Name: ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: 学ぶ無細胞ドットブロット法によるヒトおよび動物血清中の抗体応答検出技術。低リソース環境で迅速に新興感染症に適応可能な、低コストで実用的なイムノアッセイプラットフォームの構築方法を解説します。

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<ol><li>Carter, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+techniques+and+test+development+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis.</a> ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).</li>
<li>Amanat, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serological+assay+to+detect+SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A serological assay to detect SARS-CoV-2 seroconversion in humans.</a> Nat Med. 26 (7), 1033-1036 (2020).</li>
<li>Stadlbauer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SARS-CoV-2+seroconversion+in+humans%3A+A+detailed+protocol+for+a+serological+assay%2C+antigen+production%2C+and+test+setup%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">SARS-CoV-2 seroconversion in humans: A detailed protocol for a serological assay, antigen production, and test setup.</a> Curr Protoc Microbiol. 57 (1), e100(2020).</li>
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<li>Norouzi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+dot+blot%3A+an+ultra-low-cost+and+practical+immunoassay+platform+for+detection+of+anti-SARS-CoV-2+antibodies+in+human+and+animal+sera%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Cell-free dot blot: an ultra-low-cost and practical immunoassay platform for detection of anti-SARS-CoV-2 antibodies in human and animal sera.</a> Microbiol Spectr. 11 (2), e0245722(2023).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
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<li>Mruk, D. D., Cheng, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+chemiluminescence+%28ECL%29+for+routine+immunoblotting%5BTitle%5D)+AND+%22Spermatogenesis%22%5BJournal%5D)">Enhanced chemiluminescence (ECL) for routine immunoblotting.</a> Spermatogenesis. 1, 121-122 (2011).</li>
<li>Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli-based+cell-free+protein+synthesis%3A+Protocols+for+a+robust%2C+flexible%2C+and+accessible+platform+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology.</a> J Vis Exp. (144), (2019).</li>
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<li>Gong, F., Wei, H., Li, Q., Liu, L., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+and+comparison+of+serological+methods+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Evaluation and comparison of serological methods for COVID-19 diagnosis.</a> Front Mol Biosci. 8, 682405(2021).</li>
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<li>Smith, M. T., Berkheimer, S. D., Werner, C. J., Bundy, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+Escherichia+coli-based+cell-free+systems+for+robust%2C+high-density%2C+long-term+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Lyophilized Escherichia coli-based cell-free systems for robust, high-density, long-term storage.</a> Biotechniques. 56 (4), 186-193 (2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb DNAラダー</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>アガロースゲルのサイズマーカーとして使用</td></tr><tr><td>20</td>アミノ酸 <td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>無細胞反応液B</td></tr><tr><td>の成分 B 2 mm 生検パンチ&nbsp;</td><td>インテグラミルテックス&nbsp;</td><td>33-31-P/25</td><td>CFDBマスターグリッド5</td></tr><tr><td>-アミノレブリン酸塩酸塩の調製用&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>SpyCatcher2-Apex2 アガロース粉末の誘導用ヘム前駆体</td></tr><tr><td></td><td>BioShop</td><td>AGA002</td> DNA抗SARS-CoV2-ヌクレオカプシド抗体<td>の電気泳動分析用</td></tr><tr><td></td><td>Sinobiological</td><td>40588-T62</td><td>無細胞産生NP抗原のWB検出用</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp;XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A</td><td>ゲルイメージャー装置</td></tr><tr><td>遠心濃縮器</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>タンパク質の濃縮およびバッファー交換用</td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>細菌培養</td></tr><tr><td>コエンザイムの採取用&nbsp;ナトリウム塩水和物(CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>無細胞反応の成分 溶液A</td></tr><tr><td>カラー染色済みタンパク質標準品(広範囲)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>SDS-PAGEゲルのサイズマーカーとして使用</td></tr><tr><td>Covid-19血清パネル</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>CFDB試薬/条件</td></tr><tr><td>の検証と最適化のための事前特性評価血清D-(&マイナス;)-3-ホスホグリセリン酸二ナトリウム塩(3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>無細胞反応溶液Bの成分</td></tr><tr><td>ジチオスレイトール(DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>バッファーの成分</td></tr><tr><td>大腸菌 5-α</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>プラスミド調製用</td></tr><tr><td>大腸菌 BL21&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>無細胞ライセートの調製に</td></tr><tr><td>大腸菌 BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>SpyCatcher2-Apex2の表現用</td></tr><tr><td>EDTAフリープロテアーゼ阻害剤錠剤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>大腸菌溶解バッファーEppendorfのA成分</td></tr><tr><td>&nbsp;ニューブランズウィック州&nbsp;Innova 43/43R インキュベーター シェーカー</td><td>エッペンドルフ</td><td>EPM1320</td><td>タンパク質発現および無細胞溶解物調製のための大腸菌細胞の増殖用インキュベーター</td></tr><tr><td>フォリン酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>無細胞反応溶液の成分</td></tr><tr><td>A グリセロール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>SpyCatcher2-Apex2 保存バッファーの成分</td></tr><tr><td>ヘミンクロリド&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>H9039&nbsp;</td><td>SpyCatcher2-Apex2のヘム補給に</td></tr><tr><td>過酸化水素 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>ECL 試薬作成用</td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>Software for ChemiDoc gel&nbsp; イメージング機器</td></tr><tr><td>イソプロピル-b-D-1-チオガラクトピラノシド&nbsp;</td><td>BioShop</td><td>IPT001</td><td>SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>カナマイシン硫酸塩</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>SpyCatcher2-Apex2 細菌培養</td></tr><tr><td>LB 寒天</td>培地の調製用 <td>BioShop</td><td>LBL406</td><td>大腸菌増殖用</td></tr><tr><td>LBブロス</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>大腸菌増殖</td></tr><tr><td>用 ルミノール&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>ECL試薬作成用</td></tr><tr><td>リゾチーム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>細菌細胞の溶解用</td></tr><tr><td>酢酸マグネシウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>無細胞反応液B</td></tr><tr><td>NEBExpress Ni樹脂の成分&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>無脂肪粉ミルク</td>の精製用 <td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>WBおよびCFDB膜のブロッキング用</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>CFDBブロットのECLインキュベーション用</td></tr><tr><td>p-クマル酸&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>ECL試薬</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2プラスミド</td><td>Pardee Laboratory</td><td>N/A</td>の<td>発現に使用 SpyCatcher2-Apex2タンパク質</td></tr><tr><td>シャー</td>レ <td>フィッシャーブランド</td><td>FB0875712</td><td>WBおよびCFDB膜インキュベーション用容器&nbsp;</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>緩衝液の成分</td></tr><tr><td>グルタミン酸カリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>無細胞反応のA成分 溶液B</td></tr><tr><td>シュウ酸カリウム一水和物(シュウ酸)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>無細胞反応の成分 溶液A</td></tr><tr><td>プレキャストSDS-PAGEゲル</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>タンパク質</td></tr><tr><td>Q5ハイフィデリティDNAポリメラーゼ</td>の電気泳動分析用&nbsp;<td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>LETのPCR増幅に</td></tr><tr><td>QIAquick PCR精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>LETsの精製用</td></tr><tr><td>リボヌクレオチド溶液セット</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>無細胞反応の成分 溶液A</td></tr><tr><td>スキム粉乳</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>ウェスタンブロットおよびCFDB塩化ナトリウムのブロッキング剤として使用</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>タンパク質精製バッファーの成分</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>細菌細胞の溶解用</td></tr><tr><td>スペルミジン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>無細胞反応の成分 溶液A</td></tr><tr><td>シリンジフィルター</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>バッファーおよび溶液の滅菌用</td></tr><tr><td>サーモサイクラー</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>PCR反応のインキュベーション用機器</td></tr><tr><td>RNA(tRNA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>無細胞反応溶液A</td></tr><tr><td>トリス緩衝生理食塩水</td><td>Thermo Scientific</td><td>J60764の成分。WB</td><td>およびCFDB洗浄バッファーの</td>K2コンポーネント</tr><tr><td>Trizmaベース</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>トリスバッファー作成用</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 ハーフバッフルシェイクフラスコ、2.5L</td><td>コールパーマー</td><td>RK-01835-39</td><td>タンパク質発現および無細胞溶解液調製のための大腸菌細胞増殖用容器</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>WBおよびCFDB洗浄バッファーの成分</td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>CFDB NC膜</td></tr><tr><td>UV-Vis分光光度計</td>の取り扱い用 <td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>核酸およびDNA濃度の測定と細菌培養に使用 抗</td></tr><tr><td>SARS-CoV-2免疫グルブリンのOD WHO国際リファレンスパネル</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>CFDB試薬/条件</td></tr><tr><td>の検証と最適化のための事前特性評価血清&β;-ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド水和物(NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>無細胞反応溶液AのA成分</td></tr></tbody></table>

ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

標的抗原の直鎖状発現テンプレートのPCR増幅 SARS-CoV-2 NP LETをPCR増幅するために、プロトコルセクション1.2に記載されているようにユニバーサルTerフォワードプライマーとリバースプライマーを使用し、PCR産物の精製に進む前に、製品の1μLをアガロースゲル(図4)でチェックしました。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67973/67973fig04.jpg"> 
図4:線状発現テンプレートのPCR。 Lane 1:1 kb DNA LadderおよびLane 2:His-SpyTag-SARS-CoV-2 NP(1,630 bp)のPCR増幅直鎖状DNAテンプレートを示す1%アガロースゲル。略語:...

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