Name: 無細胞再構成のための組換えセプチン複合体の精製と品質管理 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 50 s
Description: 学ぶ 組換えセプチン複合体の精製と品質管理プロトコル。Affinity chromatographyを用いて高品質なタンパク質を単離し、細胞分裂と移動におけるセプチンの役割を無細胞系で解明する方法です。

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我々は、質量測光(iSCAT)実験への協力について、セシリア・デ・アグレラ・ピント氏、トマス・デ・ガライ氏、カタリーナ・ホイサーマン氏に感謝する。アリエン・ヤコビとヴィエル・エヴァースがTEMを手伝ってくれた。TIRFへの支援に対するルシア・バルダウフ。パスカル・ヴェルディエ・ピナール ネイティブ電気泳動に関するアドバイス。ショウジョウバエセプチン精製の取り組みの立ち上げを支援してくれたAgata SzubaとMarjolein Vinkenoog、およびフランス国立研究インフラストラクチャフランスバイオイメージング(ANR10-INBS-04)のメンバーであるキュリー研究所の細胞および組織イメージング(PICT-IBiSA)。この研究は、オランダ科学研究機構(NWO / OCW)から「BaSyC-合成細胞の構築」重力助成金(024.003.019)および国立研究開発庁(ANR助成金ANR-17-CE13-0014:「セプティモルフ」;ANR-13-JSV8-0002-01: "SEPTIME";およびANR-20-CE11-0014-01:「セプツコート」)。

著者らは、競合する利益や金銭的利益を宣言していません。

ここで説明する方法は、予め形成されたセプチンヘテロオリゴマーの堅牢な精製および品質管理を可能にする。この方法を正しく適用するために考慮すべき重要な問題のいくつかは次のとおりです。クロマトグラフィー分離の溶出ステップでは、セプチン複合体の希釈を最小限に抑えるために、推奨される(またはそれより低い)流速を使用することが重要です。さらに、最終濃縮ステップ中のタンパク質の回収率を最大化するために、濃縮カラムは、溶液がフィルターに押し付けられないように配向されています(片側にフィルターしかない場合)。溶液がフィルターに直接送られると、タンパク質はフィルターにはるかに付着し、最終収量が大幅に減少します。濃縮ステップが必ずしも必要ではないことを考慮することも重要です。クロマトグラムのピーク付近の狭い範囲からのみフラクションをピックすると、通常、多くの再構成アプリケーション(通常は10〜300 nM)に十分な高いストック濃度(>3,000 nM)が得られます。最後に、蛍光顕微鏡によるセプチン複合体の機能性の品質管理のためには、セプチン複合体がガラスに熱心に付着するため、顕微鏡スライドの表面を正しく不動態化することが重要です。スライドガラスの不動態化は、PLL−PEG機能化を介して、または中性(100%DOPC)支持脂質二重層の形成のいずれかによって行うことができる11,32。
Ivら10で最初に記載された元の精製プロトコルと比較して、緩衝液組成に変化がある(表2)。MgCl2の濃度は5mMから2mMに減少し、トリス塩酸塩の濃度およびpHはそれぞれ50mMから20mMにおよび8.0から7.4に減少した。これらの変更は、緩衝条件をヒトセプチンと脂質二重層、アクチンフィラメント、および微小管との相互作用の研究に適合させるために行われました10,11,32。これは、著者らがFバッファー中に支持された脂質二重層を形成し、Fバッファー中にATPが存在することを除けば、その組成がdarkSPBの組成と同じであるためである。バッファーの変更は、元のバッファーと比較して精製セプチンの品質または寿命に変化をもたらさなかった。
この精製方法にはまだいくつかの制限があります。第一に、精製の異なる試みは、精製されたセプチン複合体のバンドル形成能力によって確認されるように、収率(0.5〜1mLの2〜5μMセプチン複合体)および機能品質において異なる可能性がある。そのため、このホワイトペーパーで説明されている品質チェックを一貫して実行することが非常に重要です。発現時間と細菌培養物の光学密度を非常によく制御することで、収量の差を軽減することができます。第二に、この精製パイプラインは三量体と六量体、または四量体と八量体を区別できません(図1B)。しかしながら、品質管理実験は、セプチン複合体の大部分がそれらの長いオリゴマー形態であることを証明するために使用することができる。さらに狭いオリゴマーサイズ分布が必要な場合は、ステップ1.6の間にサイズ排除クロマトグラフィーを挿入できます。およびステップ1.7。精製プロトコルの。ただし、このオプションのステップは歩留まりを劇的に低下させるため、厳密に必要な場合を除いて推奨されません。最後の、より根本的な制限は、組換えセプチン複合体の発現系としての大腸菌の使用から来ています。当然のことながら、このシステムは、リン酸化、アセチル化、およびスモイル化などの動物細胞で報告されている翻訳後修飾(PTM)を許可しません6,51,52,53。これらの翻訳後修飾は、昆虫またはヒト細胞において同様の精製戦略を実施することによって追加することができる。さらに、この論文ではセプチンの再構成についてのみ議論しましたが、細胞での研究では、Borgファミリー54,55やアニリン24,25,56のタンパク質などの調節タンパク質は、セプチンの組み立てと機能に実質的でありながら十分に理解されていない影響を与える可能性があるため、最終的にin vitroに組み込むことが重要です。 勉強。Borgタンパク質およびアニリンの精製のためのプロトコールが報告されている54,57。
ここで報告されているセプチン精製プロトコルは、正しいサブユニット化学量論でオリゴマー形態のセプチンを精製するための標準化された方法を提供し、単一のセプチンサブユニットに依存する多くの以前のin vitro研究よりも重要な進歩を提供します。特定の状況におけるいくつかのセプチンは単一のサブユニット2として作用することができるが、現在の文献は、動物細胞において、セプチンが主に複合体9,58で機能することを強く示唆している。したがって、この論文や他の論文10、11、18、32、35、36、37に記載されているような事前に形成されたヘテロオリゴマーの使用は、in vitroを介してセプチンの構造的および生物物理学的特性を研究するために非常に重要です。 細胞内のそれらの機能を解剖するための再構成。さらに、セプチンは、膜や細胞骨格を含む多くの相互作用パートナーを持つ自己組織化タンパク質であり、ボトムアップ合成生物学59,60,61や、湾曲42,62,63などの膜生物物理学的特性におけるタンパク質誘発性変化の研究にとって非常に興味深いものとなっています。

