Summary
Bu kağıt Zebra balığı dorsal aortadan kan toplanması için bir teknik sunuyor. Ayrıca bu tür kolesterol ve trigliserid düzeylerini belirlemek için testler gibi biyokimyasal analizlerde kullanılmak üzere serum elde etmek için yönergeler sağlar.
Abstract
Zebrafish çok insan hastalığı çalışmaları için bir hayvan modeli olarak kullanılmıştır. Bu moleküler olaylar ve tedavi edici stratejilerin çalışmaları yanı sıra bazı patolojiler 1 fizyolojik mekanizmaların değerlendirilmesi için güçlü bir preklinik bir platform olarak hizmet verebilir.
Araştırmacılar zebrabalıkları sistemlerinin araştırılması izin vermek için gerekli temel teknikleri 3 eksik olduğu sonucuna yol açabilir organ ve sistemleri 2, yetişkin zebrabalıkları fizyolojisi ile ilgili nispeten az sayıda yayın vardır. Zebra balığı hematolojik biyokimyasal değerler ilk önce 1999 yılında Jagadeeswaran ve arkadaşları tarafından tanımlanan bir kan toplama tekniği istihdam Murtha ve arkadaşları 4 tarafından 2003 yılında bildirilmiştir. Kısaca, kan uzunluğu, yaklaşık 0.3 cm dorsal aorta 5 bölgede, yanal bir kesi mikropipet ucu ile toplanmıştır. Söz dakikalık boyutlar, bu yüzdenBir çok yetenekli uygulayıcısı gerektiren yüksek hassasiyetli bir tekniktir. Aynı teknik aynı yıl 6 başka yayın aynı grup kullanılmıştır. 2010 yılında, Eames ve arkadaşları Zebra balığı 7 tam kan glikoz düzeyleri değerlendirildi. Onlar makasla decapitations performans ve daha sonra göğüs eklem içine bir heparinize microcapillary toplama tüpü takılarak kan erişim kazandı. Onlar iş Kilpatrick ve ark göre uygun bir depolama sıcaklığı ile çözüldü hemoliz zorluklar söz. 8. Laboratuvarımızda Jagadeeswaran tekniğini kullanmaya çalışırken, biz toplama başlamış olabilir önce kaybolmuş kan önemli miktarda izin vermeme gibi kesin doğru yerde kesi yapmak için zor olduğunu bulundu.
Son zamanlarda, Gupta ve ark. 9 yetişkin zebrabalıkları organları, Kinkle ark incelemek anlattı. 10 intraperiton nasıl gerçekleştirileceği açıklananeal enjeksiyonları ve Pugach ve ark. 11 retroorbital enjeksiyonları nasıl gerçekleştirileceği açıklanmıştır. Ancak, daha fazla iş daha tam zebrabalıkları araştırma için temel teknikler araştırmaya ihtiyaç vardır.
Zebra balığı sayısının küçük bir deneysel model olarak kullanan araştırmacılar için büyük güçlükler. Ayrıca ölçek küçüklüğü, bu verilen, basit teknikleri araştırmacılar zebrabalıkları modelin avantajlarını keşfetmek sağlamak amacıyla geliştirilmiş olması önemlidir.
Protocol
1. Protokol Metni
- Zebrafish kan toplama önce, anestezi su hazırlamak için gereklidir. 500 ml kapasiteli bir konteyner içine akvaryum su ~ 200 ml dökün. Buz yongaları ~ 200 g ekleyin. 4 ° C sıcaklıkta yaklaşık olmalıdır Buz yongaları eriyik gibi, 4 ° C civarındaki sabit bir sıcaklıkta muhafaza etmek daha buz yongaları eklemek için gerekli olacaktır
- Anestezi su hazır olduğunda, kan toplama için gerekli malzemeleri hazırlar. Bir P20 pipet düşük tutma ucu koyun ve kolayca erişilebilir pipet bırakın. Pipet bulaşma kaynakları temasa izin vermeyin.
