菌従属栄養植物における内生菌を同定するための単離、特性評価、および全DNA抽出

ここで紹介する手法は、さまざまな植物器官に関連する内生菌群集を調査するのに役立ちます。内生菌の単離は、それらの同定を可能にし、共生発芽などの他の技術において貴重である。まず、1リットルあたり3ミリリットルの抗生物質を添加した8〜10センチメートルのPDA培地ペトリ皿を準備します。

使用前にペトリ皿で36°Cで24時間培養して汚染を確認してください。翌日、標準的な手順で健康な菌従属栄養植物片を表面的に消毒し、滅菌ペトリ皿に入れます。サンプルの表面的な消毒の有効性を評価するには、PDAでサンプルを最後に洗浄する際に使用した数滴の蒸留水を接種します。

次に、フレイムメスと鉗子を使用して、サンプルを0.2センチメートルの厚さに分割します。サンプルを切片化して、培地と接触する表面積を増幅します。抗生物質を添加したPDAプレートに、地下臓器の5つの断片を、皿の端に触れないようにできるだけ離して置きます。

ペトリ皿をラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で5日間保管します。継代培養の前日に、1リットルあたり5〜7グラムのAA培地を使用して5センチメートルのシャーレを調製し、プレートを摂氏36度で24時間インキュベートします。真菌分離株を精製するには、PDAプレートコロニーを色、増殖パターン、テクスチャー、およびマージンフォーマットで区別します。

次に、皿の下側のコロニーの縁を区切ります。また、コロニーをコードで識別します。オートクレーブ処理した木製のつまようじの先端を使用して、同定された真菌コロニーの縁から少量の菌糸体を回収し、AAプレートに縞模様を付け、互いに1センチメートルの距離と皿の端に3つの線条を生成します。

ステッカー紙と鉛筆を使用して、AAプレートに適切なコードでラベルを付けます。プレートを密封してから、摂氏25〜27度の暗闇で3日間インキュベートします。インキュベーション後、プレートを注意深く観察して、個々のコロニーを形成する細かい菌糸を特定します。

油性マーカーを使用して個々のコロニーの面積を区切ります。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用してコロニーを含む培地の一部を切断し、切断した体積を抗生物質なしで新しいPDAペトリプレートの中央に移します。ペトリ皿に分離株のコードをラベル付けした後、ラップフィルムで密封し、摂氏25〜27度の暗闇で7〜14日間維持します。

カステラーニ法で真菌分離株の保存を開始するには、オートクレーブ処理した2ミリリットルの微量遠心チューブに0.5ミリリットルの蒸留水を加えます。オートクレーブ滅菌したつまようじを使用して、すでに増殖した精製分離株の菌糸体縁から0.5×0.5センチメートルの直方体培地を切り取ります。蒸留水を入れた微量遠心チューブに4〜6個の直方体を置きます。

チューブは、摂氏25度の暗闇で必要な限り保管してください。必要に応じて、直方体を回収し、新しいPDAディッシュの中央に置いて、保存された分離株を成長させます。トルイジンブルーO染色剤を清潔なスライドガラスに一滴垂らすことから、いじめマウント法を開始します。

このような技術では、さまざまな染色を使用できます。オートクレーブ処理したつまようじを使用して、成長した分離株から菌糸を慎重に取り除き、染みの滴に入れます。カバースリップを置き、光学顕微鏡で分析します。

粘着テープの取り付け方法の場合は、清潔なスライドガラスにラクトフェノール綿の青い染みを一滴垂らします。透明な粘着テープをスライドガラスに合う大きさにカットし、中央の汚れが落ちます。粘着ストリップの粘着面を菌糸体表面に向け、菌糸を押したり集めすぎたりせずに、菌糸を集めてみてください。

次に、テープをスライドガラスに貼り付け、汚れが収集した菌糸に接触していることを確認します。テープの上に水滴を置き、カバースリップを置いてから、スライドを光学顕微鏡で分析します。断片の内部から出現する糸状菌菌の菌糸体の小群の成長は、PDA培地に菌従属栄養植物器官断片を接種してから5日後に観察された。

精製された分離株の接種の7〜14日間に、純粋な真菌分離株コロニーの遠心増殖がPDA上で観察され、唯一の円形菌糸体を形成しました。コンタミネーションの可能性は容易に特定され、培地中での増殖形態の様相、色、および色素産生に関するコロニーの均質性が損なわれました。菌従属栄養性のラン(Wullschlaegelia aphylla)の紡錘状の根から単離されたコロニーは不透明で、培地中に拡散性の色素や滲出液はありませんでした。

コロニーは上側が白っぽく灰色で、下側が茶色がかっていました。菌糸体は空中で豊富で、縁は不規則で空中でした。コロニーはビロードのような質感で、巨視的な構造のないしわだらけの地形でした。

真菌の菌糸体をラクトフェノール綿青とトルイジンブルー-Oで染色すると、染色されていない菌糸体では見えにくかった構造が示され、同定が容易になりました。ここで紹介する真菌単離法は、真菌エンドファイトを同定するために緑色植物にも適用できます。単離された真菌は、共生発芽試験に使用できます。