細胞骨格は、古典的にはアクチンフィラメント、微小管、中間フィラメント1からなる3成分系と記載されてきたが、最近では細胞骨格1の第4成分としてセプチンが認められている。セプチンは、真核生物に保存されているGTP結合タンパク質のファミリーです2。セプチンは、細胞分裂3、細胞間接着4、細胞運動性5、形態形成6、細胞感染7、細胞極性の確立と維持8など、多くの細胞機能に関与しています。それらの重要な機能にもかかわらず、セプチンがそのようなプロセスにどのように関与しているかはよく理解されていません。
セプチンファミリーのタンパク質は、タンパク質配列の類似性に基づいていくつかのサブグループ(分類に応じて4つまたは7つ)に細分されます2。異なるサブファミリーのメンバーは、フィラメントの構成要素であり、次にバンドル、リング、メッシュワークなどの高次構造に集合する回文ヘテロオリゴマー複合体を形成することができます1,9,10,11,12。さらなる分子の複雑さは、異なるスプライス変異体の存在から生じ、その一例はヒトSEPT9であり、そこでは異なるスプライス変異体の特定の機能の証拠がある13、14、15。さらに、ヘテロオリゴマーの長さは、種および細胞型に依存する。例えば、カエノラブディティス・エレガンス・セプチンは四量体16を形成し、ショウジョウバエ・メラノガスター・セプチンは六量体17を形成し(図1A)、サッカロミセス・セレビシエ・セプチンは八量体18を形成し、ヒトセプチンは六量体と八量体19の両方を形成します(図1A)。同じサブファミリー由来のセプチンアイソフォーム、スプライスバリアント、および翻訳後修飾セプチンが複合体内で互いに置換する能力、および異なるサイズのヘテロオリゴマーの(共)存在により、異なるヘテロオリゴマー複合体の細胞機能を描写することが困難になっています12。
セプチンのもう一つの興味深い能力は、細胞内の多くの結合パートナーと相互作用する能力です。セプチンは、間期および細胞分裂中に原形質膜および膜細胞小器官に結合する20,21,22。細胞分裂において、セプチンは細胞質分裂中にアニリン23,24,25ならびにアクチンおよびミオシンと協力する26,27。細胞質分裂の後期段階では、セプチンは中体離脱のための輸送(ESCRT)システムに必要なエンドソーム選別複合体を調節するようである28。さらに、間期細胞のアクチン皮質およびアクチンストレス線維に位置するセプチンの証拠もあります29、30、31。特定の細胞型では、セプチンは微小管細胞骨格にも結合して調節する32,33。
これらすべての特徴により、セプチンは研究するのに非常に興味深いタンパク質システムになりますが、挑戦的なタンパク質システムでもあります。多数のセプチンサブユニット(スプライスバリアント2を数えずにヒトでは13遺伝子)と、同じサブファミリーのセプチンサブユニットが互いに置換し、異なるサイズのヘテロオリゴマーを形成する可能性の組み合わせにより、遺伝子操作によって特定のセプチンの細胞機能について結論を出すことは困難です。さらに、セプチンの複数の相互作用により、細胞骨格または膜成分に向けられた薬物34 などの一般的な研究ツールの効果を解釈することは困難な作業になります。
この状況を克服する方法は、セプチンのin vitro(無細胞)再構成で細胞内の研究を補完することです。インビトロ再構成は、特定のサブユニット組成および長さ18、35、36、37を有する単一タイプのセプチンヘテロオリゴマーの単離を可能にする。この複合体は、セプチン38,39,40の基本的な構造的および物理化学的特性を発見するために単独で、またはモデル生体膜11,41,42、アクチンフィラメント10,27、または微小管32,36などの所望のパートナーと組み合わせて、それらの性質を解読するために、制御された環境で研究することができる。相互 作用。
したがって、さまざまなセプチン複合体を効率的に精製するための信頼性の高い方法は、セプチン研究にとって不可欠です。ただし、同じプロトコルを使用しても、精製が異なれば、活性/機能、さらには完全性が異なるタンパク質が得られる可能性があります。酵素などの市販のタンパク質については、機能性および酵素活性が注意深く検証される43。セプチンなどの細胞骨格タンパク質や構造タンパク質の慎重な品質管理を実施することは困難な場合がありますが、ラボ間での実験を比較可能にすることが不可欠です。
この論文では、大腸菌細胞におけるモノまたはバイシストロン構築物を含む2つのベクター(表1)の同時発現に基づいて、ヘテロオリゴマー形態の高品質の組換えセプチンを精製する堅牢な方法について説明します。この方法は、his6タグセプチンとStrep-IIタグセプチンの両方を含むセプチンヘテロオリゴマーを捕捉するための2段階アフィニティークロマトグラフィーアプローチで構成されています(図1B、C)。Ivら10で最初に記載されたこのプロトコルは、ショウジョウバエセプチン六量体11、27、35、ヒトセプチン六量体10、および異なる天然(アイソフォーム1、3、および5)10,32または変異したSEPT9アイソフォーム32を含むいくつかのヒトセプチン八量体を精製するために使用されています。.さらに、精製されたセプチンの品質を評価するための一連の技術の説明が与えられる。まず、セプチンサブユニットの完全性と正しい化学量論を変性電気泳動と透過型電子顕微鏡(TEM)を使用してチェックします。次に、正しい分子量のヘテロオリゴマーの存在、および複雑な不安定性を示すモノマーまたはより小さなオリゴマーの存在を、ネイティブ電気泳動および干渉散乱顕微鏡(iSCAT)を介した質量測光によって調べます。最後に、最後のステップは、蛍光顕微鏡とTEMを使用したセプチンの重合活性の評価で構成されます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2.jpg"> 図1:精製戦略 。 (A)ヒト(左)と ショウジョウバエ (右)の細胞に存在するセプチンヘテロオリゴマーの模式図。数字は示されたグループのセプチンサブユニットを示し、Pはピーナッツを示します。ヒトSEPT9は、そのアイソフォームのいずれかであり得る。セプチンサブユニットは非対称形状を有し、ヒト六量体の上にそれぞれNCおよびGで示されるように、2つの異なる界面、NC:NCおよびG:G界面に縦方向に関連付けられる。(B,C)二段階クロマトグラフィー戦略の概略図を、(B)ヒトセプチン六量体および(C)八量体について示す。Hはヒスタグを示し、SはストレプIIタグを示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig01v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>488nmレーザーコンバイナーiLAS2</td><td>ガタカ</td><td></td><td>TIRF顕微鏡</td></tr><tr><td>488nmサファイアレーザーライン</td><td>コヒーレント</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>4k×4k F416 CMOSカメラ</td><td>TVIPS</td><td></td><td>JEM-1400plus</td></tr><tr><td>用4xサンプルバッファーnativePAGE</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸(TROLOX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238813</td><td>まばたきを防ぐため</td></tr><tr><td>AKTA pure 25 M1</td><td>GE ヘルスケア</td><td>1680311</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9518-25G</td><td></td></tr><tr><td>カーボン Type-B, 300 メッシュ EM グリッド</td><td>Ted pella</td><td>01813-F</td><td></td></tr><tr><td>カーボン Type-B, 300 メッシュ EM グリッド</td><td>電子顕微鏡科学</td><td>CF300-Cu</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス #1.5H</td><td>Thorslabs</td><td>CG15KH</td><td></td></tr><tr><td>CSU-X1-M1 共焦点ユニット</td><td>横河</td><td></td>電機共<td>焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>Desthiobiotin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1411-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti2-E</td><td>ニコン機器</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤カクテル</td><td>Roche</td><td>481761</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP, 