Name: 菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-05-05T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: 学ぶ菌従属栄養植物の内生菌単離法。無菌培養と顕微鏡観察で菌類を同定し、Castellani法で保存します。植物組織から真菌を分離し、形態学的特徴でコロニーを評価する手法を解説します。

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著者は開示するものは何もなく、利益相反もありません。

植物サンプルの表面的な駆除は、提示されたプロトコルの最も重要な段階の1つです。最後の洗浄からの滴でPDA皿に汚染しないことが強く望まれます。内生菌が植物組織内でも一般的であることを考慮すると、細菌は隔離皿の汚染物質として頻繁に観察され、通常は空気中の胞子形成菌よりも多くなります3,11。したがって、臓器片を設置する際の培養液中の抗生物質の添加は必須である。異なる種類の抗生物質を組み合わせると、より良い結果が得られ、作用範囲が広がります。もう一つの重要な考慮事項は、PDAとAAを使用すると必然的に特定の種が選択され、他の種が好まれなくなるため、真菌の分離における本質的なバイアスです。他の培地の組み合わせは、そのような制限を排除するものではないが、バイアスを最小限に抑えることができるかもしれない9。
一般に、ペトリ皿で増殖しながら胞子を産生する真菌は、低温であろうとなかろうと、保存プロトコルにおいてより高い生存率を示し、非...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated from:
Juliana Lishcka Sampaio Mayer
to:
Juliana Lischka Sampaio Mayer

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/65135">Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

