続されるべきである理由を強調することによって、TMA構築における病理学的レビューの深遠な重要性を強調することを目的としている。
このプロトコルは、AIDS and Cancer Specimen Resource(ACSR)Technical Core Laboratoryで、テープ法を使用して理想的でないドナーブロックからTMAを構築するために取られたステップを概説しています。ACSRは、HIV悪性腫瘍研究を促進するために、HIV癌組織からの生物標本の収集と公平な配布に特化したNIH資金提供のバイオリポジトリです。

<table><tbody><tr><td>BX51</td>顕微鏡 <td>オリンパス</td><td>BX51</td><td></td></tr><tr><td>cellSensイメージングソフトウェア</td><td>オリンパス</td><td>×</td><td></td></tr><tr><td>コットンボールフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>22-456-880</td><td></td></tr><tr><td>両面テープ(取り外し可能)</td><td>スコッチ</td><td>383534</td><td></td></tr><tr><td>DP72カメラ</td><td>オリンパス</td><td>DP72</td><td></td></tr><tr><td>エコノミーラボオーブンフィ</td><td>ッシャーブランド</td><td>13246516GAQ</td><td></td></tr><tr><td>鉗子</td><td>各種</td><td>x</td><td></td></tr><tr><td>フォーミュラ "R" (パラフィン)</td><td>ライカ</td><td>3801450</td><td></td></tr><tr><td>ガラス顕微鏡スライド</td><td>フィッシャーブランド</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>ロープロファイル ミコトーム ブレード</td><td>アキュ エッジ</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトーム</td><td>ライカ</td><td>RM2265</td><td></td></tr><tr><td>油性マーカー</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>72109-12</td><td></td></tr><tr><td>クイックレイ 手動組織マイクロアレイ セット</td><td>ユニトマ</td><td>UT06</td><td></td></tr><tr><td>ステンレスベース 金型</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22-038-209</td><td></td></tr><tr><td>ティッシュカセット冷却トレイ</td><td>電子顕微鏡 科学</td><td>63314</td><td></td></tr><tr><td>組織処理/埋め込みカセット</td><td>フィッシャーブランド</td><td>15-182-701E</td><td></td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>トライアングルバイオメディカルサイエンス</td><td>TFB-120</td><td></td></tr><tr><td>木スティック</td><td>フィッシャーブランド</td><td>22363158</td><td></td></tr></tbody></table>

テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

組織マイクロアレイ(TMA)は、多くのホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)サンプルを単一のパラフィンブロックで表現できる重要な研究ツールです。これは、異なるドナーFFPEブロックの関心領域から抽出された組織コアを使用し、それらを単一のTMAパラフィンブロックに配置することによって達成される。完成したTMAのセクションは、いったん構築されると、免疫組織化学、発色性、蛍光 in situ ハイブリダイゼーション(FISH)およびRNA ISH研究を実行するために使用でき、多くのサンプルにおけるタンパク質発現ならびにゲノムおよび転写変化を同時に評価し、組織使用を最小限に抑え、試薬コストを削減することができます。TMA構築技術にはいくつかの異なるものがあります。最も一般的な工法の1つは、最小長さ4mmが推奨される同じ長さのコアで最もよく機能する受信者方法である。残念なことに、組織ブロックは診断プロセス中に大きく切除することができ、しばしば4mm未満の「理想的でない」ドナーブロックの厚さをもたらす。現在の記事とビデオは、両面粘着テープ方式に焦点を当てています。これらの理想的でないドナーブロックと高い互換性を持つ低密度(<50コア)TMAを構築するための代替の手動、低コスト、使いやすい、迅速な方法。このプロトコルは、病理学的レビューと建設後の検証の重大な重要性に焦点を当てて、この方法を使用してTMAを構築する方法に関するステップバイステップのガイドを提供します。