5 mL</td><td>GE ヘルスケア</td><td>29-0588-3</td><td></td></tr><tr><td>iLAS2 方位角TIRF照明システム&nbsp;</td><td>Gataca</td><td></td><td>TIRF顕微鏡</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1202-1KG</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue Protein Gel Stain Westburg</td><td>Life Sciences</td><td>EP ab119211</td><td></td></tr><tr><td>イソプロピル &β;-D-1-チオガラクトピラノシド (IPTG)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>サイエン</td>ティフィック 10849040 <td></td></tr><tr><td>iXon Ultra 888 EMCCDカメラ</td><td>Andor</td><td></td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>iXon Ultra 897 EM-CCD&nbsp;</td><td>Andor</td><td></td><td>TIRF顕微鏡</td></tr><tr><td>JEM-1400plus</td><td>JOEL</td><td></td><td>TEM顕微鏡 TUDelft</td></tr><tr><td>κ-cassein&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022-6X1KG</td><td></td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971-10G-F</td><td></td></tr><tr><td>塩化マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>硫酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452-1KG</td><td></td></tr><tr><td>メチルエクルロース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>8074844</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ システム (インテグラル 10)</td><td>Merck-Millipore</td><td></td><td>I-water dispenser</td></tr><tr><td>Mini protean TGX gels</td><td>BIORAD</td><td>4561086</td><td></td></tr><tr><td>NativeMark 未染色タンパク質標準</td><td>Invitrogen</td><td>LC0725</td><td>iSCAT およびネイティブゲル用</td></tr><tr><td>NativePAGE 4-16% GELS</td><td>Thermo Fisher 科学</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE ランニングバッファーキット</td><td>サーモフィッシャー科学</td><td>的なBN2007</td><td></td></tr><tr><td>ニコンTi2-E&nbsp;</td><td>ニコンインスツルメンツ</td><td></td><td>TIRF顕微鏡</td></tr><tr><td>Nr.1 Menzel coverslips</td><td>サーモフィッシャー 科学</td><td>11961988</td><td></td></tr><tr><td>パラフィルム&nbsp;</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>P7668</td><td></td></tr><tr><td>プランAPO&times;100/1.45 NA 油浸対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td>機器 共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10837091001</td><td></td></tr><tr><td>Poly(L-lysine)-graft-biotinylated PEG (PLL-PEG)</td><td>SuSoS</td><td>CHF560.00</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lysine solution 0.01%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4832</td><td>iSCAT スライドガラス用</td></tr><tr><td>塩化ポタッシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541-1KG</td><td></td></tr><tr><td>天然ゲル用電源</td><td>CONSORT</td><td>S/N 71638</td><td></td></tr><tr><td>POWERPAC UNIVERSAL</td><td>BIORAD</td><td>042BR31206</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテクエート 3,4-ジオキシゲナーゼ (PCD)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>P8279-25UN</td><td>酸素スカベンジャー - 酵素</td></tr><tr><td>プロトカテク酸 (PCA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>03930590-50MG</td><td>酸素スカベンジャー - 試薬</td></tr><tr><td>Q500ソニケーター</td><td>Qsonica</td><td>Q500-110</td><td></td></tr><tr><td>ケメサカメラ</td><td>オリンパス</td><td></td><td>テクナイスピリット用</td></tr><tr><td>Refeyn OneMP</td><td>Refeyn</td><td></td><td></td></tr><tr><td>サンプルバッファー、laemmli 2倍濃縮</td>液 <td>Sigma-Aldrich</td><td>S3401-10vl</td><td></td></tr><tr><td>シリコンガスケット</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>GBL103250-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer 透析カセット 30k MWCO 3mL</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>66381</td><td></td></tr><tr><td>スペクチノマイシン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PHR1441-1G</td><td></td></tr><tr><td>StrepTrap HP, 1 mL</td><td>GE ヘルスケア</td><td>28-9075-46</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit 顕微鏡</td><td>Thermo Scientific, FEI</td><td></td><td>TEM 顕微鏡研究所 キュリー</td></tr><tr><td>Terrific ブロス</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0918-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Tris/Glyine/SDS buffer</td><td>BIORAD</td><td>1610772</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-1KG</td><td></td></tr><tr><td>超音波洗浄機</td><td>Branson</td><td>CPX2800H-E</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 6、30,000 MWCO PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0622</td><td></td></tr></tbody></table>