- Kuru gazlı bez parçası ile Petri örtün. Bir çelik bıçak ve gazlı bez başka bir parça kolay erişilebilen bir yere konulmalıdır.
- Plastik borular için uyarlanmış bir santrifüj gerekli olacaktır.
- Söz konusu malzeme hazırlandığı zaman, anestetize wit olarak birinci zebrafish yakalamakha balık ağı ve anestezi için hazırlanmış olan suya bırakın. Zebrafish soğutulmuş su içinde 3-6 s balık bağlı olarak anestezi uygulanmış olması gerekir. Artık dış uyaranlara yanıt verene kadar soğuk suda balık tutun.
- Balık ağı kullanarak, tül kuyruk dışı bırakarak, gazlı bez hazırlanmış bir parçası üzerinde anestezi balığı yerleştirin. Sadece kuyruğunu dışarıda bırakarak balığın baş ve vücut üzerinde gazlı bez katlayın. Petri tabağına gazlı bez ile kaplı balık koyun.
- Sadece anal yüzgeç ve kuyruk yüzgeci arasında çapraz bir kesi yapmak için çelik bıçak kullanın. Kan dışarı çıkmaya başlayacaktır. Bu noktada, hızlı bir şekilde çalışması için gereklidir.
- Yavaşça P20 pipet (düşük tutma ucu ile ön yüklü) ile çıkan kanın talip. Toplanabilir kan miktarı balık boyutuna ve ne doğru anestetize olduğu ölçüde değişir. Bu, genellikle 5 ile 20 ul kadar değişir. Kan c dururdışarı oming, yavaşça bir tüp içine aspire kan aktarın.
- Hemoliz önlemek için, bunun santrifüj yerleştirilir kadar kan ile tüp herhangi bir sert hareketler yapmadan, çok dikkatle ele alınması önemlidir.
- Hemoliz önlemek için, kan örneği kan toplama 10 dakika içinde santrifüj temin edilmesi de önemlidir.
- Eğer gerekirse, bunun bir havuz verme, birden fazla hayvandan kan birleştirmek mümkündür. Pooled örnekleri ilk balık ve santrifüj kan toplama arasındaki gecikme 10 dakika aşmadığı sürece iyi çalışır.
- Kan toplama yapıldığında, 0.5 g (Eppendorf Santrifüj 5415D) 10 dakika boyunca kan santrifüjlenir.
- Santrifüjleme takiben, serum borusunun üst tabaka yer almaktadır. Bir pipet ile, her iki katmana da bölünmüştür ve istikrarlı tutarken sadece serum almak için emin, serum aspire.
- Yeni bir mikrotüp içine serum transferi ve bubiyokimyasal analizlerde kullanılmak üzere hazırdır. Bu biyokimyasal analizler başlamak için beklerken serum buz saklanabilir.
- Serum hemen kullanılmayacak ise, yaklaşık 3 ay -18 ° C kadar dondurulabilir.
2. Temsilcisi Sonuçlar
Daha önce açıklanan teknikler (Tablo 2) bile 4 kat daha fazla kan neyi temsil ettiğini her balıktan tam kan 5 ila 20 ul toplamak mümkün olmuştur. Total kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol ve trigliserid biyokimyasal analizler bu tekniği kullanarak kan alımından sonra yapıldı. Kan toplama gıda alımı girişimi önlemek için önce her iki cinsiyette balık iki grup 24 saat aç bırakıldı. Analizleri total kolesterol ve trigliserid analizleri için küçük ölçekli kolorimetrik testler (Labtest Diagnostica SA, Brezilya) ile yapıldı, serum 3 ul kullanılmıştır. LDL-kolesterol ve HDL-kolesterol içinanalizi, 4 ul ve 10 ul serum sırasıyla kullanılmıştır. Bu analizler, örnek başına 10 zebrabalıkları havuzlanmış örnekleri üzerinde yapılmıştır.
