パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成
2008年10月8日
このビデオでは、パッチピペットと電気生理学のためのシャープな電極を作るためにプログラム可能なプーラーを使用する方法を示します。同じ手順は、注射針を含むガラスの様々なツールを、作るために使用することができます。
ガラスキャピラリーピペットは、シングルセルエレクトロポレーション、DNAマイクロインジェクション、パッチクランプ電気生理学など、さまざまな技術で研究室でユビキタスになっています 記録用のガラスキャピラリーパッチクランプ電極を準備したり、ケイ酸塩ガラスをプログラム可能な極性で引っ張ったりします。電極の先端はワックスでコーティングされ、その後、先端はファイヤーポリッシュされ、将来の使用のために保管されます。こんにちは、スタンフォード大学分子細胞生理学部のミリアム・グッドマンです。
このビデオでは、電気生理学用のパッチクランプピペットと鋭利な電極の作り方を紹介します。ガラス微小電極は、ピペットとも呼ばれ、何十年にもわたって電気生理学の主力製品でした。現在、これらのピペットは、プログラム可能なプルを使用してガラスキャピラリーから作られています。
それでは始めましょう。パッチクランプピペットを作るために、清潔でほこりのない毛細血管にサッターイノシシシルクを使用し、Sutter P nine seven flaming ground micro electrode pullerを使用しています。Sutter's Pipette Cookbookは、適切なプーリングプログラムを開発するための優れたリファレンスです。
まず、プーラーのダストカバーを持ち上げます。次に、箱からガラスキャピラリーチューブを1本取り出します。ほこりの蓄積を最小限に抑えるために、必ず蓋を交換してください。
次に、片手でキャピラリーをフィラメントの片側の溝にスライドさせ、クランプを少し締めます。この時点で、クランプはチューブが落下しないように十分にきつく締める必要がありますが、溝にスライドさせることができるほど緩めてください。次に、同じ側のスプリングメタルストップを放します。
次に、親指と人差し指で、両方のキャリアの底部に取り付けられている金属製のタブをつかみます。もう一方のスプリングメタルストップを外します。キャリアをできるだけ引っ張り、片手で所定の位置に保持します。
次に、チューブをフィラメントハウジングを通して反対側のキャリアの溝にスライドさせます。ガラスを加熱フィラメントに押し込まないでください。クランプを両側で締めます。
それらは、キャリアを所定の位置に保持するのに十分なきつくなければなりませんが、ガラスがつぶれるほどきつくはありません。次に、ダストカバーを閉じて、緑色のボタンを押します。パッチクランプ録音用のマーク付きポールピペットは、各ステップで下降する熱と速度、最終ステップで小さなポールを備えた5ステップのポーリングプログラムを使用して形成されます。
このプログラムは熱と重力を利用します。鋭利な電極を作る手順もよく似ていますが、今回はワーナー・インスツルメンツの細いガラスキャピラリーを使って、外径が1mm、内径が0.78mmのものを使います。また、引っ張りプログラムが終了すると、熱や重力に加えてモーターを使用する引っ張りプログラムも適用します。
ダストカバーを持ち上げ、両方のclを緩めますamps、完成したピペットを取り外します。次に、ピペットを作業ボックスに入れます。このボックスは、プラスチック製のピペットチップボックスのラックにフォームのストリップを接着し、フォームに6〜8個のスリットをカットすることで作成できます。
ピペットをスリットに挿入します。引っ張ったピペットで箱がいっぱいになったら、火磨きステップに進み、ピペットを火磨きします。ファイヤーポリッシングを開始する前に、フットペダルで制御するプラチナヒーティングフィラメントを備えたマイクロフォージリグをセットアップします。
まず、ピペットにデンタルワックスを塗布して、静電容量を減らし、騒音特性を改善します。これを行うには、溶融ワックスを少量近くに置いておきます。ピペットの背面に空気圧をかけて、ワックスが先端に入らないようにします。
次に、先端を液体ワックスに短時間浸します。そして、今すぐ削除します。ピペットを研磨装置に入れ、先端をフィラメントから約50ミクロン離します。
フィラメントは加熱すると膨張することに注意してください。1秒または2秒の短い熱パルスを印加して、ピペットの先端からワックスを取り除き、ガラスを滑らかにします。顕微鏡でピペットチップを検査し、開口部の直径と滑らかさを確認します。
標準的なパッチクランプ録音の場合、先端の開口部は直径1〜3ミクロン、廃棄、粗い、不均一な、または不規則な先端である必要があります。完成したピペットを作業ボックスに入れ、ピペットをほこりから保護するために蓋を閉めてください。プログラム可能なプーラーを使用して、パッチクランプピペットとシャープなエレクトロを作成する方法を紹介しました。
同じ手順を使用して、最適なパッチクランプ結果を得るための注射針を含むさまざまなガラスツールを作成できます。実験の当日に新しいほこりのないピペットを引っ張り、実験から1時間以内に磨くことを忘れないでください。また、ピペットが滑らかで磨かれていることを検査で確認します。
opus 卵母細胞で発現するイオンチャネルのパッチクランプ記録を行う方法を示す他のビデオもぜひご覧ください。さて、これで完了です。これで、ピペットの専門家となり、実験に幸運を祈ります。
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概要
このビデオでは、プログラマブルプーラーを使用してパッチピペットと電気生理学用のシャープ電極を作成するプロセスを示しています。これらのガラスツールは、単一細胞電気ポレーションやDNAマイクロインジェクションなど、様々な実験技術に不可欠です。
主要な研究構成要素
科学の分野
- 電気生理学
- 神経科学
- 細胞生物学
背景
- ガラスキャピラリーピペットは電気生理学で広く使用されています。
- パッチクランプやマイクロインジェクションなどの技術に不可欠です。
- 準備には、ガラスキャピラリーを細い先端に引き伸ばすことが含まれます。
- 電極の先端は最適な性能のためにコーティングされ、火で磨かれることが多いです。
研究の目的
- パッチクランプピペットの準備を実演すること。
- 電気生理学的記録用のシャープ電極の製作を説明すること。
- 分野の研究者のための視覚的ガイドを提供すること。
使用された方法
- プログラマブルプーラーを使用してガラスキャピラリーを成形すること。
- 電極の先端にワックスをコーティングすること。
- 機能性を向上させるために先端を火で磨くこと。
- 準備した電極を将来の使用のために保存すること。
主な結果
- パッチピペットとシャープ電極を正常に作成したこと。