無細胞再構成のための組換えセプチン複合体の精製と品質管理

Purification and Quality Control of Recombinant Septin Complexes for Cell-Free Reconstitution

セプチンは、ヘテロオリゴマー複合体から細胞骨格フィラメントおよび高次構造を形成することができる保存された真核生物GTP結合タンパク質のファミリーです。それらは他の細胞骨格成分および細胞膜と相互作用して、遊走および細胞分裂などの重要な細胞機能に関与する。セプチンの多くの相互作用の複雑さ、多数のセプチン遺伝子(ヒトでは13個)、およびセプチンが異なるサブユニット組成を持つヘテロオリゴマー複合体を形成する能力のために、無細胞再構成はセプチン生物学の基礎を理解するための重要な戦略です。本論文では、まず、2段階アフィニティークロマトグラフィーアプローチを使用して、ヘテロオリゴマー形態の組換えセプチンを精製する方法について説明します。次に、セプチン複合体の純度と完全性をチェックするために使用される品質管理のプロセスが詳細に説明されています。このプロセスは、ネイティブおよび変性ゲル電気泳動、負染色電子顕微鏡、および干渉散乱顕微鏡を組み合わせたものです。最後に、ネガ染色電子顕微鏡および蛍光顕微鏡を用いてセプチン錯体の重合能を確認するプロセスについて説明する。これは、ショ ウジョウバエ セプチン六量体と同様に、高品質のヒトセプチン六量体および異なるseptin_9アイソフォームを含む八量体を製造することが可能であることを示している。

