Name: パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-10-08T00:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 30 s
Description: 学ぶパッチクランプ用ガラス電極と鋭電極の作製法。プログラマブルプラーでガラス毛細管を引き伸ばし、ワックスコーティングと火炎研磨を行う。電気生理学実験に必要な高品質な電極調製技術を習得できる。

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国立衛生研究所、国立科学財団、米国心臓協会、筋ジストロフィー協会、ドナルドB.とデリアE.バクスター財団、Klingenstein基金と神経科学のためのマックナイト基金：我々は、サポートについては、次の資金提供機関や財団に感謝します。

引っ張っピペットプラーなどサターP - 97火焔/ブラウンなどの微小電極を用いて、約10〜20ピペットのセットを引き出します。 <ol><li>あなたのガラスキャピラリーを選択してください。我々は、ホウケイ酸毛細血管（サターBF150 - 110 - 10、長い1.5ミリメートル外径さ1.1mm内径、10センチメートル）を使用します。それは自由な汚れやほこりを保つように慎重にガラスを保管​​してください。 </li><li>引っ張ってプログラムを設計します。我々は、各ステップで熱と速度を降順で、5段階のプログラムを使用し、そして最後のステップで小さなプル。サターのピペットの料理の本は、適切なプログラムを開発するための優れたリファレンスです。 </li><li>開口径と滑らかさを決定するために顕微鏡下でピペットチップを調べます。荒い、でこぼこ、または不規則なヒントを捨てる。良い引きプロトコルは、これらはまれであることを確認する必要があります。標準のパッチクランプ記録のために、先端の開口部は直径の1-3ミクロンにする必要があります。急なテーパー（鈍端）が同じ開口径のために抵抗を下げるために導く。形状と大きさは圧力の研磨によって変更することができます。 </li></ol>火災の研磨ピペット<ol><li>フットペダルで制御されるプラチナの加熱フィラメントと研磨リグ（マイクロフォージ）を設定します。有用なキットは、ALAサイエンティフィック（CPM - 2）または類似の装置から入手可能です少しずつ組み立てることができます。 </li><li> オプション：コート静電容量を減少させるとノイズ特性を向上させるために絶縁体とのピペット。我々は、歯科用ワックスを使用しています。 Sylgard 184™は、（また、PDMSと呼ばれるポリジメチルシロキサンエラストマー）もオプションです。 </li><li>ワックスを使用する場合、近くの小さな溶融供給を維持する。ピペットを入力してからワックスを保つためにピペットの背面の空気の圧力で、液体のワックスに簡単に先端を浸して削除する。 Sylgardと、店舗準備冷凍アリコートのエラストマーと顕微鏡下でピペットの先端をペイント。エラストマーを治すために加熱する。 </li><li>研磨装置にピペットを（コーティングされたかどうか）に置き、先端〜フィラメントから50ミクロンをもたらす。加熱するとフィラメントが拡大することに留意してください。 </li><li> 推奨 ：最適な抵抗と先端径のためのピペットの形状を変更するには&quot;圧力研磨&quot;のための別のプロトコルに従ってください。 </li><li>短い熱パルス（1〜2秒）は、ピペットの先端からワックスを除去し、ガラスを滑らかにするだけで十分です。 </li><li>ほこりから守るために密閉ボックス10の成功ピペットの繰り返しで完成したピペットを置きます。 </li></ol>

<ol><li>Sutter Instrument, P-97 Pipette Cookbook. , Sutter Instrument. 
 
 <a target="_blank" href="http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf">http://www.sutter.com/contact/faqs/pipette_cookbook.pdf</a> (2008).</li>
</ol>

ここでプロトコル図示の電気生理学実験室での日常使用されており、細胞および動物用注射針を作るためにも使用されます。プログラム可能な引き手で、それには、さまざまな用途のためにピペットを作るのは簡単です。注意と慎重に、あなたのプーラーでフィラメントは、一年以上持続します。あなたの実験の成功をお祈りします。

<table><tbody><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>器具</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>または同等の器具（例：Sutter P-87またはP-2000）</td></tr><tr><td>ガラスキャピラリー</td><td>試薬</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-86-10</td><td>または同等のキャピラリーガラス。ピペットへの充填を容易にするため、ガラスフィラメント付きのキャピラリーを使用すること。</td></tr></tbody></table>

パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

Making Patch-pipettes and Sharp Electrodes with a Programmable Puller

ガラス微小電極は、（また、ピペットと呼ばれる）数十年の電気生理学の主力となっている。今日は、そのようなピペットは、プログラム可能なプーラーを用いてガラスキャピラリーから作られています。このような楽器の熱金属のフィラメントまたはレーザーと重力、モーターまたは両方を使用してガラスを引き出すのいずれかを使用してキャピラリー。細胞内記録のための鋭い電極は、熱、重力、そしてモーターを組み合わせて使用​​しながらのパッチクランプ記録用ピペットは、唯一の熱と重力を用いて形成される。細胞内記録ピペットを作るために使用される手順は、アフリカツメガエルの卵母細胞へのcRNAを注入などの様々なアプリケーションのための注射針を、作るために使用されているものと似ています。狭いガラスは細胞内記録（外径= 1.0 mm）のために使用されるが、一般的に、直径のガラスキャピラリー&lt;1.2 mmの、パッチクランプ記録用ピペットを行うために使用されます。各ツールの場合、プーラーは若干異なってプログラムされています。このビデオでは、事前に確立されたプーラーのプログラムを使用して記録ピペットの両方の種類を作成する方法を示します。