内生菌は、定義上、目立たない感染症で植物の器官や組織の内部に生息する菌類です(つまり、宿主に害を及ぼすことなく)1,2。これらの真菌は、宿主植物と中立的または有益に相互作用し、病原体や不利な環境条件に対する耐性を与え、植物にとって有益な化合物(成長因子やその他の植物ホルモンなど)の合成に寄与する可能性があります1,3。菌根内生菌は、植物と菌根の関連を確立し、栄養伝達に関与する真菌です4。ラン科では、菌根内生菌との相互作用は、大多数の種で種子の発芽、および科のすべての植物で苗の確立の基本です5。このような文脈では、菌従属栄養性のランは、菌根のパートナーに関する完全な依存の事例を表しており、ライフサイクル全体にわたってこれらの真菌によるミネラル栄養素と炭素化合物の移行に依存しています6。したがって、関連菌類の単離と同定は、菌従属栄養生物の生命戦略を研究する際の基本的な基盤となります。さらに、菌従属栄養植物における真菌エンドファイトの役割や、これらの真菌の実際の多様性についてはほとんど知られていません7,8。
内生菌類の調査は、伝統的に培養非依存性または依存性として説明されているさまざまな手法 を介して 実施できます:たとえば、(a)直接観察、(b)真菌の単離および形態学的および/または分子的同定、および(c)植物組織の全DNA抽出および分子同定9。直接観察(a)では、内生菌は、植物細胞や組織の内部にいる間に、光学顕微鏡または電子顕微鏡法9によって調査される可能性があり、さまざまな顕微鏡プロトコルがPena-Passosらによって詳述されています10。単離法(b)により、真菌エンドファイトは、そのコロニー、菌糸、および生殖または抵抗構造の形態に従って特徴付けることができます。また、単離技術 により 、DNA抽出、分子同定配列(バーコードまたは指紋)の増幅、およびシーケンシングによる単離株の分子同定を行うことが可能です11。後者の技術(c)は、植物組織の内部でDNA抽出(メタバーコーディング)を行い、その後にライブラリの調製とシーケンシングを行う12。
さらに、真菌分離株は、独立栄養または菌従属栄養性のランからの種子を使用して、共生発芽試験に適用できます。このような応用の一例は、Sistiらによって実施された調査であり13、菌従属栄養性のランである Pogoniopsis schenckiiの発芽と原生皮発生の初期段階を、非菌根性内生菌を含むその分離株のいくつかに関連して説明しています。適用された共生発芽プロトコルは、Pena-Passosらによるビデオで詳細に説明されています10。異なる植物器官と関連して真菌を単離することで、植物と真菌の相互作用の性質に関する多様な研究の焦点が可能になります(例えば、関連性の生態学的または生理学的側面のいずれかを理解するため、および真菌から植物への栄養素の移動に関する調査)9。
セクション1で提示された方法論は、地下臓器サンプルの収集に基づいており、これらの臓器は収集が最も困難であり、菌根内生菌がコロニーを形成するため、非常に興味深いものです。ただし、含まれている両方のプロトコル(ステップ1.1および1.2)は、他の菌従属栄養植物器官(例、根茎、花茎、および果実)に適用できます。ステップ1.1で説明した収集方法は、形態学的特性評価(セクション4および5)のための内生菌(セクション2)および/または分離株同定のための全DNA抽出(セクション6)に指定されています。一方、ステップ1.2で説明した収集方法は、メタバーコーディング技術(セクション7)のための植物組織の全DNA抽出にのみ割り当てられます。セクション3では、糸状菌の保存と保存のための4つの方法が提示されており、2つは短期保存(3〜6か月)に、他の2つは長期保存(&gt;1年)に適しています。形態学的特徴付け(セクション4および5)は、それを強化し、真菌のマクロおよびミクロモルフォロジーに関する重要な情報を提供するために、分子同定と関連している可能性があります。 図 1 は、以降に説明する集合的な方法論をまとめたものです。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65135/65135fig01.jpg"> 図1:提示された方法の概略図。植物の収集と真菌の分離、保存、および培養依存および非依存の方法論による分子同定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65135/65135fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>粘着テープ</td><td></td><td></td><td>(どの会社からでも、微細形態学的分析で粘着テープを取り付けるため)</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>シグマ-アルドリッチ</td><td>A5354</td><td>(植物片の取り付け用;他の抗生物質を使用することができます-ステップ2.2.1を確認してください)</td></tr><tr><td>オートクレーブ</td><td></td><td></td><td>(どの会社からでも、多くのステップで材料滅菌のために)</td></tr><tr><td>細菌寒天</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1296</td><td>(多くのステップ用)</td></tr><tr><td>C1、C2、C3、C4、C5、およびC6溶液</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoilキットと一緒に購入)</td></tr><tr><td>遠心分離機&nbsp;&nbsp;</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>5810 G</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>Merck</td><td></td><td>CLS430828</td><td>(サンプル収集用)</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2432</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>Congo red</td><td>Supelco</td><td>75768</td><td>(菌糸染色用)</td></tr><tr><td>Cryotubes</td><td>Merck</td><td>BR114831</td><td>(多くのステップ)</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Supelco</td><td>100983</td><td>適切な希釈を実施する必要があります（多くのステップのために</td></tr><tr><td>）エチレンジアミン四酢酸（EDTA）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3609</td><td>）(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>濾紙</td><td>Merck</td><td>WHA10010155</td><td>（(多くのステップ用)</td></tr><tr><td>ガラス試験管</td><td>Merck</td><td>CLS7082516</td><td>(未籾摺り米粒の凍結保存用)</td></tr><tr><td>グラスウール</td><td>Supelco</td><td>20411</td><td>(籾殻化米粒の凍結保存用)</td></tr><tr><td>グルコース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>またはデキストロース(バーミキュライト中の凍結保存用)</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>またはグリセリン(バーミキュライト中の凍結保存用、LPCBの調製用)</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>563935</td><td>(真菌からの全DNA抽出用)分離物)</td></tr><tr><td>乳酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252476</td><td>(LPCB-菌糸染色用)</td></tr><tr><td>ラクトフェノールブルー溶液(LPCB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>(菌糸染色用)</td></tr><tr><td>層流フード</td><td></td><td></td><td>(クラスI、任意の会社から、多くのステップ用)</td></tr><tr><td>光学顕微鏡</td><td></td><td></td><td>(任意の会社から、菌糸観察用)</td></tr><tr><td>MBスピンカラム</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoil キットと一緒に購入)</td></tr><tr><td>メチルブルー(コットンブルー)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5528</td><td>(LPCB - 菌糸染色用)</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(1.5 mL)</td><td>Merck</td><td>HS4323</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ(2 mL)</td><td>Merck</td><td>BR780546</td><td>(多くのステップ用)</td></tr><tr><td>鉱物油</td><td></td><td></td><td>(菌類分離物の保存用)</td></tr><tr><td>紙袋</td><td></td><td></td><td>平均サイズ 150 mm x 200 mm (サンプル収集用)</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (ガラス、120 mm x 20 mm)</td><td>Merck/Pyrex</td><td>SLW1480/10D</td><td>(オートクレーブ可能、菌類スライド培養用、より高いものを好む)</td></tr><tr><td>ペトリ皿 (ガラス、50 mm x 17 mm)</td><td>Merck/Aldrich</td><td>Z740618</td><td>(真菌分離物の精製用)。代替:ポリスチレン製ペトリ皿(滅菌済み、&γ;照射済み、非オートクレーブ可能)</td></tr><tr><td>ペトリ皿(ガラス、80 mm x 15 mm)</td><td>Merck/Brand</td><td>BR455732</td><td>(植物片の設置用)または:ポリスチレン製ペトリ皿(滅菌済み、&γ;照射済み、非オートクレーブ可能)</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1037</td><td>(真菌分離物からの全DNA抽出用、LPCBの調製用)</td></tr><tr><td>磁器モルタル</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>磁器製乳棒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247502</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>ジャガイモデキストロース寒天培地(PDA)</td><td>Millipore</td><td>P2182</td><td>(多くのステップ用)</td></tr><tr><td>PowerBead tubes</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(DNeasy PowerSoilキットと一緒に購入)</td></tr><tr><td>迅速な取り付けmedium (Entellan)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.0796</td><td>(菌類スライド培養用)</td></tr><tr><td>シリカゲル</td><td>Supelco</td><td>717185</td><td>(未皮皮米粒の凍結保存用)</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム(NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>ラウリル硫酸ナトリウム塩(全DNA抽出用)次</td></tr><tr><td>亜塩素酸ナトリウム(w / 2%活性塩素)(</td><td></td><td></td><td>市販品、表在性消毒用)</td></tr><tr><td>土壌DNA抽出キット(DNeasy PowerSoilキット)</td><td>Qiagen</td><td>12888-50</td><td>(植物器官からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>分光光度計 - Nanodrop 2000/2000c</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000CLAPTOP</td><td>(植物器官からの総DNA抽出用)</td></tr><tr><td>実体顕微鏡</td><td></td><td></td><td>(=解剖顕微鏡、任意の企業、マクロ形態学的分析用)</td></tr><tr><td>Tetracycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7660</td><td>(植物片の取り付け用)</td></tr><tr><td>Thermoblock</td><td>Merck/Eppendorf</td><td>EP5362000035</td><td>(または他社製)</td></tr><tr><td>組織ホモジナイザーおよび細胞溶解剤</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>2010 Geno/Grinder - Automated Tissue Homogenizer and Cell Lyzer (for total DNA extraction from plant organs)</td></tr><tr><td>Toluidine blue O</td><td>Sigma-Aldrich/Harleco</td><td>364-M</td> <td>(for hyphae staining)</td></tr><tr><td>Trehalose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9531</td><td>(for cryopreservation in vermiculite)</td></tr><tr><td>Tris Base Solution (Tris)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1699</td> <td>(for total DNA extraction from fungal isolates)</td></tr><tr><td>皮をむいた米粒</td><td></td><td></td><td>(凍結保存用)</td></tr><tr><td>U字型ガラス棒</td><td></td><td></td><td>(または適応 - 菌類スライド培養用のステップ5.4.1を確認してください)</td></tr><tr><td>バーミキュライト</td><td></td><td></td><td>微細粒度測定(バーミキュライトの凍結保存用)</td></tr><tr><td>ボルテックサー</td><td>シグマアルドリッチ/ベンチミキサー</td><td>BMSBV1000</td><td>(真菌分離株からの全DNA抽出用)</td></tr><tr><td>酵母抽出物</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y1625</td><td>(バーミキュライト凍結保存用)</td></tr></tbody></table>