プロトコルで述べたように、2つのセプチン発現プラスミドと共形質転換した5Lの 大腸菌 細胞を増殖させ、IPTGを添加することによってセプチンの発現を誘導した。3時間後、細胞を遠心分離により回収し、溶解緩衝液に再懸濁し、超音波処理により溶解した。次に、ライセートを遠心分離によって清澄化し、清澄化した溶液をHisTrapカラムに適用しました(図2A)。最初の精製後、セプチン含有画分をプールし、StrepTrapカラムに適用した(図2B)。これにより、通常、約3〜5 mLの~1 μMセプチン複合体が得られます。セプチン含有画分をプールする前に、変性ゲル電気泳動を使用して、セプチンサブユニットの完全性および複合体を形成する異なるセプチンサブユニット間の等モル化学量論比を検査することができる。(図3A)。ゲルがセプチンサブユニットの分子量(表3)に対応する同様に強いバンドを示す場合、プロトコルを継続できます。そうでない場合は、プロトコルを再起動することをお勧めします。SEPT9_i1を有するヒトセプチン八量体について示した例では、 図3A は、同様の強度を有するSEPT9_i1、SEPT6、SEPT7、およびSEPT2に対応するバンド(上から下の順)を明確に示しています。正規化強度の99%信頼区間は、SEPT2±1.128 0.048、SEPT6±1.092 0.034、SEPT7±1.108 0.040、SEPT9±0.029で1.067でした。SEPT2 が msfGFP でタグ付けされている場合、SEPT9_i1 のすぐ下にシフトします。使用する電気泳動システムと、SEPT7のC末端TEV-Strepタグの存在(タグなしSEPT7よりも移動が遅くなる)によっては、SEPT7バンドとSEPT6バンドは分子量が等しいため、融合することがあります。次のステップは、フラクションをプールし、DTTでセプチンバッファーに対して透析することです。透析後、濃度が低すぎる(&lt;2 μM)場合、または実験に高濃度が必要な場合は、プロトコルに記載されているように、濃縮ステップを含めることができます。1μM未満の濃度は通常、セプチンの機能品質が悪いことを示しています。3.5 μMから7 μMの間の最終セプチン複合体濃度は、ほとんどの in vitro アッセイに適しています。これらの濃度は、通常、濃縮後の容量が0.5〜1mLに達したときに得られる。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig02.jpg"> 図2:暗黒ヒトセプチンoctamers_9i1の精製に対応するクロマトグラムの例 。 (A)HisTrapカラムクロマトグラム。セプチン溶出ピークの後、おそらくバッファー中にイミダゾールが存在するため、吸光度はゼロに戻りません。プールされた画分は、溶出ピークの開始から吸光度が約250mLで安定するまで行った。(B)ストレプトラップカラムクロマトグラム。プールされた画分は、溶出ピークの開始から吸光度が50mLで約0に戻るまで行った。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
品質管理を継続するために、プロトコルに記載されているように、ネイティブ電気泳動を実施しました(図3B)。ゲル中には、無傷のヘテロオリゴマーに対応するメジャーバンド、および通常、ダイマーに対応するマイナーバンドが観察され得る。ヒト六量体は242 kDaマーカーバンドより少し上に見られ、八量体は計算された分子量より上の480 kDaバンドの上に見られます。これらのバンドの位置を、真核細胞抽出物32のウェスタンブロット分析によって確認した。msfGFPによるタグ付けは、各SEPT2をmsfGFPタンパク質と結合させる。これにより、セプチン複合体の分子量が53.4 kDa(26.7 kDa/msGFP分子)増加します。それにもかかわらず、天然の電気泳動ゲルでは、msfGFPタグ付き複合体の見かけの分子量は、タグなし複合体の見かけの分子量と区別がつかない。
セプチン複合体が無傷であるかどうかをテストするための補完的な技術は、iSCAT顕微鏡による質量測光です。iSCATは、参照光との干渉によって増幅されたスライドガラスに着弾する分子の光散乱、典型的にはスライドガラス底部でのレーザーの反射を監視する。次に、バックグラウンド減算アプローチを使用して、粒子にコントラストを与えます。この補正により、信号は、粒子がガラスに着地するか、ガラスから離れるかに応じて正の値と負の値を示します49。検出されたシグナルは、タンパク質50の分子量に正比例する。したがって、質量標準によるシグナル対質量キャリブレーションは、サンプルタンパク質の質量を決定することができます。 図3C は、SEPT9_i1を含有するヒトセプチン八量体の一例を示す。検出された単一粒子のほとんど(~50%)は、SEPT9_i1(423 kDa)を含む完全な八量体で予想される分子量です(図3C)。150〜300 kDaの質量を持つ粒子もありますが、明確なピークは観察されず、他のセプチン種が低存在量で存在する可能性があることを示しています。同様に、mEGFPタグ付き ショウジョウバエ 六量体について検出された単一粒子のほとんどは、無傷の六量体(361 kDa)について予想される分子量のものである(図3D)。241 kDaの追加の明確なピークは、2つのピーナッツタンパク質、1つのDSep1と1つのmEGFP-DSep2を含む安定な四量体の存在を示しています。最後に、ヒトおよびフライセプチン複合体の両方が、モノマーおよび二量体の混合物である可能性のある80kDa付近のピークを示し、おそらく微量のDTTまたは凝集する他の小分子によって増幅され、プロット45の正側にピークを示す。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2.jpg"> 図3:オリゴマーの品質管理の結果の例 。 (a)暗黒ヒトセプチンoctamers_9i1の精製とは異なる画分の溶出ピークを示す変性ゲルの例。(B)異なるセプチン複合体の天然電気泳動の例。