ここで説明するTMA構築のテープ法は、ACSRテクニカルコアラボラトリーで組織を保存するために採用されている選択方法であり、これにより、研究者に非常に貴重な組織の倹約的かつ公平な配布が可能になります。
構築プロセスの重要な要素は、TMAコアが得られるべき所与のドナーブロックにおける関心組織の同定である。これは病理学的レビューによって決定され、訓練を受けた病理学者が新しく生成されたH&amp;Eスライドをレビューする(図3)。病理学者はマーカーを使用してH&amp;Eスライド上の領域を円を描き、この円の内側のドナーブロックからコアを取得する必要があることを示している(図3)。病理学者はまた、避けるべき壊死領域、または追加の組織コアが得られる良性領域などの追加の領域をマークしてもよい(図3)。その後、コアは示された領域からパンチされ、TMAの建設に含まれます。
テープ方式による TMA の正常な完了には、2 つの主要なメトリックがあります。第1は、互いに離れた予想される位置および距離に組織コアドットが存在することであり、これは目視検査によって評価される。図4A,Bは、2つの完全テープ方式TMAとそれに対応するH&amp;Eスライドを示しています。TMAブロックの目視検査では、コアが各TMAに存在し、規則的に間隔を置いていることがわかります。テープ工法の建設プロセス中に起こり得る主な構造上の問題のいくつかには、ワックス固化の前に金属ベースを早期に除去することによるブロックとカセットの分離が含まれる(図4C)。テープ方式で構築されたTMAで観察されるもう1つの潜在的な問題は、組み込みコアのコア転倒およびまたは配置ドリフトです(図4D)。溶融パラフィンの過度に乱流の注ぎ込みから生じる可能性のある問題であり、これは接着性の低いDSSTによってさらに強化される可能性がある。図5は、TMA1のコアのH&amp;E画像を示しています。1つのコア(スポット1)を除くすべてがTMA1のH&amp;Eに存在する。図5はまた、いくつかのコアが完全な円形組織ドット(すなわち、スポット4、6、13、17)として存在し、他のコアが完全には存在しない(すなわち、スポット3、8、9、12)ことを示している。これらの後者の症例で経験される組織喪失は珍しくなく、すべてのコアを完全に明らかにするために必要な不十分な切片化に起因する可能性がある。あるいは、不完全の存在、または組織の完全な欠如(すなわち、スポット1)は、そのコアの組織品質の悪さに起因する可能性があり、これは染色プロセス中に組織損失をもたらし得る。
成功の第2の指標は、TMAコアが関心のある組織を捕捉したかどうかに関して評価される。これは、パンチされたドナーブロックH&amp;E(図3)と比較した個々のTMA H&amp;Eコア(図5)の病理学的レビューおよび検証、および必要に応じて他の追加の免疫組織化学染色の実施/実施によって達成される。図6は、ビメンチン、U6、EBER、およびCD20を含むTMA1に対して行われる例示的な染色を描写する。ビメンチン陽性組織(茶色の染色)は、すべての組織が間葉系起源であり、染色することができる良質であることを示す。U6陽性(濃い紫色/青色の染色)は、組織内のRNA品質が良好であり、遺伝子転写産物を標的とするEBERなどのRNAin situハイブリダイゼーション(ISH)染色を補完することを示す。図5のU6結果は、リンパ腫組織(スポット9)および正常扁桃腺組織配向制御(スポット22)ではRNA品質が高いが、スポット19の正常組織ではそうではないことを示している。このEBER染色に続いて、正常組織および配向制御では陰性であったが、リンパ腫組織では強く陽性であった(スポット9)。リンパ系起源の組織について予想されたように、スポット9および22の両方がB細胞マーカーCD20に対して陽性に染色されたが、正常な脊髄組織に由来するスポット19はそうではなかった。すべてのTMAコアの染色結果を表1にまとめ、これらのTMA組織コアの組織注釈を確認します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig01.jpg"> 図 1: TMA マップ すべてのFFPEブロックと方向制御が選択されると、TMAマップ(A)と呼ばれる詳細なマップが作成され、完成したブロック内の各ドナーブロックコアがどこに配置されるかが概説されます。テープ法を用いてTMAを構築する場合、この方法は構築プロセスを反転させ、プレキャスト成形型にコアを挿入するのではなく、直立した組織コアの周りに溶融パラフィンを流し込むため、構築マップ(B)はTMAマップの鏡像であることに注意することが重要です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig02.jpg"> 図 2: テープ方式を使用して TMA を構築します 。