Summary
وتعرض هذه الورقة التقنية لجمع الدم من الشريان الأبهر الظهري من الزرد. كما يوفر إرشادات للحصول على المصل لاستخدامها في تحليل الكيمياء الحيوية، مثل اختبارات لتحديد مستويات الكولسترول والدهون الثلاثية.
Abstract
وقد استخدم الزرد لتكون نموذجا للدراسات الحيوانية من الأمراض التي تصيب الإنسان عدة. يمكن أن تكون بمثابة منصة قوية لدراسات ما قبل السريرية من الأحداث الجزيئية والاستراتيجيات العلاجية، وكذلك لتقييم الآليات الفسيولوجية لبعض الأمراض 1.
وهناك عدد قليل نسبيا من المنشورات المتعلقة الزرد علم وظائف الأعضاء الكبار من الأعضاء والأجهزة 2، والذي قد يؤدي إلى استنتاج الباحثين أن التقنيات الأساسية اللازمة للسماح للاستكشاف نظم الزرد تفتقر 3. ولم يبلغ عن القيم 1 البيوكيميائية الدموية من الزرد في عام 2003 من قبل مورثا و 4 الزملاء الذين يعملون تقنية جمع الدم لأول مرة من قبل Jagadeeswaran وزملاؤه في عام 1999. لفترة وجيزة، تم جمع الدم عن طريق طرف micropipette من خلال شق جانبي، ما يقرب من 0.3 سم في الطول، في المنطقة من الشريان الأبهر الظهري 5. نظرا للأبعاد دقيقة المعنية، هذاهي تقنية عالية الدقة تتطلب ممارس درجة عالية من المهارة. وقد استخدم نفس الاسلوب من قبل المجموعة نفسها في منشور آخر في نفس العام 6. في عام 2010، المقررة ايمز وزملاؤه كل مستويات السكر في الدم في الزرد 7. اكتسبوها الوصول إلى الدم عن طريق إجراء قطع الرؤوس مع مقص ومن ثم ادخال heparinized أنبوب جمع microcapillary في صياغة الصدرية. يذكرون الصعوبات مع انحلال الدم التي تم حلها مع درجة حرارة التخزين المناسبة على أساس آل عمل وآخرون كيلباتريك. 8. وجدنا عند محاولة استخدام تقنية Jagadeeswaran في مختبرنا، وأنه كان من الصعب جعل شق في مكان على وجه التحديد الحق في عدم السماح لكمية كبيرة من الدم إلى أن تضيع قبل أن بدأ جمع.
مؤخرا، غوبتا وآخرون. 9 10 صفه كيفية تشريح أجهزة الزرد الكبار، Kinkle وآخرون. ووصف كيفية تنفيذ intraperitonووصف حقن EAL، وPugach وآخرون. 11 كيفية تنفيذ الرجعية المدارية عن طريق الحقن. ومع ذلك، هناك حاجة إلى مزيد من العمل لأكثر تماما استكشاف التقنيات الأساسية للبحث في الزرد.
صغر حجم الزرد تحديات للباحثين استخدامه كنموذج تجريبي. وعلاوة على ذلك، نظرا لهذا صغر الحجم، وأنه من المهم أن يتم تطوير تقنيات بسيطة لتمكين الباحثين من دراسة المزايا من طراز الزرد.
Protocol
1. نص بروتوكول
- قبل جمع الدم الزرد، من الضروري أن تعد المياه التخدير. صب ~ 200 مل من الماء في وعاء ماء بسعة 500 مل. إضافة ~ 200 غرام من رقائق الثلج. يجب أن تكون درجة الحرارة حوالي 4 درجات مئوية. كما رقائق ذوبان الجليد، سيكون من الضروري لإضافة المزيد من رقائق الثلج للحفاظ على درجة حرارة ثابتة بالقرب من 4 درجات مئوية.
- عندما الماء التخدير مستعدة، وإعداد المواد اللازمة لجمع الدم. وضع تلميح منخفضة على الاحتفاظ pipettor P20 وترك pipettor حيث يمكن الوصول إليها بسهولة. لا تسمح للطرف ماصة للاتصال بأي مصادر التلوث.
- تغطية صحن بيتري مع قطعة من الشاش الجافة. يجب وضع شفرة الصلب وآخر قطعة من الشاش في مكان يسهل الوصول إليها.
- ستكون هناك حاجة لجهاز الطرد المركزي تكييفها للأنابيب بلاستيكية.