(C,D)セプチン複合体の12.5nMでの質量測光のヒストグラム結果の異なる例:(C)暗黒ヒトセプチンoctamers_9i1および(D)DSep1-msfGFP ショウジョウバエ セプチン六量体。線はガウス適合です。(E)セプチン緩衝液中の25nM暗黒ヒトセプチンoctamers_9i1のTEM像。スケールバー= 200 nm。(F)SEPT2-msfGFPヒトセプチンoctamers_9i1のクラス平均画像。msfGFP タグは、両端のファジー密度として表示されます。スケールバー= 10 nm。パネル(E)および(F)は、生物学者の会社の著作権であり、許可を得てIv et al.10 から適応されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig03v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ネイティブゲルとiSCATの両方がアンサンブル平均情報のみを提供することを考慮して、単一のセプチンオリゴマーの透過型電子顕微鏡画像のクラス平均化を使用して、直接可視化によって複合体の完全性と純度を確認しました。セプチンバッファー中のセプチン複合体のTEM画像では、長さ24 nm(六量体)または32 nm(八量体)のロッドが観察されます。SEPT9_i1を含有するヒトセプチン八量体の一例を 図3Eに見ることができる。それらをクラス平均化すると、 図3FのSEPT9_i1を有するmsfGFPタグ付きヒト八量体について見られるように、各サブユニットを観察し、カウントすることができる。オリゴマーが蛍光標識されている場合、ロッドの端にSEPT2-msfGFPに対応する余分な密度が観察されます(図3F)。
上記の技術の組み合わせは、正しい化学量論比および高純度を有する八量体(または六量体)が、記載されたプロトコールを使用して精製され得ることを証明する。最後に、最後の品質管理チェックは、重合能力の観点からセプチン複合体の機能性についてです。低塩濃度(記載された緩衝液9を有する&lt;150mM KCl)の存在下で、セプチンが他のタンパク質または負に帯電した脂質膜の存在下でない場合、それらはバンドル9に自己集合する。セプチンは、高い(300 mM)KCl濃度を有する貯蔵バッファーにそれらを保持することによって重合を防止する。次に、セプチンヘテロオリゴマーを同じ組成のバッファーで1:6の容量比で希釈しますが、KClは含まれていませんが、最終的なKCl濃度は50 mMになります。蛍光イメージングを行うために、このバッファーは、光退色から保護するための酸素消去システムと点滅抑制剤で補完されます。TIRF顕微鏡では、浅いTIRFフィールド(~100 nm;図4A,B)。共焦点顕微鏡では、糸状構造の大きなクラスターが溶液中でより高い位置に浮かんでいるのを見ることができます(図4C)。最後に、TEMを使用すると、TIRFで観察されたクラスターに対応するセプチンの小さなバンドル(図4D)と、共焦点顕微鏡で観察された構造に対応する大きなバンドル(図4E)を観察できます。図4D,Eの挿入図は、両方のタイプの構造が平行に走る長くて細いフィラメントで構成され、先細端の束を形成していることを示しています。蛍光画像とTEM画像を組み合わせることで、精製されたセプチン複合体がフィラメントに重合し、フィラメントが自己組織化して束になることを証明しています。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63871/63871fig04.jpg"> 図4:重合能精度管理の結果の例。 (A)フルオSPB中の300 nMヒトセプチン六量体(10%msfGFP標識六量体)のTIRF画像。(B)fluoSPB中のSEPT9_i1(10%msfGFP標識octamers9_i1)を含む300nMヒトセプチン八量体のTIRF画像。(C)fluoSPB中の300 nMヒトセプチンoctamers_9i3の0.5 μm間隔で~30 μmにわたるZスタックの共焦点最大強度投影。(A-C)スケールバー= 10 μm、反転グレースケール。(D,E)darkSPB中のヒトセプチンoctamers_9i1の(D)小さな束と(E)大きな束のTEM画像の例。挿入図は、バンドル内で平行に走る透明なフィラメントが観察される領域を示します。スケールバー= 500 nm。パネル(C-E)は生物学者の著作権であり、許可を得てIv et al.10から翻案されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/63871fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:プラスミドのリスト。 このプロトコールに従ってセプチンオリゴマーを精製するためのプラスミド。全てのプラスミドはAddgene(第1カラム)に寄託されている。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%201_V2.zip" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表 2: バッファーの一覧。 セプチンオリゴマーの精製および品質管理に使用される緩衝組成物。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%202(1).xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
表3:分子量と吸光係数。 セプチンサブユニット、異なるセプチン複合体、および 表1にリストされているプラスミドで精製できるユニークなセプチンサブユニット(MWのみ)の線形融合を想定して、複合体の配列に基づいてProtParamで計算された波長280nmでの分子量(MW)および光吸光係数(ε)のリスト。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63871/Table%203.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

