ヒトおよび動物の血清中の抗体応答を検出するための実用的で適応性の高いイムノアッセイプラットフォームとしての無細胞ドットブロット

このプロトコルは、COVID-19のパンデミックに対応して開発された、適応性があり、アクセスしやすく、手頃な価格のイムノアッセイプラットフォームである無細胞ドット血液技術を示しています。既存のゴールドスタンダードのイムノアッセイ法には、ELISA法とラテラルフローアッセイのバリエーションがあります。スプリット報告タンパク質、電気化学的界面、コロイド状ナノ粒子などの技術を用いた新しいイムノアッセイの開発には、大きな関心が寄せられています。

課題は、ゴールドスタンダードのイムノアッセイのほとんどが、高価で洗練された分子コンポーネントや機器に依存しているため、非中央集権的なコミュニティがアクセスできないことです。この新しいCFDBイムノアッセイ技術は、新たなアウトブレイクに迅速に適応することができます。基本的な実験装置を使用し、自社で低資源環境で製造できる分子成分に完全に依存しています。

まず、UniProtデータベースからアクセッションコードP0DTC9を使用してタンパク質配列を取得します。IDT code on optimizationツールを使用して、ecoliベースの発現のシーケンスを最適化します。最適化された配列を発現コンストラクトバックボーンのSnapGeneテンプレートに挿入してから、水に再懸濁した一本鎖DNAフラグメントとして商業合成用に最適化された配列を注文します。

PCRチューブ内のecoli BL21無細胞反応に10%PCR産物を添加することにより、最初の5マイクロリットルスケールの発現試験を実施します。反応を摂氏30度で15時間振とうせずにインキュベートします。ヌクレオカプシドタンパク質またはNP抗原の発現品質を評価するには、12%SDSページゲルに1マイクロリットルの無細胞反応をロードし、ウェスタンブロット用のニトロセルロースメンブレンに移します。

15ナノモル精製線状発現テンプレート製品を使用して、1ミリリットルスケールの無細胞反応を組み立て、無細胞ドットブロットアッセイ 15ミリリットルの円錐管内で発現混合物をインキュベートし、80RPMで30°Cで15時間振とうします。ウェスタンブロットを使用して発現品質を評価し、発現混合物を50マイクロリットル分注した後、分注液を摂氏マイナス20度で保存します。図のように、96ウェルプレートのスポッティング能力に一致するように設計された直径2mmの直径を持つ12 x 12個の円を含む6 x 6センチメートルのパターンを特徴とするマスターグリッド画像を使用します。

マスターグリッドを印刷した後、印刷されたグリッドを2層の粘着性PCRプレート天井フィルムの間にしっかりと挟み、サンドイッチを外側のグリッド境界に沿ってサイズにカットします。2ミリメートルの生検パンチを使用して、グリッド上のマークされた各円を中抜きにします。6.5 x 6.5 cmのニトロセルロースメンブレンをカットし、マスターグリッドの下のきれいな面に置き、粘着テープで固定します。

マーカーペンを使用して、サンプルスポッティング後にメンブレンを切断するためのガイドとして使用するニトロセルロースメンブレンの最も外側の円の位置をマークします。血清サンプルをPBSで1〜10希釈します。マイクロピペットを使用して、各サンプルの0.4マイクロリットルをニトロセルロースメンブレンの所定のグリッド位置に3倍分注します。

斑点のあるサンプルを結合させ、周囲温度で10分間乾燥させます。ピンセットを使用して、ニトロセルロース膜を慎重に取り出し、マークされた外側の円に沿って切断します。メンブレンを10ミリリットルのブロッキング溶液が入った10センチメートルのシャーレに移します。

100 RPMで穏やかに振とうしながら、室温で30分間インキュベートします。無細胞抗原発現混合物の50マイクロリットルのアリコートを冷凍庫から取り出し、解凍後、10センチメートルのシャーレで5ミリリットルのブロッキング溶液に加えます。メンブレンをこの抗原含有溶液に直接移し、室温で1時間インキュベートし、100 RPMで振とうします。

1時間後、0.05%Tween 20を含むTBSTでメンブレンをすすぎ、洗浄します。次に、精製されたSpyCatcherの1ミリリットルあたり10マイクログラムを含むブロッキングバッファー10ミリリットル、2つの頂点、2つのタンパク質をメンブレンに加え、SpyCatcherアペックスを含むディッシュにメンブレンを置きます。100 RPMで振とうしながら1時間インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水またはTBSでメンブレンをすすぎた後、TBSTで5分間2回洗浄し、その後TBSで最終すすぎます。

ブロットイメージング装置の近くの清潔な作業面にパラフィルムを貼り付けて固定します。メンブレンを軽くたたいてピンセットを使用して余分な液体を取り除き、パラフィルムの上に置きます。すぐに3ミリリットルの増強化学発光溶液またはECL溶液をメンブレンの上に加え、室温で正確に90秒間インキュベートします。

メンブレンをタップ乾燥させた後、化学発光適合イメージング装置に移します。装置の画像解析機能を使用して、ニトロセルロース膜上の3つのブランク位置を含むスポット強度を取得します。スポットあたりの測定量を一定に保ちます。

データをスプレッドシートにエクスポートして、各スポット位置に正しくラベルが付けられていることを確認します。3 重のスポット強度の平均と標準偏差を計算します。すべてのサンプル測定値からニトロセルロース膜のバックグラウンドを差し引きます。

次に、指定された方程式を使用して、正または否定的な結果を解釈するためのカットオフ値を取得します。最後に、カットオフ減算されたデータを棒グラフにプロットします。事前に特徴付けられた市販のヒトSarahに対して無細胞ドットブロットアッセイを実施し、ブロットの画像と対応するシグナル強度チャートをこの図に示します。

無細胞ドットブロットアッセイにより、すべてのネガティブコントロールサンプルと最もポジティブなサンプルを同定することに成功しました。国立微生物学研究所での無細胞ドットブロットアッセイの独立した試験では、12の陰性および12の陽性患者サンプルすべてが正しく同定され、その堅牢性が確認されました。無細胞ドットブロットアッセイでは、SARS-CoV-2に感染したハムスターのサラの抗体応答も検出され、再感染の5日後に採取された感染後サンプル24個中18個で陽性のシグナルが観察され、感染前のサンプルはすべて陰性のままでした。