- عندما يتم إعداد المواد المذكورة آنفا، التقاط الزرد الاولى لتكون خفة دم تخديرهكتار شباك الصيد والافراج عنها في المياه التي أعدت للتخدير. الزرد تتطلب 3-6 ق في المياه المبردة ليكون تخدير، اعتمادا على الأسماك. الحفاظ على الأسماك في المياه الباردة حتى أنه لم يعد يستجيب للمؤثرات الخارجية.
- باستخدام شباك الصيد، ووضع الأسماك تخدير على قطعة من الشاش المعدة، وترك ذيل الخروج من الشاش. طي الشاش فوق رأس السمكة وجسده تاركة فقط لها ذيل. وضع السمكة مغطاة الشاش على طبق بيتري.
- استخدام شفرة الفولاذ لجعل شق قطري فقط بين الزعنفة الشرجية والزعنفة الذيلية. وسوف تبدأ في الدم للخروج. عند هذه النقطة، فمن الضروري العمل بسرعة.
- بلطف يطمح الدم الذي يخرج مع pipettor P20 (محملة مسبقا مع طرف الاحتفاظ الأقل). كمية الدم التي يمكن جمعها يعتمد على حجم السمك، وإلى أي درجة أنه تم تخديره بشكل صحيح. وهو يختلف عادة 5-20 ميكروليتر. عندما يتوقف الدم جoming خارج، ونقل بلطف الدم المنشود في أنبوب.
- لتجنب انحلال الدم، فمن الأهمية بمكان أن يتم التعامل معها في الأنبوب مع الدم في ذلك بحرص شديد، ودون أي تحركات جذرية حتى يتم وضعه في أجهزة الطرد المركزي.
- لتجنب انحلال الدم، فإنه من المهم أيضا أن يتم توفير عينة من الدم في جهاز الطرد المركزي في غضون 10 دقيقة من جمع الدم.
- إذا لزم الأمر، فمن الممكن الجمع بين الدم من أكثر من حيوان واحد، مما يجعل بركة. والعينات المجمعة تعمل بشكل جيد ما دام التأخير بين جمع الدم من الأسماك الأولى والطرد المركزي لا تتجاوز 10 دقيقة.
- عندما يتم جمع الدم، وأجهزة الطرد المركزي في الدم لمدة 10 دقائق عند 0.5 غرام (إيبندورف جهاز طرد مركزي 5415D).
- بعد الطرد المركزي، ومصل الدم هو في الطبقة العليا من أنبوب. مع ماصة، نضح المصل، مع التأكد من مجرد الحصول على مصل الدم مع الحفاظ على كل من طبقات مقسمة بشكل جيد ومستقر.
- نقل الدم في microtube جديدة وذلكمستعد لاستخدامها في التحليلات الكيميائية الحيوية. ويمكن تخزين المصل في الجليد في حين انتظر لبدء التحاليل البيوكيميائية.
- إذا لن يتم استخدام المصل فورا، ويمكن تجميده عند -18 درجة مئوية لمدة تصل إلى ما يقرب من 3 أشهر.
2. ممثل النتائج
كان من الممكن جمع 5-20 ميكروليتر من الدم الكامل من كل الأسماك ما يمثل الدم حتى 4 مرات أكثر من التقنيات التي سبق وصفها (الجدول 2). تم إجراء تحليل كيميائي حيوي من الكولسترول الكلي، الكولسترول، الكولسترول الضار، والدهون الثلاثية بعد جمع الدم باستخدام هذه التقنية. وصام مجموعتين من كلا الجنسين السمك لمدة 24 ساعة قبل جمع الدم لتجنب الأغذية تدخل السحب. وقد أجريت التحليلات مع صغير تحجيم التجارب اللونية (Labtest Diagnóstica SA، البرازيل) لتحاليل الكوليسترول والدهون الثلاثية مجموع، وتستخدم 3 ميكروليتر من المصل. الكوليسترول LDL للHDL والكوليسترولواستخدمت التحليل، 4 ميكرولتر و 10 ميكروليتر من المصل، على التوالي. وأجريت هذه التحاليل على عينات جمعت من 10 الزرد لكل عينة.