細胞骨格タンパク質のin vitro再構成は、これらのタンパク質の基本的な機能特性を理解するための重要なツールです。本論文は、細胞分裂と遊走において中心的な役割を果たす組換えセプチン複合体の品質を精製および評価するためのプロトコルを記載する。

Septins are a family of conserved eukaryotic GTP-binding proteins that can form cytoskeletal filaments and higher-order structures from hetero-oligomeric ...

このプロトコルは、高品質のセプチン複合体を精製することを可能にし、これは細胞内のセプチンの多くの役割を研究するために不可欠です。このアプローチの主な利点は、Addgeneプラスミドを使用して高品質のセプチンを精製するための簡単な手順の合成です。セプチンは、それらの多くの相互作用のために細胞内で研究することは困難です。硫黄の再構成は、単純なシステムでそれらを研究することによって、この複雑さを解きほぐすのに役立ちます。劣化防止のため、1日で精製を推奨します。私たちの経験では、これはタンパク質の寿命と品質を向上させます。まず、600ナノメートルの波長の光学密度が非標識セプチンの場合は2〜3、msfGFPまたはmEGFP標識セプチンの場合は0.6〜0.8に達するまで、シェーカーインキュベーター内で摂氏37度で形質転換細菌培養物を増殖させます。インキュベート後、IPTGを最終濃度0.5ミリモルまで添加してタンパク質発現を誘導し、非標識セプチンヘテロオリゴマーを発現する細胞を摂氏37度で3時間インキュベートするか、msfGFP標識ヘテロオリゴマーを発現する細胞を摂氏17度で一晩インキュベートします。次に、摂氏4度で20分間、4, 000倍Gで細胞をペレット化します。上清を廃棄し、ペレットを100ミリリットルの溶解バッファーに溶解して細胞を溶解します。次に、細胞を超音波処理するために30%振幅で先端超音波処理器を使用します。摂氏 4 度で 30 分間 20 、 000 倍 G で遠心分離して細胞溶解液を清澄化し、上清を保存します。任意選択で、原稿に記載されているように電気泳動を変性するためのサンプルを採取する。Hisタグ付きセプチンのアフィニティークロマトグラフィーでは、充填済みのニッケルセファロース高速クロマトグラフィーカラムを必要なすべてのバッファーで平衡化します。清澄化した上清をカラムにロードし、クロマトグラフィーシステムを起動します。次に、セプチン複合体を50%HisTrap溶出バッファーで毎分1ミリリットルの流速で溶出します。250ミリモルのイミダゾール濃度を得るために、0.5ミリリットルの画分を集める。次に、高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムで280ナノメートルの溶出液の光学吸光度を監視し、セプチン複合体を含む画分を選択します。Strep-IIタグ付きタンパク質のアフィニティークロマトグラフィーのために、予め充填されたStrepTactinセファロース高速クロマトグラフィーカラムをセプチン緩衝液で平衡化します。ニッケルカラムから回収したセプチン含有画分を毎分1ミリリットルの速度でロードし、クロマトグラフィーシステムを起動します。次に、結合したタンパク質を洗浄し、セプチン複合体を100%StrepTrap溶出バッファーで毎分1ミリリットルの流速で溶出します。2.5ミリモルのデスチオビオチンの濃度を得るために、0.5ミリリットルの画分を集める。高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステムでオンラインで監視された280ナノメートルでの溶出液の光吸光度で示されるように、セプチン複合体を含む画分を選択します。透析によってデスチオビオチンを除去した後、タンパク質複合体を所望のアリコートサイズに分注し、アリコートをスナップ凍結し、摂氏マイナス80度で保存します。干渉散乱顕微鏡の場合、ガラススライド番号1.5を超音波洗浄機で水、イソプロパノール、および再び脱イオン水中でそれぞれ5分間超音波処理することにより洗浄します。2枚のスライドガラスを穏やかな窒素ガスの流れで乾かします。次に、スライドの1つの中央に0.01%ポリ-L-リジン溶液の7マイクロリットル滴を置き、もう一方のスライドの中心をポリ-L-リジンドロップの上に置き、2つのスライドを簡単に分離できるように直交させます。30秒間インキュベートした後、脱イオン水を含むビーカーに1回浸し、水流を2回直接適用してスライドを洗浄します。窒素ガスフローで乾燥させると、これらのスライドは乾燥状態で室温で約6週間保存できます。実験の前に、2 x 2、3 x 2、または 3 x 3 ガスケットをカットし、スライドガラスのPoly-L-リジン処理部分に貼り付け、スライドガラスとガスケットが汚れた表面に接触しないようにします。次に、ガスケットをピペットチップで押して、ガスケットにある保護プラスチックで貼り付けます。