このビデオでは、パッチピペットと電気生理学のためのシャープな電極を作るためにプログラム可能なプーラーを使用する方法を示します。同じ手順は、注射針を含む​​ガラスの様々なツールを、作るために使用することができます。

ガラス微小電極（ピペットとも呼ばれる）は、数十年にわたり電気生理学において不可欠なツールとなってきました。現在、このようなピペットはガラスキャピラリーから作製されており…

ガラスキャピラリーピペットは、単一細胞電極穿孔法、DNAマイクロインジェクション、パッチクランプ電生理学など、多種多様な手法において研究室で広く普及しています。記録用のガラスキャピラリーパッチクランプ電極を準備するには、プログラマブルプラーを用いてケイ酸塩ガラスを延伸します。電極の先端にワックスをコーティングした後、先端を火炎研磨し、今後の使用のために保存します。こんにちは、スタンフォード大学分子細胞生理学部門のミリアム・グッドマンです。このビデオでは、電気生理学で使用するパッチクランプピペットとシャープ電極の作製方法を実演します。ピペットとも呼ばれるガラス微小電極は、数十年にわたり電気生理学の基盤となってきました。現在、これらのピペットはプログラマブルプルヤーを用いてガラスキャピラリーから作製されています。それでは始めましょう。パッチクランプピペットを作製するために、清潔で埃のないSutter borosilicate capillariesと、Sutter P-97 flaming ground micro electrode pullerを使用します。適切なプルプログラムを開発するには、Sutter's Pipette Cookbookが優れたリファレンスになります。まず、プラーのダストカバーを持ち上げます。次に、ボックスからガラスキャピラリーチューブを1本取り出します。埃の蓄積を最小限に抑えるため、必ず蓋を閉めてください。次に、片手でキャピラリーをフィラメントの一方の側の溝にスライドさせ、クランプを軽く締めます。このとき、クランプはチューブが脱落しない程度に締め、かつ溝の中にスライドさせられる程度の緩さを維持してください。その後、同じ側にあるスプリングメタルストッパーを解除します。次に、親指と人差し指で、両方のキャリアの底に取り付けられている金属タブを掴みます。もう一方のバネ式金属ストッパーを解除します。キャリアを限界まで引き寄せ、片手でその状態を保持します。次に、チューブをフィラメントハウジングに通し、反対側にあるキャリアの溝に差し込みます。この際、ガラス管を加熱フィラメントに押し付けないように注意してください。両側のクランプを締めて固定します。キャリアを固定するのに十分な強さで締め付けますが、ガラスが潰れないように注意してください。次に、ダストカバーを閉じて緑色のボタンを押します。パッチクランプ記録用のマーク付き電極ピペットは、各ステップで熱と速度を下げ、最終ステップで小さな極を形成する5段階のポーリングプログラムを用いて作製されます。このプログラムでは、熱と重力を利用します。鋭い電極を作成する手順は非常に似ていますが、この場合は、外径 1 mm、内径 0.78 mm の Warner Instruments 製薄いガラスキャピラリーを使用します

making-patch-pipettes-and-sharp-electrodes-with-a-programmable-puller

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これは、ガラスマイクロピペットの形状を変更するためのガイドです。特に、熱や空気圧を使用してテーパーが低いピペットの抵抗につながる、先端の開口部を増やすことなく広げている。これは、小さな細胞の低ノイズ記録を取得することが重要ですが、多くのアプリケーションで有用です。...

改善されたパッチクランプ記録のための圧力 - 研磨ピペット

また、人工脂質二重層と呼ばれる平面脂質二重膜を使用すると、イオン伝導性、明確に定義された環境でのチャネルを調べることができます。ここで、我々は、電極の二重層室を準備するために必要な個々のステップを示し、どのように二重層がシングルチャネルの測定に適していることをテストする。...

電気生理学的実験のための人工二重層の準備

発現とHEK - 293T細胞における組換え電位依存性イオンチャネルの電気生理学的記録用に最適化されたトランスフェクション戦略

ここでは、セルの剛性を測定するために迅速かつ簡単な方法を説明します。このアプローチの一般的な原則は、細胞表面にマイクロピペットを介して適用、明確に定義された負圧に応答して膜の変形を測定することです。この方法は、基板に接続された細胞の生体力学的特性を研究するための強力なツールを提供します。...

セルの剛性を推定するために基板に接続された細胞のマイクロピペット吸引

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用ピギーバックMultibarrel電極の製造と使用<emインビボ&gt;</em神経反応の&gt;薬理マニピュレーション

多電極パッチクランプ記録は、複雑なタスクを構成する。ここでは、実験的な手順の多くを自動化することによって、それがパフォーマンスと録音の数の質的向上につながるプロセスを加速することが可能であるか、を示します。...

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液滴界面二重層中に細菌機械受容イオンチャネルの取り込みおよび刺激のための多機能、マイクロピペットベースの方法

覚醒マウスにおいて、細胞外神経活動を同時に記録し、記録部位付近で複数の神経活性物質を放出する電極の構築方法を提示します。この技術により、目的のニューロンへの推定される局所シナプス入力の詳細な分析が可能になります。...

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学ぶパッチクランプ用ガラス電極と鋭電極の作製法。プログラマブルプラーでガラス毛細管を引き伸ばし、ワックスコーティングと火炎研磨を行う。電気生理学実験に必要な高品質な電極調製技術を習得できる。

パッチピペットおよびプログラマブルプラーとシャープ電極作成

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