وتمت مقارنة مستويات المصل lipidic بين الاسماك التي الوصول إلى البيض الخاصة بهم، وتلك التي، في الحوض السفلي مغطى، لم يكن لديهم إمكانية الحصول على البيض الخاصة بهم لمدة تجريبية من 2 أسابيع. وأظهر تحليل مصل الدم أن مستويات مصل الدم من الكولسترول الكلي (مع البيض 362 ± 42 ملغ / دل وبدون بيض 357 ± 13 ملغ / دل)، HDL الكولسترول (مع البيض 91.22 ± 1.79 ملغ / دل وبدون بيض 72.14 ± 2.89 ملغم / ولم دل)، والكولسترول الضار، (مع البيض 55.68 ± 10.88 ملغ / دل وبدون بيض 44،18 ± 9،84 ملغ / دل) لا تختلف اختلافا كبيرا بين المجموعتين. ومع ذلك، كانت مستويات الدهون الثلاثية أقل من ذلك بكثير في المجموعة التجريبية (بدون بيض 292 ± 64 ملغ / دل) مما كان عليه في السيطرة على المجموعة (مع البيض 457 ± 25 ملغم / دل، P = 0.03).
| ومصلحة الدولة للاحصاءع؛ | مع الحصول على البيض | دون الحصول على البيض |
| مجموع الكوليسترول (ملغ / دل) | 362،82 ± 73،11 | 357،69 ± 23،08 |
| LDL - الكوليسترول (ملغ / دل) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL - الكوليسترول (ملغ / دل) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| الدهون الثلاثية (ملغم / دل) | 457،64 ± 43،78 * | 292.36 ± 111.28 |
الجدول رقم 1. سيريتش مستويات الكولسترول والدهون الثلاثية لكلا الفريقين درس (مع إمكانية الحصول على البيض وبدون الحصول على البيض) التي أعرب عنها في المتوسط ± الانحراف المعياري.
* ذات دلالة إحصائية (P = 0.03). طالب اختبار تي.
| التسليم عجز عن | بدلا من شق | حصاد طريقة | خدر | كمية الدم التي تم جمعها |
| Jagadeeswaran وآخرون. آل.، 1999 مورثا وآخرون، 2003 | الصغير الخلفي لتشريح الزعنفة الظهرية | Micropipette | لم يرد ذكرها MS222 3٪ في الماء البارد | 1 (أ) ميكرولتر 5 5 (أ) ميكرولتر 10 |
| ايمز وآخرون، 2010 | قطع الرأس | الشعيرات الدموية الدقيقة أنبوب | MS222 0،02٪ 28 الماء درجة مئوية | 5 (أ) ميكرولتر 10 |
| الدراسة الحالية | شق بين الزعنفة الشرجية والزعنفة الذيلية | Micropipette ونصائح الاحتفاظ منخفض | الماء والجليد رقائق | 5 (أ) ميكرولتر 20 |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تعرض هذه الورقة تقنية بسيطة تتيح المزيد من الدم وتحليل مصل الدم في التجارب الزرد. هذه التقنية لديها القدرة على المساهمة في دراسات المستقبل الزرد الدموية التي تتطلب بيانات المعلمة الدم. وينبغي أن يسمح أيضا لمزيد من التطبيقات من الزرد كنموذج تجريبي.
هذه التقنية لا تتطلب مهارات خاصة أو تنفيذ أسلوب دقيق. وعلاوة على ذلك، فإنه يمكن حتى ضعف كمية الدم التي سيتم جمعها نسبة إلى غيرها من التقنيات، مما يتيح لاستخدام عدد أقل من الأسماك للحصول على الكمية المطلوبة من المواد البيولوجية. هذه التقنية لديها واحد خطوة حاسمة، وهي أن يتم التعامل معها بعناية وعينات من الدم والدم الزرد يمكن أن تحمل انحلال الدم بسهولة بالغة. يجب أن يكون التأخير الزمني بين جمع الدم والطرد المركزي محدودة للغاية. وينبغي أن يكون الحد الأقصى لمدة 10 دقائق منع انحلال الدم. سرعة ومدة الطرد المركزي (0،5 جرام لمدة 10 دقيقة) شوLD أيضا أن يكون اتباعها بدقة.
وقد حاول غيرها من تقنيات جمع الدم قبل وقد وضعت هذه التقنية. ومع ذلك، كان عدد الحيوانات المستخدمة تم جمع كميات كبيرة وصغيرة جدا من الدم من كل الأسماك. وقد تجلى هذا التقنية الجديدة تسمح باستخدام عدد أقل من الحيوانات، ليكون ذلك ممكنا مع انخفاض مستوى مهارة العاملين، وأعطى نتائج أفضل من غيرها من التقنيات من حيث كمية الدم التي تم جمعها من كل الأسماك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo دي Incentivo إلكتروني Pesquisa Eventos
الرؤوس - Coordenação دي دي Aperfeiçoamento Pessoal دي نيفل العليا
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
