Name: 単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 47 s
Description: 学ぶエンドリソソームパッチクランプ技術による細胞内小胞のイオンチャネル活性の直接測定法。従来の電気生理学手法では不可能だったエンドリソソーム膜からの記録を実現し、神経変性疾患や代謝障害の研究に応用できます。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Cullen, P. J., Steinberg, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+degrade+or+not+to+degrade%3A+mechanisms+and+significance+of+endocytic+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">To degrade or not to degrade: mechanisms and significance of endocytic recycling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 19 (11), 679-696 (2018).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annu Rev Physiol. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Kumar, P., Kumar, D., Jha, S. K., Jha, N. K., Ambasta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+channels+in+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Protein+Chem+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Ion channels in neurological disorders.</a> Adv Protein Chem Struct Biol. 103, 97-136 (2016).</li>
<li>Brailoiu, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+deuterostome+family+of+two-pore+channels+mediates+nicotinic+acid+adenine+dinucleotide+phosphate-dependent+calcium+release+from+acidic+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">An ancestral deuterostome family of two-pore channels mediates nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate-dependent calcium release from acidic organelles.</a> J Biol Chem. 285 (5), 2897-2901 (2010).</li>
<li>Pitt, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TPC2+is+a+novel+NAADP-sensitive+Ca2%2B+release+channel%2C+operating+as+a+dual+sensor+of+luminal+pH+and+Ca2%2B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">TPC2 is a novel NAADP-sensitive Ca2+ release channel, operating as a dual sensor of luminal pH and Ca2+.</a> J Biol Chem. 285 (45), 35039-35046 (2010).</li>
<li>Gerndt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agonist-mediated+switching+of+ion+selectivity+in+TPC2+differentially+promotes+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Agonist-mediated switching of ion selectivity in TPC2 differentially promotes lysosomal function.</a> Elife. 9, e54712(2020).</li>
<li>She, J., Guo, J., Jiang, Y. Structure and function of plant and mammalian TPC channels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShe%2C+J+%22Endolysosomal+voltage-dependent+cation+channels%22">Endolysosomal voltage-dependent cation channels</a>. Wahl-Schott, C., Biel, M. , Springer. Cham. 155-180 (2023).</li>
<li>Hu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parkinson%27s+disease-risk+protein+TMEM175+is+a+proton-activated+proton+channel+in+lysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Parkinson's disease-risk protein TMEM175 is a proton-activated proton channel in lysosomes.</a> Cell. 185 (13), 2292-2308.e20 (2022).</li>
<li>Grimm, C., Bartel, K., Vollmar, A. M., Biel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endolysosomal+cation+channels+and+cancer%3A+A+link+with+great+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Endolysosomal cation channels and cancer: A link with great potential.</a> Pharmaceuticals (Basel). 11 (1), 4(2018).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Ion+and+molecule+transport+in+lysosomes%22">Ion and molecule transport in lysosomes</a>. Gasnier, B., Zhu, M. X. , 1st ed, CRC Press. (2020).</li>
<li>Hernández-Ochoa, E. O., Schneider, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage+clamp+methods+for+the+study+of+membrane+currents+and+SR+Ca2%2B+release+in+adult+skeletal+muscle+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Biophys+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Voltage clamp methods for the study of membrane currents and SR Ca2+ release in adult skeletal muscle fibres.</a> Prog Biophys Mol Biol. 108 (3), 98-118 (2012).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch-clamp+technique+to+characterize+ion+channels+in+enlarged+individual+endolysosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Patch-clamp technique to characterize ion channels in enlarged individual endolysosomes.</a> Nat Protoc. 12 (8), 1639-1658 (2017).</li>
<li>Chen, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+for+early+endosome-specific+patch+clamping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules for early endosome-specific patch clamping.</a> Cell Chem Biol. 24 (7), 907-916.e4 (2017).</li>
<li>Cang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTOR+regulates+lysosomal+ATP-sensitive+two-pore+Na%2B+channels+to+adapt+to+metabolic+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTOR regulates lysosomal ATP-sensitive two-pore Na+ channels to adapt to metabolic state.</a> Cell. 152 (4), 778-790 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ホウケイ酸ガラス</td><td>製サッター装置</td><td>BF150-75-10</td><td>外径:1.5mm、内径0.75mm 長さ10cm、フィラメント付き</td></tr><tr><td>Digidata 1140A</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 IX73</td><td>OLYMPUS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MODEL P-97 マイクロピペットプーラー</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPC-200</td><td>SUTTER INSTRUMENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MultiClamp 700B</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>POLISHER</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>クイックリリースチャンバー</td><td>Warner instruments</td><td>641943</td><td>QR-40LP, for 25 mm Coverslips</td></tr></tbody></table>

単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術

Patch-Clamp Techniques for Single Endolysosomal Vesicle Analysis

エンドリソソームパッチクランプ実験中に観察された現在の形状について、以下に記載します。現在の形状が予想どおりでない場合は、接触不良または漏れが原因である可能性があります。参照電極が浴液と完全に接触していない場合、またはピペット電極が破損しそうな場合、接触不良が発生する可能性があります。チャンバーとカバーガラスの間に隙間があり、流体が対物レンズまたはステージに流れ込むと、漏れが発生する可能性があります。ピペット溶液が多すぎたり少なすぎたりすると、このような異常が発生する可能性があります。
溶液への針の挿入/細胞表面/ZAPとの針接触 リソソーム付着モードの確立(ギガシール形成)の間、電流応答は急速に減少します。シール抵抗は、コマンド電圧を低残電流量で割ることによって決定できます(図7)。
ランプ/リーク -100mVから+100mVの範囲の連続入力電圧を繰り返し印加すると、...

