Summary
Dette notatet presenterer en teknikk for innsamling av blod fra dorsal aorta av sebrafisk. Det gir også instruksjoner for å få serum til bruk i biokjemiske analyser, for eksempel tester for å bestemme kolesterol og triglyserid nivå.
Abstract
Sebrafisk har blitt brukt som en dyremodell for studier av en rekke menneskelige sykdommer. Det kan tjene som en kraftig preklinisk plattform for studier av molekylære hendelser og terapeutiske strategier samt for å evaluere de fysiologiske mekanismene for noen patologi 1.
Det er relativt få publikasjoner relatert til voksen sebrafisk fysiologi av organer og systemer 2, som kan føre forskerne å antyde at de grunnleggende teknikkene som trengs for å tillate utforskning av sebrafisk systemer mangler tre. Hematologisk biokjemiske verdier av sebrafisk ble først rapportert i 2003 av Murtha og kolleger 4 som ansatt en blod samling teknikk først beskrevet av Jagadeeswaran og kolleger i 1999. Kort, ble blod samles inn via en mikropipette tips gjennom en lateral snitt, ca 0,3 cm i lengde, i regionen av dorsal aorta 5. På grunn av de ørsmå dimensjoner involvert, detteer en høy presisjon teknikk krever en svært dyktig utøver. Den samme teknikken ble brukt av den samme gruppen i en annen publikasjon i samme år 6. I 2010 vurderte Eames og kolleger hele blodsukkernivået i sebrafisk 7. De fikk tilgang til blodet ved å utføre decapitations med saks og deretter sette inn en heparinisert microcapillary samling rør inn i brystregionen artikulasjon. De nevner problemer med hemolyse som ble løst med en passende lagringstemperatur basert på arbeidet Kilpatrick et al. 8. Når du prøver å bruke Jagadeeswaran teknikk i vårt laboratorium, fant vi at det var vanskelig å gjøre snitt i nøyaktig riktig sted for ikke å tillate en betydelig mengde blod som skal gå tapt før samlingen kunne startes.
Nylig, Gupta et al. 9 beskrev hvordan å dissekere voksne sebrafisk organer, Kinkle et al. Ti beskrev hvordan de skal utføre intraperitonEAL injeksjoner, og Pugach m.fl. 11 beskrev hvordan å utføre retro-orbital injeksjoner. Det er imidlertid mer arbeid for å mer fullt utforske grunnleggende teknikker for forskning i sebrafisk.
Den lille størrelsen på sebrafisk presenterer utfordringer for forskere som bruker det som en eksperimentell modell. Videre gitt denne smallness av skalaen, er det viktig at enkle teknikker er utviklet for å muliggjøre forskere til å utforske fordelene av sebrafisk-modellen.
Protocol
1. Protokoll Tekst
- Før samle sebrafisk blod, er det nødvendig å forberede bedøvelse vann. Hell ~ 200 ml akvarium vann i en beholder med en 500-ml kapasitet. Legg ~ 200 g is chips. Temperaturen bør være ca 4 ° C. Som isen chips smelter, vil det være nødvendig å legge mer is chips å opprettholde en konstant temperatur nær 4 ° C.
- Når bedøvelse vannet er klart, forberede materialer som trengs for blodprøvetaking. Sett en lav-oppbevaring tips på en P20 pipettor og la pipettor der det lett kan nås. Ikke la pipettespissen å kontakte noen kilder til forurensning.
- Dekk en petriskål med et stykke tørt gasbind. En stål blad og en annen stykke gasbind bør plasseres på et lett tilgjengelig sted.
- En sentrifuge tilrettelagt for plastrør vil være nødvendig.
- Når de nevnte materialer er forberedt, fange første sebrafisk å være bedøvd viddha fiskegarn og slippe den i vannet som er utarbeidet for anestesi. Sebrafisk krever 3-6 s i kaldt vann for å være bedøvet, avhengig av fisken. Hold fisken i kaldt vann til det ikke lenger reagerer på ytre stimuli.
- Bruke fiskegarn, plasser bedøvet fisk på en forberedt stykke gasbind, forlater hale ut av gasbind. Brett gasbind over fiskens hode og kropp slik ut bare halen. Sett fisken dekket med gasbind på petriskål.
- Bruk stålet for å gjøre en diagonal snitt bare mellom gattfinnen og kaudal fin. Blodet begynner å komme ut. På dette punktet, er det nødvendig å arbeide raskt.
- Forsiktig aspirere blod som kommer ut med P20 pipettor (pre-lastet med en lav oppbevaring spissen). Mengden blod som kan samles, avhenger av størrelsen på fisken og i hvilken grad det var bedøvet riktig. Det varierer vanligvis 5-20 mL. Når blodet stopper coming ut, forsiktig overføre strebet blod inn i et rør.
- For å unngå hemolyse, er det avgjørende at røret med blod i det håndteres meget forsiktig, uten noen drastiske bevegelser til den er plassert inn i sentrifugen.
- For å unngå hemolyse, er det også viktig at blodprøven festes i sentrifugen innen 10 minutter etter blodprøvetaking.