(A) 層 2 の両面スティック テープ (DSST) と紙のグリッドを、金属製のベース モールドの底面に次の順序で配置します。DSST の最初の部分 (2A インサート) を配置し、続いて使い捨ての紙グリッドを配置し、次に DSST の 2 枚目の部分を金属ベース金型の底に置きます。(B)各ドナーブロックについて、新鮮なH&amp;Eが生成され、病理学者によってレビューされ、H&amp;Eをマークして目的の組織を示し、ブロックをパンチする場所、および該当する場合は組織コアを抽出するためのパンチングを避ける場所を示す。(C)ドナーブロックを廃棄または再利用可能なハンドヘルドTMAパンチでパンチする。(D)ニードルピックを用いて、各コアを直立させて配置し、腫瘍をグリッドを覆うDSST上に下向きにする。(E) ラベルの付いたプラスチック製のカセットを、直立したコアが入った金属製のトレイの上に慎重に置きます。(F)溶融したパラフィンをカセット格子を通してトレイに静かに注ぎ、カセットの下の直立したコアを囲んで沈める。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig03.jpg"> 図3:ドナーブロックH&amp;E染色剤 各ドナーブロックからのH&amp;E染色切片は、H&amp;E染色されたスライドにマーカーで注釈を付け、コアコレクションのための関心のある領域/組織(すなわち、生存癌(CA)または良性(BN)組織)および避けるべき領域(すなわち、 壊死組織領域)。その後、注釈付きH&amp;Eによって示されるように、組織ブロックの適切な領域が識別され、打ち抜かれ、構築されるTMAに組み込まれる。得られたTMAコアパンチH&amp;Eは、ドナーブロックH&amp;Eのパンチされていない領域に戻って参照して、関心組織がコアパンチに捕捉されたことを確認することができる。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig04.jpg"> 図4:代表的な結果 (A,B)病理学的レビューのためのテープ法TMAおよびそれに付随するH&amp;Eを正常に完了した。(c)カセットが金属ベースモールドから早期に取り外されたときのプラスチックカセットとパラフィンブロックの分離。(d)溶融パラフィンの乱流から生じた転倒および移行したコアを示す完成したテープ法TMA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig05.jpg"> 図5:TMAコアH&amp;Es。 TMA1のH&amp;E染色切片、TMAの構築に使用した各組織コア(スポット1〜21)および配向コア(スポット22および23)の個々のH&amp;Eを示す。示された画像は、イメージングソフトウェアに接続されたデジタルカメラを備えた4倍の対物レンズを使用して得られた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63086/63086fig06.jpg"> 図6:例示的な免疫組織化学的およびRNA ISHの例示的な。 TMA1のフルフェイス切片をIHCによりビメンチンおよびCD20発現について評価し、RNA ISHによりEBER ISH を介して RNA品質(U6)およびEBVステータスを評価した。画像は、1つの腫瘍組織(スポット9)、1つの正常組織(スポット19)、ならびに2つの配向制御のうちの1つ(スポット22)を含む3つのコアについての例示的な画像を示す。ビメンチン陽性は褐色染色、U6陽性は青色/紫色染色、EBERは青色/紫色染色、CD20は茶色染色で表されます。示された画像は、イメージングソフトウェアに接続されたデジタルカメラを備えた4倍の対物レンズを使用して得られた。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/63086fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:構築されたTMA組織および染色剤の概要: 表は、(a)組織が代表的なTMAスポットの各々に存在するかどうか、(b)腫瘍が各H&amp;E染色組織スポットに存在するかどうか、および(c)隣接するTMA切片に対して実施された追加の免疫組織学的染色の結果を概説する:"-"は陰性を示し、n/d = 行われていない。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/2021-11-10%20JOVE%20Tape%20TMA%20table%201.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63086/2021-10-11%20Grid%20supplementary.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