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全dna抽出

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

菌従属栄養植物は、菌根依存の最も極端な形態の1つであり、独立栄養能力を完全に失っています。他の重要な資源と同様に、これらの植物が密接に関連している菌類は、彼らにとって不可欠です。したがって、菌従属栄養種の研究に最も関連性の高い技術のいくつかは、関連する真菌、特に根や地下器官に生息する真菌の調査を可能にするものです。これに関連して、文化依存性および培養非依存性の内生菌を同定する技術が一般的に適用される。真菌エンドファイトを単離することは、それらを形態学的に識別し、それらの多様性を分析し、ランの種子の共生発芽に応用するための接種を維持するための手段を提供します。しかし、植物組織に生息する非培養性真菌は多種多様であることが知られている。このように、培養に依存しない分子同定技術は、種の多様性と存在量をより広くカバーします。本稿は、文化依存型と独立型の2つの調査手順を開始するために必要な方法論的サポートを提供することを目的としています。培養依存性プロトコールに関しては、菌従属栄養植物の地下および空中器官からの糸状菌の単離、分離株の収集、スライド培養法による菌糸の形態学的特徴付け、および全DNA抽出による真菌の分子同定とともに、収集場所から実験室施設までの植物サンプルの収集と維持のプロセスが詳細に説明されています。培養に依存しない方法論を網羅する詳細な手順には、メタゲノム解析のための植物サンプルの収集や、市販のキットを使用したクロロフィル植物器官からの総DNA抽出が含まれます。最後に、連続性プロトコル(ポリメラーゼ連鎖反応[PCR]、シーケンシングなど)も分析に推奨されており、ここではその手法を紹介します。

分離プロトコルでは、最後の洗浄で使用した水からの汚染があり、その汚染が接種された断片を含むペトリ皿でも検出されることを考慮して、汚染物質の種類に応じて異なる措置が講じられる可能性があります(表1)。この手順は、増殖が加速する高度に胞子形成された真菌汚染物質、および選択した抗生物質に耐性のある激しく増殖する細菌の場合には、最初から繰り返す必要があります。代わりに、真菌汚染物質が成長が遅いか、胞子形成しない場合は、プロトコルの後続のステップでそれを分離することを避けることができます。最後に、ゆっくりと増殖する細菌株による汚染は、菌糸を回復させる際の後工程、特に精製においても容易に回避できる可能性があります。
以前に提示されたすべてのケースで、理想的なシナリオは、耐性菌が最初の皿を汚染した場合に、他のサンプルを使用して駆除手順をやり直し、他の抗生物質とより広い作用範囲を組み合わせた...

本稿では、植物関連内生菌の単離、分離株の長期保存、形態学的特性評価、およびその後の分子同定およびメタゲノム解析のための総DNA抽出のための詳細かつ適切なプロトコルを提供することを目的としています。

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...