- Hvis nødvendig, er det mulig å kombinere blod fra mer enn ett dyr, gjør et basseng. Samleprøver vil fungere greit så lenge forsinkelsen mellom blodprøvetaking fra den første fisken og sentrifugering ikke overstiger 10 minutter.
- Når blodet samlingen er ferdig, sentrifuger blodet i 10 minutter ved 0,5 g (Eppendorf Centrifuge 5415D).
- Etter sentrifugering, er serumet på det øverste laget av røret. Med en pipette, aspirer serum, og sørg for å få akkurat serum samtidig begge lag godt fordelt og stabil.
- Overfør serumet til et nytt microtube og deter klar til å brukes i biokjemiske analyser. Serumet kan lagres i is mens det venter å starte de biokjemiske analysene.
- Hvis serum ikke vil bli brukt umiddelbart, kan det fryses ved -18 ° C i opp til ca 3 måneder.
2. Representative Resultater
Det var mulig å samle 5-20 mL av fullblod fra hver fisk hva representerer enda fire ganger mer blod enn tidligere beskrevet teknikker (tabell 2). Biokjemisk analyse av total kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol og triglyserider ble utført etter blodprøvetaking ved hjelp av denne teknikken. To grupper av begge kjønn fisk ble fastet i 24 timer før blodprøvetaking for å unngå matinntak forstyrrelser. Analysene ble utført med små skalerte kolorimetriske tester (Labtest Diagnostica SA, Brasil) for total kolesterol og triglyserider analysene ble 3 mL serum brukes. For LDL-kolesterol og HDL-kolesterolanalyse, 4 mL og 10 mL av serum ble brukt, henholdsvis. Disse analysene ble utført på samleprøver av 10 sebrafisk per prøve.
Serum lipidic nivåene ble sammenlignet mellom fisk som åpnet sine egne egg, og de som, i en bunn dekket akvarium, ikke har tilgang til sine egne egg for en eksperimentell varighet på 2 uker. Serum analyse viste at serumnivået av totalkolesterol (med egg 362 ± 42 mg / dl og uten egg 357 ± 13 mg / dl), HDL-kolesterol (med egg 91,22 ± 1,79 mg / dL og uten egg 72,14 ± 2.89 mg / dL), og LDL-kolesterol (med egg 55,68 ± 10,88 mg / dL og uten egg 44,18 ± 9,84 mg / dl) var ikke signifikant forskjellig mellom gruppene. Imidlertid var triglyseridnivåer signifikant lavere i forsøksgruppen (uten egg 292 ± 64 mg / dl) enn i kontrollgruppen (med egg 457 ± 25 mg / dl, P = 0,03).
| & Nbsp; | Med tilgang til egg | Uten tilgang til egg |
| Total kolesterol (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - kolesterol (mg / dL) | 55.69 ± 18.84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL - kolesterol (mg / dL) | 91.23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| Triglyserider (mg / dL) | 457,64 ± 43.78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabell 1. Kolesterol og triglyserider seric nivåer for begge studerte grupper (med tilgang til egg og uten tilgang til egg) uttrykt i gjennomsnitt ± standardavvik.
* Statistisk signifikant (P = 0,03). Student t test.
| Aut hors | Sted for innsnitt | Høste metode | Bedøvelse | Mengde innsamlet blod |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Micro disseksjon posterior til ryggfinne | Mikropipette | Ikke nevnt MS222 3% i kaldt vann | En en 5 mL 5 en 10 mL |
| Eames et al., 2010 | Halshogging | Micro kapillærer tube | MS222 0,02% 28 ° C vann | 5 en 10 mL |
| Foreliggende undersøkelsen | Snitt mellom gattfinnen og kaudale fin | Mikropipette og lave oppbevaring tips | Vann og is chips | 5 en 20 mL |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet presenterer en enkel teknikk som gjør at ytterligere blod og serum analyse i sebrafisk eksperimenter. Denne teknikken har potensial til å bidra til fremtidige sebrafisk hematologisk studier som krever blod Parameterdataene. Det bør også gi rom for større bruk av sebrafisk som en eksperimentell modell.
Denne teknikken krever ikke spesielle ferdigheter eller gjennomføring av en presis teknikk. Dessuten gjør det opp doble mengden blod samles i forhold til andre teknikker, og dermed noe som åpner for bruk av færre fisk å få den nødvendige mengden av biologisk materiale. Teknikken har en kritisk punkt, som er at blodprøvene skal håndteres forsiktig som sebrafisk blod kan medføre hemolyse veldig enkelt. Tidsforsinkelsen mellom blodprøvetaking og sentrifugering må være strengt begrenset. En 10-minutters grensen skal forhindre hemolyse. Hastigheten og varigheten av sentrifugering (0,5 g i 10 minutter) Should også følges nøye.
Andre blodprøverør teknikker ble forsøkt før denne teknikken ble utviklet. Var imidlertid antall dyr brukt store og veldig små mengder blod ble samlet fra hver fisk. Denne nye teknikken tillot bruk av færre dyr, ble vist å være mulig med lave ferdighetsnivå utøvere, og ga bedre resultater enn andre teknikker i forhold til mengden blod innsamlet fra hver fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo en Pesquisa e Eventos
Capes - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