Endolysosomal ion channels are critical for endolysosomal ion and pH homeostasis, membrane potential regulation, and vesicle trafficking. However, ...

patch-clamp-techniques-for-single-endolysosomal-vesicle-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ラット脳からF1FO ATP合成酵素複合体に富む亜ミトコンドリアの小胞を単離する方法が記載されている。これらの小胞はパッチクランプ記録の技術を使用してF1FO...

<sub&gt; 1</sub&gt; F<sub&gt; O</sub亜ミトコンドリアの小胞膜のパッチクランプ記録を実行するための&gt; ATPアーゼ小胞の準備とテクニック

定義されている物の巨大リポソームに機能的な膜タンパク質を再構成すると、パッチクランプ電気生理学と組み合わせた強力なアプローチである。しかし、従来の巨大リポソーム生産は、タンパク質の安定性と互換性がないかもしれません。私たちは純粋な脂質やイオンチャネルを含む小さなリポソームから巨大リポソームを製造するためのプロトコルを記述します。...

イメージングとパッチクランプ電気生理学用ジャイアントリポソーム製剤

クラスリン媒介性エンドサイトーシスは、シグナル伝達受容体を含む多くのタンパク質を内部化する急速で非常に動的なプロセスです。ここで説明するプロトコルは、個々のエンドサイトーシスイベントの動態を直接視覚化します。これは、エンドサイトーシス機構のコアメンバーがどのように互いに協調し、タンパク質カーゴがこのプロセスにどのように影響するかを理解するために不可欠です。...

TIRF顕微鏡を経由してシングルイベント解像度のGタンパク質共役型受容体のクラスリン依存性エンドサイトーシスの可視化

電鋳し、ゲル支援腫れ - 巨人層小胞（GUVs）に貫通タンパク質、KvAPの再構成は、2脱水 - 再水和法について実証されている。両方の方法では、タンパク質を含む小さな単層小胞を蛍光顕微鏡法およびパッチクランプ電気生理学によって研究することができるGUVsを形成するために一緒に融合される。...

膜貫通タンパク質の再構成、顕微鏡およびパッチクランプ研究のための巨大単膜小胞への電位依存性イオンチャネル、KvAP、

プロテオリポソームは、明確に定義された生化学的環境で再構成された精製チャネルとトランスポーターを研究するために使用されます。これらのタンパク質によって媒介される排出を測定するための実験的手順が示されています。プロテオリポソームを調製し、記録を行い、再構成されたタンパク質の機能特性を定量的に決定するためのデータを分析するための手順について説明します。...

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

特定のタンパク質の役割や突然変異の影響について、しばしば重要な洞察を得ることができます。この論文では、定量的蛍光顕微鏡法とフローサイトメトリーを使用して、生細胞のエンドサイトーシスイベントを定量化するためのツールとして、pH感受性GFPバリアントである超黄道pHluorinを使用する方法を示します。...

出芽酵母におけるエンドサイトーシスの定量的、動力学的およびハイスループット分析のためのpHluorinの応用

光顕微鏡によるシナプス小胞タンパク質と融合した 1p-169...

培養海馬神経細胞のシナプス小胞エンドサイトーシスを測定

単一鎖両親媒性分子を含むリポソーム、特に脂肪酸、一本鎖両親媒性分子のユニークな化学的性質によるこれらの含まれている diacylphospholipids...

準備、精製、および脂肪酸含有リポソームを用いる

ここでは、連絡先バブル膜法を用いた脂質膜の形成のためのプロトコルを提案する.有機溶媒、油水界面単分子層を形成するという水のバブルが吹かれます。2...

パッチ取り付けの連絡先バブル膜脂質二分子膜実験

ここでは、変形性関節症のモデルとして使用される軟骨外植の移動および取り込みをモニタリングするために、血小板リセート由来の細胞外小胞にラベルを付けるプロトコルを提示する。...

軟骨外植木における移動と取り込みモニタリングのための細胞外小胞の標識

学ぶエンドリソソームパッチクランプ技術による細胞内小胞のイオンチャネル活性の直接測定法。従来の電気生理学手法では不可能だったエンドリソソーム膜からの記録を実現し、神経変性疾患や代謝障害の研究に応用できます。

単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術

さらに動画を探す