菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出
2023年5月5日
本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。
ここで紹介する手法は、さまざまな植物器官に関連する内生菌群集を調査するのに役立ちます。内生菌の単離は、それらの同定を可能にし、共生発芽などの他の技術において貴重である。まず、1リットルあたり3ミリリットルの抗生物質を添加した8〜10センチメートルのPDA培地ペトリ皿を準備します。
使用前にペトリ皿で36°Cで24時間培養して汚染を確認してください。翌日、標準的な手順で健康な菌従属栄養植物片を表面的に消毒し、滅菌ペトリ皿に入れます。サンプルの表面的な消毒の有効性を評価するには、PDAでサンプルを最後に洗浄する際に使用した数滴の蒸留水を接種します。
次に、フレイムメスと鉗子を使用して、サンプルを0.2センチメートルの厚さに分割します。サンプルを切片化して、培地と接触する表面積を増幅します。抗生物質を添加したPDAプレートに、地下臓器の5つの断片を、皿の端に触れないようにできるだけ離して置きます。
ペトリ皿をラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で5日間保管します。継代培養の前日に、1リットルあたり5〜7グラムのAA培地を使用して5センチメートルのシャーレを調製し、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートします。真菌分離株を精製するには、PDAプレートコロニーを色、増殖パターン、テクスチャー、およびマージンフォーマットで区別します。
次に、皿の下側のコロニーの縁を区切ります。また、コロニーをコードで識別します。オートクレーブ処理した木製のつまようじの先端を使用して、同定された真菌コロニーの縁から少量の菌糸体を回収し、AAプレートに縞模様を付け、互いに1センチメートルの距離と皿の端に3つの線条を生成します。
ステッカー紙と鉛筆を使用して、AAプレートに適切なコードでラベルを付けます。プレートを密封してから、摂氏25〜27度の暗闇で3日間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを注意深く観察して、個々のコロニーを形成する細かい菌糸を特定します。
油性マーカーを使用して個々のコロニーの面積を区切ります。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用してコロニーを含む培地の一部を切断し、切断した体積を抗生物質なしで新しいPDAペトリプレートの中央に移します。ペトリ皿に分離株のコードをラベル付けした後、ラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で7〜14日間維持します。
カステラーニ法で真菌分離株の保存を開始するには、オートクレーブ処理した2ミリリットルの微量遠心チューブに0.5ミリリットルの蒸留水を加えます。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用して、すでに増殖した精製分離株の菌糸体縁から0.5×0.5センチメートルの直方体培地を切り取ります。蒸留水を入れた微量遠心チューブに4〜6個の直方体を置きます。
チューブは、摂氏25度の暗闇で必要な限り保管してください。必要に応じて、直方体を回収し、新しいPDAディッシュの中央に置いて、保存された分離株を成長させます。トルイジンブルーO染色剤を清潔なスライドガラスに一滴垂らすことから、いじめマウント法を開始します。
このような技術では、さまざまな染色を使用できます。オートクレーブ処理したつまようじを使用して、成長した分離株から菌糸を慎重に取り除き、染みの滴に入れます。カバースリップを置き、光学顕微鏡で分析します。
粘着テープの取り付け方法の場合は、清潔なスライドガラスにラクトフェノール綿の青い染みを一滴垂らします。透明な粘着テープをスライドガラスに合う大きさにカットし、中央の汚れが落ちます。粘着ストリップの粘着面を菌糸体表面に向け、菌糸を押したり集めすぎたりせずに、菌糸を集めてみてください。
次に、テープをスライドガラスに貼り付け、汚れが収集した菌糸に接触していることを確認します。テープの上に水滴を置き、カバースリップを置いてから、スライドを光学顕微鏡で分析します。断片の内部から出現する糸状菌菌の菌糸体の小群の成長は、PDA培地に菌従属栄養植物器官断片を接種してから5日後に観察された。
精製された分離株の接種の7〜14日間に、純粋な真菌分離株コロニーの遠心増殖がPDA上で観察され、唯一の円形菌糸体を形成しました。コンタミネーションの可能性は容易に特定され、培地中での増殖形態の様相、色、および色素産生に関するコロニーの均質性が損なわれました。菌従属栄養性のラン(Wullschlaegelia aphylla)の紡錘状の根から単離されたコロニーは不透明で、培地中に拡散性の色素や滲出液はありませんでした。
コロニーは上側が白っぽく灰色で、下側が茶色がかっていました。菌糸体は空中で豊富で、縁は不規則で空中でした。コロニーはビロードのような質感で、巨視的な構造のないしわだらけの地形でした。
真菌の菌糸体をラクトフェノール綿青とトルイジンブルー-Oで染色すると、染色されていない菌糸体では見えにくかった構造が示され、同定が容易になりました。ここで紹介する真菌単離法は、真菌エンドファイトを同定するために緑色植物にも適用できます。単離された真菌は、共生発芽試験に使用できます。
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概要
この研究は、植物に関連する内生菌を分離・保存する方法を調査し、生物学的研究におけるそれらの重要性を強調しています。概説されたプロトコルは、これらの真菌コミュニティの正確な同定とさらなる分子生物学的研究を可能にすることを目的としています。
研究の主要構成要素
研究分野
- 植物に関連する内生菌
- 真菌の分離技術
- 分子同定とメタゲノム解析
背景
- 内生菌は植物組織内に症状を引き起こさずに生息します
- 植物の健康と発育に重要な役割を果たします
- そのコミュニティ構造の理解は農業および生態学的研究にとって重要です
使用した方法
- 真菌分離のための無菌培養技術
- 真菌構造の顕微鏡解析
- 真菌分離物の長期保存のための保存方法
主な結果
- 菌従属栄養植物からの内生菌の成功的な分離
- 形態的特徴に基づく真菌コロニーの明確な区別
- 精製と遺伝子解析のための効果的なプロトコルの確立
結論
- この研究は内生菌を分離・保存するための信頼できる方法を提供します
- これらの方法は真菌の多様性とその生態学的重要性の理解を深めます
よくある質問
Executive Industry Relevance
