細胞表面プロテオームのラベルフリー定量のための「Cell Surface Capture」ワークフロー

このプロトコルにより、さまざまな細胞タイプの細胞表面に存在する抗原を調査し、そのタイプの細胞または組織に特異的な抗原を見つけることができます。ここで紹介する技術は、全細胞ライセートから細胞膜タンパク質を濃縮し、最終的には質量分析ベースのプロテオミクスによる分析を可能にします。したがって、このプロトコルの具体的な用途の1つは、腫瘍細胞に適用して、がん免疫療法の新規標的として役立つ可能性のある正常細胞ではなく、それらのがん細胞の表面に存在する抗原を探すことです。

このプロトコルについて注意すべき点の1つは、目的の実験に対してサンプルインプットを最適化することが重要になる場合があるということです。そのため、最適な条件を見つけるために数回の反復または滴定が必要になる場合があります。そこで、この手順を実演するのは、私たちの研究室のジュニアスペシャリストであるAkul Naikです。

まず、凍結したビオチン標識細胞ペレットをマイナス80°Cから取り出し、氷上で解凍します。500マイクロリットルの2X Lysis Bufferをペレットに加え、十分に混合し、30秒間激しくボルテックスします。細胞溶解物を氷上で超音波処理し、ライセートを17,200Gで摂氏4度で10分間遠心分離して、残っている破片をペレット化します。

ライセートを遠心分離している間に、100マイクロリットルのNeutrAvidin Agarose樹脂ビーズを真空マニホールドに取り付けられたろ過カラムに加えます。穏やかな真空剤を塗布し、3ミリリットルのウォッシュバッファー1をビーズに流してビーズを洗います。バキュームマニホールドからろ過カラムを取り外し、底部にキャップをして、清澄化した細胞ライセートをビーズでカラムに加えます。

カラムの上部にキャップをし、ライセートをビーズとビーズでエンドツーエンドのローターで4°Cで120分間インキュベートします。ライセートのインキュベーションが完了したら、ろ過カラムを真空マニホールドに戻し、穏やかな真空を適用します。ビーズに5ミリリットルのウォッシュバッファー1を流してビーズを洗います。

5ミリリットルのWash Buffer 2とWash Buffer 3で洗浄ステップを繰り返します。最終的な洗浄バッファーがビーズ全体を通過したら、カラムをマニホールドから取り外します。次に、100マイクロリットルの溶解液をビーズに加え、ピペット付きの1.7ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。

チューブを短時間回転させてビーズを沈殿させ、溶液を50マイクロリットル取り出します。次に、チューブを摂氏65度のヒートブロックシェーカーに1000RPMの振とうで10分間置きます。210マイクロリットルの再懸濁溶液を追加し、数回ピペッティングして、乾燥したトリプシンが再懸濁していることを確認することにより、キットから乾燥したトリプシンを消化チューブに再懸濁します。

ビーズのインキュベーションが終了したら、ヒートブロックシェーカーから取り出し、再懸濁したトリプシン溶液を50マイクロリットルのビーズに加えます。チューブを摂氏37度でインキュベートし、500 RPMで少なくとも90分間振とうしてタンパク質を消化します。消化が完了したら、ビーズを含む溶液をスピンカラムに移し、1.7ミリリットルの低タンパク質結合性マイクロ遠心チューブにカラムを挿入します。

チューブを回転させて、消化されたペプチド溶液をビーズから分離します。次に、100マイクロリットルの停止液を加えて消化反応を停止し、ペプチド溶液を酸性化します。チューブアダプターを使用して、1.7 mLの低タンパク質結合性マイクロ遠心チューブに脱塩カラムをセットします。

酸性化ペプチド溶液全体をカラムに加えます。カラムを3, 800 Gで3分間回転させ、溶液がカラム内を流れるようにします。ペプチドがカラムに結合したため、フロースルーを破棄します。

200マイクロリットルのWash 1溶液をカラムに加え、室温で3,800Gで3分間遠心し、フロースルーを廃棄します。200マイクロリットルのWash2溶液で洗浄ステップを繰り返します。カラムを新しい標識1.7ミリリットルの低タンパク質結合マイクロ遠心チューブに移します。

100マイクロリットルの溶出溶液をカラムに加え、室温で3,800Gで3分間遠心する。これで、ペプチドがカラムからチューブに溶出されます。ペプチド溶液を真空遠心分離機に入れ、一晩乾燥させます。

乾燥させたペプチドを摂氏マイナス80度に置き、質量分析計で定量および分析する準備が整うまで待ちます。プロテオーム分析を行い、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法を用いて濃縮された細胞表面タンパク質の特性評価を行いました。比色ペプチド定量アッセイに基づいて、マイクロリットルあたり約630ナノグラムの最終ペプチド濃度が得られました。

MaxQuantを使用して解析した質量分析データとその後の細胞表面タンパク質のデータセット解析により、サンプル中には同定された全タンパク質の約27%にあたる601の表面タンパク質が得られました。ここには、Andromeda スコアで同定されたタンパク質の分布を表すプロットが示されており、散布図はサンプル間の相関を示しています。箱ひげ図は、実行間の変動を示しています。

また、サンプルごとの分布プロットは、反復のデータ品質を表していました。覚えておくべき最も重要なことは、各ステップでペプチドがどこにあるかです。最初は溶液中にあり、次に消化されるまでビーズに結合し、次に最終的に溶出するまで脱塩カラムに結合します。

この手順に続いて、同定された一握りのタンパク質を検証するには、ターゲットフローサイトメトリーやターゲットプロテオミクスなど、さまざまな方法があります。これにより、サンプル全体でのこれらのタンパク質の発現レベルについて、より詳細な情報が得られます。