体性感覚ニューロンにおける神経膜プロテアソームの細胞サブタイプ特異的解析

私たちは、体性感覚ニューロンが最近発見されたニューロン膜プロテアソーム(NNP)を介してコミュニケーションを取り、触覚、かゆみ、痛みの感覚を調節する方法のメカニズムを調査しています。私たちは最近、一部の感覚ニューロンに見られる特殊なタンパク質分解複合体である神経膜プロテアソームを発見し、触覚、かゆみ、痛みに対する感受性を調節する機能を持っています。このプロトコルにより、健康状態および疾患状態における細胞型特異的な方法で NMP の発現および調節ダイナミクスを調査できるようになります。

私たちのプロトコルは、NMP発現ニューロンを非NMP発現ニューロンから単離し、細胞型特異性でそれらの機能を研究することができます。重要なのは、これらの単離されたニューロン集団が下流の分析のために実行可能であることです。これらのプロトコルを使用して、さまざまな神経因性状態が NMP の発現と機能にどのように影響するか、そしてこれが触覚、かゆみ、痛みの感覚の変化にどのように寄与するかの調査を開始します。

まず、採取した後根神経節を15ミリリットルの円錐形のチューブに移します。ピペットを使用して、7ミリリットルの組織解離酵素ブレンド作業溶液をチューブに加え、摂氏37度で20分間穏やかに攪拌しながらインキュベートします。チューブを遠心分離機に入れ、神経節を120 Gで2分間回転させます。

ペレットを乱さずに上清を慎重に吸引します。神経節をパパインとの低粉砕組織解離酵素ブレンド7ミリリットルに再懸濁します。チューブを再度遠心分離した後、上清を吸引して廃棄します。

次に、神経節を500マイクロリットルのBSA、TI、およびDMEM溶液に再懸濁します。1ミリリットルのプラグ付き火研磨ガラス牧草ピペットを使用して、神経節を12〜16回粉砕します。細胞懸濁液を40マイクロメートルの細胞ストレーナーに通し、細胞破片をろ過します。

ストレーナーを1ミリリットルのBSA、TI、およびDMEM溶液で洗浄し、残りの後根神経節ニューロンを収集します。ろ過した細胞懸濁液を15ミリリットルのコニカルチューブに移します。免疫蛍光染色トレイに大きなパラフィルムを敷いて準備します。

滅菌5〜45鉗子を使用して、カバースリップを組織培養皿からパラフィルムに移し、後根神経節ニューロンを含む側が上を向くようにします。細胞が乾燥するのを防ぐために、100マイクロリットルの後根神経節培地を各カバースリップにゆっくりとピペットで入れます。次に、go抗PSMα2一次抗体を温かい後根神経節培地で希釈して、1〜20希釈します。

P10 フィルターなしチップが取り付けられた吸引器を使用して、各カバー スリップの端からメディアをゆっくりと取り除きます。100マイクロリットルのgo抗PSMα2抗体溶液を各カバースリップに加え、室温で40分間インキュベートします。その後、各カバースリップから一次抗体溶液を慎重に吸引します。

100マイクロリットルの室温PBSを細胞に加え、室温で3分間インキュベートして洗浄します。次に、二次抗GO抗体を調製するには、温かい後根神経節培地で1〜250希釈で希釈します。3回目の洗浄が完了したら、100マイクロリットルの希釈した二次抗体溶液を各カバースリップに加えます。

細胞を光から保護しながら、カバースリップを室温で40分間インキュベートします。次に、カバースリップから二次抗体溶液を吸引し、前述のようにPBSを使用して細胞を3回洗浄します。最終PBS洗浄後、4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースを含む100マイクロリットルの固定液をPBSに加えます。

細胞を室温で10分間インキュベートしたら、各カバースリップから固定液を吸引します。次に、前述のように細胞をPBSで3回洗浄します。細胞を透過化するには、100マイクロリットルの0.1%非イオン性界面活性剤をPBSに加えます。

カバースリップを室温で5分間インキュベートします。次に、カバースリップから透過性溶液を吸引し、前述のようにPBSを使用して細胞を3回洗浄します。5%ウシ胎児血清と5%ロバ血清のPBSからなる100マイクロリットルのブロッキング溶液を各カバースリップに加えます。

次に、ウサギ抗CGRP、AセレクチンB4ビオチン複合体、および鶏の抗NFHをブロッキング溶液で希釈して、後根神経節ニューロン細胞型特異的一次抗体混合物を調製します。カバースリップからブロッキング溶液を吸引し、調製した一次抗体混合物を各カバースリップに100マイクロリットル加えます。カバースリップを光から保護しながら、室温で45分間インキュベートします。

その後、カバースリップから一次抗体溶液を取り出し、前述のようにPBSを使用して細胞を3回洗浄します。次に、ストレプトアビジン、ロバ抗ウサギ、およびロバ抗チキンをブロッキング溶液でそれぞれ1〜500に希釈することにより、二次抗体混合物を調製します。各カバースリップから最終的なPBS洗浄液を吸引し、調製した二次抗体溶液を100マイクロリットル加えます。

カバースリップを室温で暗所で45分間インキュベートします。カバースリップから最後の洗浄液を吸引します。細い先端鉗子を使用して、各カバースリップをパラフィルムから持ち上げ、カバースリップの端を糸くずの出ないティッシュに触れて余分な液体をそっと吸い取ります。

7マイクロリットルの封入剤液滴を顕微鏡スライドに置きます。セル側を下に向けてカバースリップを取り付け媒体の上に慎重に下げ、培地に完全に接触するようにします。準備したスライドを暗い乾燥した引き出しまたは箱に入れて、少なくとも1時間乾燥させます。

カバースリップの端を速乾性マニキュアで密封し、10〜15分待ってからイメージングします。生きた後根神経節ニューロンを餌とする抗体は、表面にアクセス可能なプロテアソームを持つニューロンの亜集団を明らかにしましたが、一次抗体を欠く対照サンプルは表面標識を示さなかった。フローサイトメトリーは、蛍光強度に基づいて後根神経節ニューロンの2つの異なる集団を特定し、対照を使用して明確なゲーティング領域が確立されたNMP陽性細胞とNMP陰性細胞を分離しました。

フローソートされた集団の定量化により、後根神経節ニューロンの約4%がNMP陽性であり、残りの大部分がNMP陰性であることが示されました。選別されたNMP陽性およびNMP陰性のニューロンは生存率を維持し、細胞型特異的マーカーNFH、IB four、およびCGRPを発現し、下流の分子解析に対するワークフローの適合性を確認しました。