ここで紹介する手法は、さまざまな植物器官に関連する内生菌群集を調査するのに役立ちます。内生菌の単離は、それらの同定を可能にし、共生発芽などの他の技術において貴重である。まず、1リットルあたり3ミリリットルの抗生物質を添加した8〜10センチメートルのPDA培地ペトリ皿を準備します。使用前にペトリ皿で36°Cで24時間培養して汚染を確認してください。翌日、標準的な手順で健康な菌従属栄養植物片を表面的に消毒し、滅菌ペトリ皿に入れます。サンプルの表面的な消毒の有効性を評価するには、PDAでサンプルを最後に洗浄する際に使用した数滴の蒸留水を接種します。次に、フレイムメスと鉗子を使用して、サンプルを0.2センチメートルの厚さに分割します。サンプルを切片化して、培地と接触する表面積を増幅します。抗生物質を添加したPDAプレートに、地下臓器の5つの断片を、皿の端に触れないようにできるだけ離して置きます。ペトリ皿をラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で5日間保管します。継代培養の前日に、1リットルあたり5〜7グラムのAA培地を使用して5センチメートルのシャーレを調製し、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートします。真菌分離株を精製するには、PDAプレートコロニーを色、増殖パターン、テクスチャー、およびマージンフォーマットで区別します。次に、皿の下側のコロニーの縁を区切ります。また、コロニーをコードで識別します。オートクレーブ処理した木製のつまようじの先端を使用して、同定された真菌コロニーの縁から少量の菌糸体を回収し、AAプレートに縞模様を付け、互いに1センチメートルの距離と皿の端に3つの線条を生成します。ステッカー紙と鉛筆を使用して、AAプレートに適切なコードでラベルを付けます。プレートを密封してから、摂氏25〜27度の暗闇で3日間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを注意深く観察して、個々のコロニーを形成する細かい菌糸を特定します。油性マーカーを使用して個々のコロニーの面積を区切ります。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用してコロニーを含む培地の一部を切断し、切断した体積を抗生物質なしで新しいPDAペトリプレートの中央に移します。ペトリ皿に分離株のコードをラベル付けした後、ラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で7〜14日間維持します。カステラーニ法で真菌分離株の保存を開始するには、オートクレーブ処理した2ミリリットルの微量遠心チューブに0.5ミリリットルの蒸留水を加えます。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用して、すでに増殖した精製分離株の菌糸体縁から0.5×0.5センチメートルの直方体培地を切り取ります。蒸留水を入れた微量遠心チューブに4〜6個の直方体を置きます。チューブは、摂氏25度の暗闇で必要な限り保管してください。必要に応じて、直方体を回収し、新しいPDAディッシュの中央に置いて、保存された分離株を成長させます。トルイジンブルーO染色剤を清潔なスライドガラスに一滴垂らすことから、いじめマウント法を開始します。このような技術では、さまざまな染色を使用できます。オートクレーブ処理したつまようじを使用して、成長した分離株から菌糸を慎重に取り除き、染みの滴に入れます。カバースリップを置き、光学顕微鏡で分析します。粘着テープの取り付け方法の場合は、清潔なスライドガラスにラクトフェノール綿の青い染みを一滴垂らします。透明な粘着テープをスライドガラスに合う大きさにカットし、中央の汚れが落ちます。粘着ストリップの粘着面を菌糸体表面に向け、菌糸を押したり集めすぎたりせずに、菌糸を集めてみてください。次に、テープをスライドガラスに貼り付け、汚れが収集した菌糸に接触していることを確認します。テープの上に水滴を置き、カバースリップを置いてから、スライドを光学顕微鏡で分析します。断片の内部から出現する糸状菌菌の菌糸体の小群の成長は、PDA培地に菌従属栄養植物器官断片を接種してから5日後に観察された。精製された分離株の接種の7〜14日間に、純粋な真菌分離株コロニーの遠心増殖がPDA上で観察され、唯一の円形菌糸体を形成しました。コンタミネーションの可能性は容易に特定され、培地中での増殖形態の様相、色、および色素産生に関するコロニーの均質性が損なわれました。菌従属栄養性のラン(Wullschlaegelia aphylla)の紡錘状の根から単離されたコロニーは不透明で、培地中に拡散性の色素や滲出液はありませんでした。コロニーは上側が白っぽく灰色で、下側が茶色がかっていました。菌糸体は空中で豊富で、縁は不規則で空中でした。コロニーはビロードのような質感で、巨視的な構造のないしわだらけの地形でした。真菌の菌糸体をラクトフェノール綿青とトルイジンブルー-Oで染色すると、染色されていない菌糸体では見えにくかった構造が示され、同定が容易になりました。ここで紹介する真菌単離法は、真菌エンドファイトを同定するために緑色植物にも適用できます。単離された真菌は、共生発芽試験に使用できます。

isolation-characterization-total-dna-extraction-to-identify

Research

JoVE Journal

Biology

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学ぶ菌従属栄養植物の内生菌単離法。無菌培養と顕微鏡観察で菌類を同定し、Castellani法で保存します。植物組織から真菌を分離し、形態学的特徴でコロニーを評価する手法を解説します。

菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

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