このプロトコルは、深さの異なるFFPEドナーブロックを使用して組織マイクロアレイを手動で構築する方法に関するテープ法を概説する。

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

組織マイクロアレイ(TMA)は、ドナーブロックと呼ばれるホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックから組織コアとして知られる小さな例示的な組織片を単一のパラフィンブロックに組み立てる重要な研究ツールである。テープ法は、直立したコアの周りにブロックを鋳造することによって構築プロセスを反転させる完全手動構築方法であり、したがって、理想的でないドナーブロックと互換性があり、安価で広く入手可能な使い捨てハンドヘルド組織マイクロアレイを使用する。このプロセスの多段階のワークフローは、Lee Wisner氏とBrandon Larsen博士によって実証されます。TMAブロックを構築する際に覚えておくべき最も重要な概念の1つは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロック内の組織が実際には3次元構造であるという事実である。ここでは、この概念を説明するのに役立つアニメーションを開発しました。ここで見ているのは、ホルマリン固定パラフィン包埋組織ブロックを描いたアニメーションで、ブロック内のその組織の3次元的性質を示しています。ブロックの上部に組織が見え、その面積が非常に大きいことがわかります。いわばX線の視力を持ち、ブロックを通して見ることができれば、組織は実際にはそのブロックの奥深くで均一に形作られておらず、まるで海の氷山のように、表面に見えるものは実際には下にあるものを表していないかもしれません。その組織ブロック内には、表面に見えない追加の組織片が存在する可能性があります。その組織の中心の奥深くに壊死または組織死の領域があるかもしれません。病理学者は、その組織ブロックの上部にある2次元セクションを実際にレビューし、そのスライドに注釈を付けて、関心のある組織を含む領域を示し、壊死または実際には関心のない他のタイプの組織を除外する必要があります。組織の適切なコアサンプリングを容易にするために、病理学者は3つのことをするべきである。まず、スライドマーキングペンを使用して、病理学者はスライド上の関心のある組織にマークを付け、他の組織を避けることができます。第二に、その関心領域内に避けるべき領域がある場合、病理学者は同じマーキングペンを使用して、サンプリングすべきではない領域を消し去ることができる。そして最後に、好ましくは異なる色のペンを使用して、病理学者は、コアサンプリングおよびTMA構築のための関心領域内で理想的な領域をマークすべきである。このプロセスが完了すると、コアサンプルが得られた場所からより深く組織組成が変化する可能性があり、アニメーションでこれを示すと、コアの位置によってそのコアの組成が決定され、組織の深さとそのブロック内に存在するものによって異なることに留意することが重要です。たとえば、ここで説明している最初のコアは、上半分の組織の一部をキャプチャしていますが、ブロック内のより深い部分には、そのコアが取得される場所に存在する組織がもはや存在しないため、パラフィンワックスのみがサンプリングされています。ここで示した 2 番目のコアは、その場所のブロックの深さ全体にわたって組織が存在するため、その全長に沿って組織をキャプチャしています。第3のコアは、組織の一部を捕捉し、次いで、組織が存在しない中央にパラフィンワックスの一部を捕捉し、次いで、そのブロックの底部に組織があったその底端にもう少し組織を捕捉した。病理レビューが完了したら、TMA構築に使用するドナーブロックの最終リストを作成し、TMAマップを作成します。TMAマップは、完成したTMAおよび結果のTMAから切り取られたスライドマウント組織切片のコアがどこに位置するかを概説する概略図である。方向付けの目的で、TMA マップが 3 x 3 または 4 x 4 の行列などの偶数行列にコアを配置しないようにし、少なくとも 1 つの方向マーカーを含むようにします。テープ方式は、溶融ワックスを逆芯材の周囲に流し込むことにより、施工工程を反転させるため、TMAマップの鏡像である施工マップと呼ばれる第2のマップの作成が必要となる。建設マップには、完成した TMA の正しい位置に表示されるように、建設中に各コアを配置する必要がある場所が示されます。マップを作成したら、金属製のTMAベースモールドを準備します。コアの配置をガイドするには、使い捨ての用紙市松模様のグリッドを使用します。紙の市松模様のグリッドをサイズに合わせてカットし、グリッドの背面に両面テープを貼り付けます。グリッドとテープを金属製のトレイに置き、グリッドの上に2枚目の両面テープを追加します。病理学的にレビューされたH&EスライドをパンチングするFFPE組織ブロックに重ね合わせ、病理学者のマーキングを使用して組織ブロックをパンチする場所を特定します。