次に、セプチン緩衝液を室温まで温める。手持ちのタンパク質を解凍し、その後氷の上に置いておきます。次に、ガスケット付きのスライドを19マイクロリットルのセプチンバッファーを含む市販の質量測光システムに置き、オートフォーカスオプションを使用して顕微鏡の焦点を合わせます。オートフォーカスオプションを使用して、新しい設定で再フォーカスします。プロジェクト フォルダーを作成するには、[ファイル]、[新しいプロジェクト] の順にクリックし、データを格納するプロジェクト フォルダーを読み込むには、[ファイル]、[プロジェクトのロード] の順にクリックします。次に、1マイクロリットルのサンプルを19マイクロリットルのセプタムバッファードロップにピペットで入れます。混合し、混合中は、スライドの動きを防ぐために何かに触れないでください。次に、[録画]をクリックして6, 000フレームのビデオを録画します。メーカーのソフトウェアを使用してビデオを分析して、タンパク質の質量分布を取得します。異なるセプチンヘテロオリゴマーサイズのピークが重なりすぎるか、または検出されるイベントが多すぎる場合は、最終セプチン濃度を下げて再度測定します。そして、単一分子の十分な数が測定されない場合は、セプチン濃度を上げて再度測定します。セプチン分析のために、5倍のdarkSPBと、セプチンバッファーと1ミリモルのジチオスレイトール中の所望の最終濃度の6倍の濃度の100%ダークセプチンからなるセプチンミックスを調製します。次に、水、20%5X darkSPBおよび16.67%セプチン混合物をこの特定の順序で混合してセプチンを重合し、室温で30分間インキュベートします。3〜5マイクロリットルのサンプルをグロー放電電子顕微鏡グリッドに加え、1分間インキュベートします。次に、darkSPBバッファーを1滴加えてグリッドを2回洗浄し、ろ紙で液体を吸収します。水で一度洗浄し、2%酢酸ウラニルで30秒間インキュベートします。次に、汚れを吸い取り、サンプルを数分間風乾します。次に、セプチンバンドルを120キロボルトで、倍率5, 000Xから60, 000Xの倍率で、1〜2マイクロメートルの焦点を合わせます。HisTrapおよびStrepTrapクロマトグラムは、プールされた画分が溶出ピークの開始から吸光度がそれぞれ約250ミリリットルおよび50ミリリットルで安定するまで経過したことを示しました。セプチンバンドは、変性ゲル電気泳動において同様の強度を示し、セプチンが無傷であることを示唆している。ネイティブ電気泳動では、インタクトなヘテロオリゴマーに対応するメジャーバンドと、トリマーまたはテトラマーに対応するマイナーバンドが観察されました。msfGFPタグ付き複合体の見かけの分子量は、タグなし錯体のそれと区別がつかない。質量測光法は、セプチンの無傷の八量体および六量体を検出した。241キロダルトンでの追加のピークは、2つのピーナッツタンパク質、DSep1とmEGFP-DSep2の存在を示しました。セプチン錯体の透過型電子顕微鏡画像は、六量体および八量体の棒を示した。msfGFPタグは、セプチン2 msfGFPヒトセプチンoctamers_9i1の両端のファジー密度として見える。タンパク質の小さなクラスターは、浅いTIRFフィールドで観察することができます。共焦点顕微鏡は、浮遊糸状構造の大きなクラスターを明らかにしました。透過型電子顕微鏡は、全反射蛍光顕微鏡および共焦点顕微鏡によって観察されたクラスターに対応する大小のセプチン束を示した。精製中は常に氷上で作業し、プロトコルで指定した新鮮な試薬を追加することをお勧めします。私たちは、細胞質分裂の文脈におけるセプチンの相互作用に興味を持っています。セプチンを最新の膜アクチンおよび微小管とともに再構成し、顕微鏡検査およびいくつかの生物物理学的アッセイでそれらを研究しました。精製されたセプチンを使用して、セプチンがアクチンフィラメント、微小管、脂質とどのように相互作用するかを研究します。また、精製されたセプチンを使用して、セプチンが細胞分裂を促進する合成細胞を構築します。

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セプチンは細胞骨格タンパク質である。それらは脂質膜と相互作用し、ミクロンスケールで膜曲率を感知するだけでなく生成することもできる。このプロトコルでは、膜変形、曲率に敏感なセプチン結合、およびセプチンフィラメントの超構造を分析するためのボトムアップ インビトロ...

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学ぶ 組換えセプチン複合体の精製と品質管理プロトコル。Affinity chromatographyを用いて高品質なタンパク質を単離し、細胞分裂と移動におけるセプチンの役割を無細胞系で解明する方法です。

無細胞再構成のための組換えセプチン複合体の精製と品質管理

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