パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

ガラスキャピラリーピペットは、シングルセルエレクトロポレーション、DNAマイクロインジェクション、パッチクランプ電気生理学など、さまざまな技術で研究室でユビキタスになっています 記録用のガラスキャピラリーパッチクランプ電極を準備したり、ケイ酸塩ガラスをプログラム可能な極性で引っ張ったりします。電極の先端はワックスでコーティングされ、その後、先端はファイヤーポリッシュされ、将来の使用のために保管されます。こんにちは、スタンフォード大学分子細胞生理学部のミリアム・グッドマンです。

このビデオでは、電気生理学用のパッチクランプピペットと鋭利な電極の作り方を紹介します。ガラス微小電極は、ピペットとも呼ばれ、何十年にもわたって電気生理学の主力製品でした。現在、これらのピペットは、プログラム可能なプルを使用してガラスキャピラリーから作られています。

それでは始めましょう。パッチクランプピペットを作るために、清潔でほこりのない毛細血管にサッターイノシシシルクを使用し、Sutter P nine seven flaming ground micro electrode pullerを使用しています。Sutter's Pipette Cookbookは、適切なプーリングプログラムを開発するための優れたリファレンスです。

まず、プーラーのダストカバーを持ち上げます。次に、箱からガラスキャピラリーチューブを1本取り出します。ほこりの蓄積を最小限に抑えるために、必ず蓋を交換してください。

次に、片手でキャピラリーをフィラメントの片側の溝にスライドさせ、クランプを少し締めます。この時点で、クランプはチューブが落下しないように十分にきつく締める必要がありますが、溝にスライドさせることができるほど緩めてください。次に、同じ側のスプリングメタルストップを放します。

次に、親指と人差し指で、両方のキャリアの底部に取り付けられている金属製のタブをつかみます。もう一方のスプリングメタルストップを外します。キャリアをできるだけ引っ張り、片手で所定の位置に保持します。

次に、チューブをフィラメントハウジングを通して反対側のキャリアの溝にスライドさせます。ガラスを加熱フィラメントに押し込まないでください。クランプを両側で締めます。

それらは、キャリアを所定の位置に保持するのに十分なきつくなければなりませんが、ガラスがつぶれるほどきつくはありません。次に、ダストカバーを閉じて、緑色のボタンを押します。パッチクランプ録音用のマーク付きポールピペットは、各ステップで下降する熱と速度、最終ステップで小さなポールを備えた5ステップのポーリングプログラムを使用して形成されます。

このプログラムは熱と重力を利用します。鋭利な電極を作る手順もよく似ていますが、今回はワーナー・インスツルメンツの細いガラスキャピラリーを使って、外径が1mm、内径が0.78mmのものを使います。また、引っ張りプログラムが終了すると、熱や重力に加えてモーターを使用する引っ張りプログラムも適用します。

ダストカバーを持ち上げ、両方のclを緩めますamps、完成したピペットを取り外します。次に、ピペットを作業ボックスに入れます。このボックスは、プラスチック製のピペットチップボックスのラックにフォームのストリップを接着し、フォームに6〜8個のスリットをカットすることで作成できます。

ピペットをスリットに挿入します。引っ張ったピペットで箱がいっぱいになったら、火磨きステップに進み、ピペットを火磨きします。ファイヤーポリッシングを開始する前に、フットペダルで制御するプラチナヒーティングフィラメントを備えたマイクロフォージリグをセットアップします。

まず、ピペットにデンタルワックスを塗布して、静電容量を減らし、騒音特性を改善します。これを行うには、溶融ワックスを少量近くに置いておきます。ピペットの背面に空気圧をかけて、ワックスが先端に入らないようにします。

次に、先端を液体ワックスに短時間浸します。そして、今すぐ削除します。ピペットを研磨装置に入れ、先端をフィラメントから約50ミクロン離します。

フィラメントは加熱すると膨張することに注意してください。1秒または2秒の短い熱パルスを印加して、ピペットの先端からワックスを取り除き、ガラスを滑らかにします。顕微鏡でピペットチップを検査し、開口部の直径と滑らかさを確認します。

標準的なパッチクランプ録音の場合、先端の開口部は直径1〜3ミクロン、廃棄、粗い、不均一な、または不規則な先端である必要があります。完成したピペットを作業ボックスに入れ、ピペットをほこりから保護するために蓋を閉めてください。プログラム可能なプーラーを使用して、パッチクランプピペットとシャープなエレクトロを作成する方法を紹介しました。

同じ手順を使用して、最適なパッチクランプ結果を得るための注射針を含むさまざまなガラスツールを作成できます。実験の当日に新しいほこりのないピペットを引っ張り、実験から1時間以内に磨くことを忘れないでください。また、ピペットが滑らかで磨かれていることを検査で確認します。

opus 卵母細胞で発現するイオンチャネルのパッチクランプ記録を行う方法を示す他のビデオもぜひご覧ください。さて、これで完了です。これで、ピペットの専門家となり、実験に幸運を祈ります。