Isolation and molecular characterization of endophytic fungi from mycoheterotrophic plants provide foundational tools for understanding plant-fungal symbioses relevant to biopharma discovery. These protocols enable the identification and preservation of diverse fungal communities, supporting hypothesis-driven research into plant-microbe interactions and their translational potential. Integrating both culture-dependent and culture-independent workflows enhances predictive confidence in early-stage target validation and portfolio triage.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of plant-fungal symbiotic mechanisms for target validation.
- Supports biological de-risking by distinguishing culturable and non-culturable fungal taxa.
- Facilitates predictive confidence in selecting relevant endophyte-plant associations for further study.
Screening & Assay Development
- Prepares validated fungal isolates for downstream functional assays and symbiotic germination trials.
- Standardizes morphological and molecular identification for reproducible screening workflows.
- Enables scalable maintenance and reuse of fungal collections for comparative studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns fungal community profiling with translational biomarker discovery in plant-microbe systems.
- Supports continuity from ecological discovery to preclinical model development where relevant.
- Provides mechanistic de-risking for candidate endophyte selection in translational research.
Pipeline & Workflow Integration
These protocols position fungal isolation and DNA extraction at the interface of early discovery and assay development, bridging ecological sampling with molecular analytics.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing on endophyte diversity and plant-fungal specificity.
- Screening: Delivers reproducible, morphologically and molecularly characterized isolates for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative colony and DNA outputs for comparative condition analysis.
- Translational Research: Supports alignment of fungal profiles with disease-relevant or symbiotic biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable isolate and DNA resource for ongoing R&D initiatives.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces ambiguity in plant-microbe target validation.
- Operational Value: Standardizes isolation, preservation, and molecular workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and portfolio prioritization by clarifying endophyte diversity and function.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement of plant-microbe research programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in sterile technique, fungal morphology, and molecular biology.
- Needs access to culture facilities, microscopy, and DNA extraction infrastructure.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data comparability.
- Adaptable to diverse plant systems but may require protocol optimization for specific tissues.
- Limitations include potential underrepresentation of non-culturable fungi in culture-dependent workflows.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:21
Isolation of Endophytic Fungi Associated with Plant Organs
3:12
Preservation of Purified Fungal Isolates
4:01
Micromorphological Characterization (Hyphal Morphology) of Filamentous Fungi
5:10
Results: Isolation and Macromorphology Evaluation of Endophytic Fungi Associated with Mycoheterotrophic Plants
6:33
Conclusion