使い捨てまたは再利用可能なハンドヘルド手動コアパンチを使用して、FFPEドナーブロックを適切な領域にパンチします。再利用可能なコアパンチを使用する場合は、各ティッシュパンチの前後にクリーニングされていることを確認してください。コアパンチからコアを取り出します。ニードルピックを使用して、取り出したコアを両面テープで覆われたグリッドの十字線に配置します。コアの組織端がテープに接触し、建設マップで示されている正しい位置にあるように、コアが反転して直立した状態で配置されていることを確認します。すべてのドナーブロックがコアリングされ、コアが適切な位置に配置されるまで繰り返します。すべてのコアが所定の位置に収まったら、プラスチック製のカセットにラベルを付け、コアが入っている金属製のベースの上に置きます。カセットを所定の位置に収めると、背の高いコアが傾いたり倒れたりするため、コアの高さは金属トレイの深さを超えてはなりません。溶けたパラフィンをカセットを通してコアのトレイに静かに注ぎます。溶融パラフィンがオーバーフローして、TMAの本体に気泡がないことを確認します。パラフィンがカセットの上部に充填され、カセットが埋め込まれ、固化したらパラフィンブロックにしっかりと結合するようにします。ブロックを室温で30分間冷却し、この間ブロックを動かさないでください。ブロックを摂氏4度でさらに30分間冷蔵し、完全に固化させます。完全にセットされたら、メタルベースモールドを慎重に分離し、パラフィンブロックから両面テープを取り外します。TMA が構築されたら、ミクロトームを使用して新しい TMA を切断します。ブロックが適切に直面したら、フルフェイスの組織切片を収集します。切片を予め温めた水浴に移し、組織切片をスライドマウントする。乾燥したら、H&E染色および必要な追加の免疫組織化学染色のために代表的な切片を提出してください。染色されたTMA切片を病理学的レビューのために提出する。TMA検証のために、病理学者はTMAブロックからのH&Eスライドをレビューし、顕微鏡下で各円形スポットをレビューして、関心のある組織が存在するかどうかを確認する必要があります。構築プロセスの重要な要素は、TMAコアが得られるべき所与のドナーブロックにおける関心のある組織の同定である。この図の最初の列は、病理学者のマーキングを有する例示的なドナーH&Eを示す。2番目の列は、H&E染色された組織のパンチングされた領域を示す。3番目の列は、1列目と2列に示した領域のドナーブロックから採取したTMAコアのH&E染色組織を示しています。病理学者は、一致したドナーブロックとTMAコアH&Eを一緒に表示して、関心領域が収集されたこと、および組織組成が同じであることを検証できます。テープ方式による TMA の正常な完了には、2 つの主要なメトリックがあります。第1は、目視検査によって評価される、互いに離れた予想される位置および距離における組織コアドットの存在である。AとBに示す画像は、正常に完了した2つのテープ方式TMAと、対応するH&Eスライドを示しています。これらのTMAブロックの目視検査は、コアが各TMAおよびそれらに対応するセクションに存在し、規則的に間隔を置いていることを示している。テープ工法構築プロセス中に生じ得る主要な構造上の問題のいくつかは、画像Cに示すように、凝固前に金属ベースの早期除去によるブロックおよびカセットの分離を含み、画像Dに示すように、埋め込まれたコアの転倒および/または配置ドリフトは、溶融パラフィンの過度に乱流の注ぎ込み中に起こり得る。 これは、接着力の乏しい両面スティックテープによって悪化する可能性がある。この図は、例示的なTMAである各コアについてのH&E染色を示す。コアスポットの1つを除いてすべてがH&Eに存在します。この図はまた、コアの一部が完全な円形組織ドットとして存在し、他のコアが完全には存在しないことを示している。このような組織喪失は珍しくなく、すべてのコアを完全に明らかにするには、対向するブロックが不十分であることが原因である可能性があります。あるいは、組織の不完全または完全な欠如の存在は、そのコアの組織品質の低下に起因する可能性があり、これは染色プロセス中に組織損失をもたらし得る。この次の図では、TMAをさらに検証するために、TMA切片に対して免疫組織化学およびRNA ISH染色を行った。ここに示すように、TMAを構築するために使用される組織に応じて様々な染色剤を使用することができる。ビメンチンは品質管理として使用されます。U6はRNA品質の指標である。EBER は、EBV 状況を判別するために使用されます。CD20とは、B細胞の存在を示すB細胞マーカーである。これらは、TMAの検証に役立ついくつかの汚れです。このビデオを見た後、テープ法を使用して組織マイクロアレイを作成する方法と、TMAが時間とリソースを節約する重要な研究ツールである理由を理解する必要があります。また、TMA構築は理想的なプロセスではなく、継続的な病理学的指導とレビューは、建設プロセス中だけでなく、関心のある組織が実際にTMAセクションに存在することを確認するためにTMAセクションで実施される免疫組織化学的研究にとっても重要な要素であることを理解する必要があります。