- プログラマブルプーラーの有効性を実証したこと。
- 電極準備のための信頼できる方法を提供したこと。
- 長寿命のための適切な保管の重要性を強調したこと。
結論
- このビデオは電気生理学ツール準備の実践的なガイドとして機能します。
- 適切な技術は研究のための高品質の電極を確保します。
- アクセス可能な方法は神経科学における実験結果を向上させることができます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Programmable pullers for glass microelectrode fabrication underpin high-fidelity electrophysiology workflows in early discovery and assay development. Reliable production of patch pipettes and sharp electrodes ensures reproducible data quality, supporting mechanistic de-risking and target validation in ion channel and cellular physiology research. Standardized electrode preparation directly impacts predictive confidence and cross-study comparability in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of ion channel function and cellular electrophysiology.
- Supports functional target validation by ensuring consistent electrode performance.
- Reduces biological variability, strengthening mechanistic de-risking in early-stage programs.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized pipettes for high-throughput patch clamp assays.
- Improves assay reproducibility and quantitative measurement reliability.
- Enables scalable electrode production for screening campaigns and platform reuse.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant electrophysiological models for translational continuity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by ensuring tool consistency.
- Mitigates risk of technical artifacts in preclinical decision-making.
Pipeline & Workflow Integration
Programmable puller-based electrode fabrication is foundational from early discovery through lead identification and preclinical research, enabling robust electrophysiological readouts across the pipeline.
- Discovery Biology: Provides high-quality electrodes for hypothesis testing and pathway analysis.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound evaluation.
- Analytics: Ensures consistent tip geometry and capacitance for reliable data comparison.
- Translational Research: Maintains tool standardization across disease models and experimental systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a repeatable, scalable process for electrode production across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in electrophysiological assays.
- Operational Value: Standardizes electrode fabrication for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by minimizing technical variability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of ion channel and cellular physiology assets.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in programmable puller operation and electrode inspection.
- Needs access to specialized instrumentation such as programmable pullers and microforges.
- Demands cross-team standardization of fabrication protocols and quality control.
- Adaptable to various glass types and model systems with protocol adjustments.
- Dependent on timely fabrication and inspection to ensure optimal electrode performance.
