単一エンドリソソーム小胞分析のためのパッチクランプ技術

エンドリソソームコンパートメントは、細胞内で最小のオルガネラです。従来の電気生理学的手法では、電圧と電流の変化を直接測定することはできません。エンドリソソームパッチクランプ技術により、直接記録が可能になり、イオンチャネルで以前に研究することができました。

実験上の大きな課題は、すべての化合物がリソソームを効果的に拡大するわけではないということです。適切な細胞を同定することは困難であり、理想的なリソソームであっても、イオンチャネルの記録が成功する保証はありません。私たちは、エンドリソソーム膜からの直接の電気生理学的記録を可能にするエンドリソソームパッチクランプ技術を開発しました。

このブレークスルーにより、TRPMLやTPCなどのイオンチャネルの特性を明らかにすることができ、病原体の防御、ニューロンの変性、代謝障害におけるそれらの役割を明らかにすることができました。私たちの方法は、リソソームイオンチャネルの直接記録を可能にし、全細胞パッチクランプサイズの制限を克服し、蛍光ベースの技術を統合しながら小胞選択を改善します。まず、キャピラリーチューブを極体に取り付けます。

キーパッドの緑色のプルボタンを押します。クランプノブを緩め、引っ張ったピペットを極性から取り外します。次に、プルパッチピペットをMicroforgeホルダーに入れます。

35倍の対物レンズと15倍の接眼レンズを組み合わせてピペットチップを検査し、合計倍率を525倍にします。マイクロマニピュレーターを使用して、パッチピペットをフィラメントに近づけます。温度ダイヤルを 80 に設定します。

ヒーターがオンになったら、フットスイッチを1〜2秒間押し続けて、短時間の熱パルスを適用します。研磨後、ほこりの混入を防ぐために、研磨したピペットを密閉された箱に入れます。チャンバーに1ミリリットルの入浴液を追加します。

処理したHEK 293セルのカバースリップを24ウェルプレートから取り出します。カバースリップを顕微鏡チャンバーに移します。自家製のプラスチック製充填針を使用して、アイソレーションピペットにピペット溶液を充填します。

充填されたピペットをパッチクランプセットアップのフロントエンドに取り付けます。40倍対物レンズと10倍接眼レンズを備えた顕微鏡下で、分離ピペットを十分に拡大したエンドソームまたはリソソームに近づけます。マイクロマニピュレーターを使用して、アイソレーションピペットを原形質膜の端に触れるまで下げます。

ピペットをすばやく動かして、メンブレンの小さな部分を引きちぎります。同じピペットを使用して、細胞を反対側から押して、細胞から約2マイクロメートルのエンドソーム/リソソームを絞り出します。磨きたてのパッチピペットに適切なピペット溶液を入れます。

ピペットを前端に取り付けます amplifier。ピペットに20〜50ミリバールの正圧を加え、バルブをロックしてピペットを維持します。次に、ピペットの先端をバス溶液に移動し、視野の中央に配置します。

電流パルスを繰り返し印加して、ピペット抵抗、シール抵抗、および直列抵抗を決定します。ピペットチップのサイズ、シール形成、およびエンドリソソーム全体の構成の確立を監視します。ピペットをターゲット小胞の上部にすばやく近づけます。

ピペットからの流体の流れにより小胞が移動または転がるのを観察します。オフセットボリュームを調整しますtageピペットのゼロミリボルト。すぐに正圧を解除して小胞をピペットに引き寄せ、1秒以内にギガシールを形成します。

小胞全体の記録には、2〜5ミリ秒の高電圧短パルスを使用して、ピペットとオルガネラの間の接触点でメンブレンを破壊します。電圧を500〜1000ミリボルトに設定します。電流を記録するには、幅広い入力電圧を使用してエンドリソソーム電圧クランプ実験を行い、膜の特性を評価します。

ギガシール形成中、電流応答は急速に減少し、リソソーム付着モードの確立が成功したことを示しています。連続的な入力電圧を繰り返し印加すると、エンドリソソーム膜全体に電流が記録され、基礎電流、アゴニスト活性化電流、および漏れ電流が示されました。