manual-construction-tissue-microarray-using-tape-method-handheld

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

我々は、神経系の発現プロファイリングのためのDNAマイクロアレイの使用例を示します。我々は、RNAの品質管理、サンプルのラベリング、およびアレイハイブリダイゼーションとスキャニングを説明します。...

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ヒトタンパ​​ク質アトラス内の組織マイクロアレイ、免疫組織化学染色とデジタル化の生産

プロトコルは、バイオマーカー研究のための組織マイクロアレイの構築と品質を最適化することを目指しています。それは、計画と設計、デジタル病理学、バーチャルスライドアノテーション、自動化された組織アレイ化の態様を含む。...

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配列断層撮影サンプルとして使用するための大きな転写サポートに関するシリアルセクションのリボンの作成と、走査型電子顕微鏡での自動イメージング手順について説明します。このプロトコルにより、局所的なまれな事象のスクリーニング、検索、および標的画像処理、および大量のデータ量の取得が可能になります。...

走査型電子顕微鏡を用いたボリューム情報の標的取得のためのアレイ断層化ワークフロー

多重化イオンビームイメージング(MIBI)は、組織マイクロアレイやタイル状の連続した組織領域のイメージングによく使用されますが、これらの実験を設定するための現在のソフトウェアは煩雑です。タイル/SED/アレイ・インターフェースは、MIBIランのセットアップを劇的に簡素化し、加速するために開発された、直感的でインタラクティブなグラフィカル・ツールです。...

タイル/SED/アレイインターフェースを用いたマルチプレックスイオンビームイメージング顕微鏡における組織マイクロアレイおよびタイル状領域イメージングの迅速なセットアップ 

私たちは、光学多層干渉断層撮影(OMLIT)という新しいイメージング技術を導入し、脳標本内のすべての細胞をメソスケールで偏りなくイメージングでき、同じサンプル上のテープベースのシリアル走査型電子顕微鏡のイメージングワークフローにシームレスに統合できます。...

走査型電子顕微鏡互換光学イメージング法によるメソスコーピック全細胞脳マッピング

学ぶテープ法による組織マイクロアレイの手動構築法。FFPEドナーブロックから組織コアを採取し、パラフィン包埋して複数検体を同時解析する技術を解説。病理医との連携と三次元組織構造の理解が正確なサンプリングに不可欠です。

テープ法を用いた組織マイクロアレイの手動構築とハンドヘルドマイクロアレーラ

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