Serum lipidik düzeyleri kendi yumurta ve bir alt kapalı akvaryum, 2 haftalık bir deneme süresi için kendi yumurtalarını erişimi olmadığını, bu erişilebilir balıklar arasında karşılaştırıldı. Serum analizleri, serum total kolesterol düzeyleri (yumurta 362 ± 42 mg / dL ve yumurta 357 olmadan ± 13 mg / dL), HDL-kolesterol (yumurta 91,22 ± 1.79 mg / dL ve yumurta 72.14 olmadan ± 2.89 mg / dL) ve (yumurta 55,68 ± 10.88 mg / dL ve yumurta 44.18 ± 9.84 mg / dL olmadan) LDL-kolesterol gruplar arasında anlamlı farklılık yoktu. Ancak, trigliserid düzeyleri (p = 0.03 yumurta 457 ± 25 mg / dL) ile kontrol grubuna göre (yumurta 292 ± 64 mg / dL olmadan) deney grubunda anlamlı olarak daha düşüktü.
| & Nbsp; | Yumurta erişim | Yumurta erişimi olmayan |
| Total Kolesterol (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23.08 |
| LDL - kolesterol (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44.19 ± 17.05 |
| HDL - kolesterol (mg / dL) | 91,23 ± 3.11 | 72.14 ± 5.01 |
| Trigliserid (mg / dL) | 457,64 ± 43.78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tablo 1. Her iki çalışma grupları için kolesterol ve trigliserid düzeyleri Seric (yumurta erişimi olan ve yumurta erişim olmadan) ortalama ± standart sapma olarak ifade edilmiştir.
* Istatistiksel olarak anlamlı (p = 0.03). Student t testi.
| Aut hors | Kesi yeri | Hasat yöntemi | Anestezi | Toplanan kan miktarı |
| Jagadeeswaran et. ark., 1999 Murtha ve ark., 2003 | Dorsal yüzgeç Micro diseksiyon posterior | Mikropipet | Bahsedilmeyen Soğuk su içinde% 3 MS222 | 1, bir 5 ul 5, 10 ul |
| Eames ve ark., 2010 | Işten çıkarma | Mikro kılcal tüp | MS222% 0,02 28 ° C su | 5, 10 ul |
| Mevcut Çalışma | Anal yüzgeç ve kuyruk yüzgeci arasında Kesi | Mikropipet ve düşük tutma ipuçları | Su ve buz yongaları | 5, 20 ul |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu kağıt zebrabalıkları deneylerde daha fazla kan ve serum analiz sağlayan basit bir teknik sunuyor. Bu teknik, kan parametre veri gerektiren gelecekte zebrabalıkları hematolojik çalışmalara katkıda bulunma potansiyeline sahiptir. Ayrıca, bir deneysel model olarak zebrafish daha fazla uygulamalar için izin vermek gerekir.
Bu teknik, özel bir beceri ya da kesin bir tekniğin uygulanmasını gerektirmez. Dahası, bu sayede, biyolojik malzemenin gerekli miktarda elde etmek için daha az balık kullanılmasına imkan verir, çift kadar diğer tekniklere göre alınacak kan miktarı sağlar. Teknik zebrabalıkları kan çok kolayca hemoliz tahakkuk gibi kan örnekleri dikkatle ele alınması olduğunu bir kritik adım vardır. Kan toplama ve santrifüj arasındaki zaman gecikmesi sıkı bir şekilde sınırlı tutulmalıdır. 10 dakikalık bir sınırı hemoliz önlemelidir. Santrifüjleme ile hızı ve süresi (10 dakika boyunca 0.5 g) should de kesinlikle takip edilmesi.
Bu tekniği geliştirildi önce Diğer kan toplama teknikleri denendi. Bununla birlikte, kullanılan hayvan sayısı kan büyük ve çok küçük miktarlarda her balığın toplandı idi. Daha az sayıda hayvan kullanımına izin verilen bu yeni teknik, düşük beceri düzeyi uygulayıcılar ile mümkün olduğu gösterilmiştir ve her balık toplanan kan miktarı açısından diğer tekniklere göre daha iyi sonuçlar verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo bir Pesquisa e Eventos
Pelerin - Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Üstün
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
