Summary
Detta dokument presenterar en metod för uppsamling av blod från den dorsala aortan hos zebrafisk. Den tillhandahåller också instruktioner för att erhålla serum för användning i biokemiska analyser, såsom tester för bestämning av kolesterol-och triglyceridnivåer.
Abstract
Zebrafisk har använts som en djurmodell för studier av flera humana sjukdomar. Det kan fungera som en kraftfull prekliniska plattform för studier av molekylära händelser och terapeutiska strategier samt för att utvärdera de fysiologiska mekanismer för vissa sjukdomar 1.
Det finns relativt få publikationer relaterade till vuxna zebrafisk fysiologi organ och system 2, vilket kan leda forskarna att dra slutsatsen att de grundläggande tekniker som behövs för att möjliggöra undersökning av zebrafisk system saknas 3. Hematologiska biokemiska värden för zebrafisk först rapporterades 2003 av Murtha och hans kollegor 4 som anställd en teknik blodinsamling först beskrivits av Jagadeeswaran och kollegor i 1999. Kortfattat uppsamlades blod via en mikropipett spets genom en tvärgående incision, ca 0,3 cm i längd, i området för den dorsala aortan 5. På grund av de berörda små dimensioner, dettaär en hög precision teknik som kräver en mycket skicklig utövare. Samma teknik användes av samma grupp i en annan publikation samma år 6. Under 2010 bedömde Eames och kollegor hela blodsockernivåer i zebrafisk 7. De fick tillgång till blodet genom att utföra halshuggningar med sax och sedan sätta in en hepariniserat mikrokapillär uppsamlingsrör i bröstmuskeln artikulation. De nämner svårigheter med hemolys som löses med en lämplig förvaringstemperatur bygger på det arbete Kilpatrick et al. 8. När du försöker använda Jagadeeswaran s teknik i vårt laboratorium, fann vi att det var svårt att göra snittet på precis rätt ställe så att inte tillåta en betydande mängd blod som förloras före insamlingen kunde startas.
Nyligen Gupta et al. 9 beskrivs hur man dissekera vuxna zebrafisk organ, Kinkle et al. 10 beskrivs hur du utför intraperitonEAL injektioner och Pugach et al. 11 beskrivs hur man utför retro-orbital injektioner. Dock mer arbete behövs för att mer fullständigt undersöka grundläggande tekniker för forskning i zebrafisk.
Den lilla storleken på zebrafisk innebär utmaningar för forskare som använder det som en experimentell modell. Dessutom med tanke på denna litenhet skala är det viktigt att enkla tekniker utvecklats för att ge forskarna möjlighet att undersöka fördelarna med zebrafisk modellen.
Protocol
1. Protokoll text
- Innan samla zebrafisk blod, är det nödvändigt att utarbeta bedövande vatten. Häll ~ 200 ml akvarium vatten i en behållare med en 500-ml volym. Tillsätt ~ 200 g isbitar. Temperaturen bör vara ca 4 ° C. Eftersom de isbitar smälta, kommer det att vara nödvändigt att lägga till fler isbitar att bibehålla en konstant temperatur nära 4 ° C.
- När bedövande vattnet är klart, förbereda material som behövs för provtagningen. Sätt en låg kvarhållande spets på en P20 pipett och lämna pipetten där den lätt kan nås. Låt inte pipettspetsen att kontakta alla källor till föroreningar.
- Täck en petriskål med en bit torr gasväv. Ett stål blad och en annan bit gasbinda bör placeras på en lättillgänglig plats.
- En centrifug anpassad för plaströr kommer att behövas.
- När ovan nämnda materialen är beredda, fånga den första zebrafisk att vara sövd nämligenha fisknät och släpp den i vatten som har förberetts för anestesi. Zebrafisk kräver 3-6 s i kylt vatten till bedövas, beroende på fisken. Hålla fisken i kallt vatten tills den inte längre svarar på yttre stimuli.
- Med hjälp av fisknät, placera bedövade fisken på en förberedd bit gasbinda och lämna svansen bort från gasväv. Vik gasväv över fiskens huvud och kropp lämnar endast svansen. Sätta fisken täckt med gasväv på Petri-skålen.
- Använd stålblad för att göra en diagonal snitt bara mellan analfenan och stjärtfenan. Blodet börjar att komma ut. Vid denna punkt är det nödvändigt att arbeta snabbt.
- Försiktigt aspirera blod som kommer ut med P20 pipetten (pre-loaded med låg behålla spets). Den mängd blod som kan uppsamlas beror på storleken på fisken och i vilken utsträckning det sövdes korrekt. Det varierar vanligen från 5 till 20 ^. När blodet slutar coming ut försiktigt över den aspirerade blod till ett rör.
- För att undvika hemolys, är det kritiskt att röret med blod i den hanteras mycket försiktigt, utan några drastiska förändringar tills den är placerad i centrifugen.
- För att undvika hemolys, är det också viktigt att blodprovet fästas i centrifugen inom 10 minuter efter bloduppsamling.
- Om nödvändigt är det möjligt att kombinera blod från mer än ett djur, vilket gör en pool. Samlingsprover fungerar bra så länge fördröjningen mellan blod samling från den första fisken och centrifugering inte överstiger 10 minuter.
- När bloduppsamling är gjort, centrifugera blodet under 10 minuter vid 0,5 g (Eppendorf-centrifug 5415D).
- Efter centrifugering, är serum vid det översta lagret av röret. Med en pipett, aspirera serum och se till att få precis serum samtidigt båda lagren väl uppdelade och stabil.
- Överför serumet till ett nytt mikrorör ochär redo att användas vid biokemiska analyser. Serumet kan lagras på is medan den väntar att starta de biokemiska analyser.
- Om serumet inte kommer att användas omedelbart, kan den frysas vid -18 ° C under upp till ca 3 månader.
2. Representativa resultat
Det var möjligt att samla in 5 till 20 pl helblod från varje fisk vad representerar ännu 4 gånger mer blod än tidigare beskrivna tekniker (tabell 2). Biokemisk analys av totalt kolesterol, HDL-kolesterol, LDL-kolesterol och triglycerider utfördes efter bloduppsamling användning av denna teknik. Två grupper av båda könen fisk fasta i 24 timmar innan blodinsamling för att undvika störningar födointag. Analyserna gjordes med småskalig kolorimetriska tester (Labtest Diagnostica SA, Brasilien) för totalt kolesterol och triglycerid analyser har 3 pl serum som används. För LDL-kolesterol och HDL-kolesterolanalys, 4 | il och 10 | il serum användes, respektive. Dessa analyser utfördes på poolade prover av 10 zebrafisk per prov.
Serum lipidiska nivåerna jämfördes mellan fisk som visats sina egna ägg och de som i en täckt botten akvarium, inte hade tillgång till sina egna ägg för en experimentell varaktighet på 2 veckor. Serum analys visade att serumnivåerna av totalkolesterol (med ägg 362 ± 42 mg / dl och utan ägg 357 ± 13 mg / dL), HDL-kolesterol (med ägg 91,22 ± 1,79 mg / dl och utan ägg 72,14 ± 2,89 mg / dL) och LDL-kolesterol (med ägg 55,68 ± 10,88 mg / dL och utan ägg 44,18 ± 9,84 mg / dL) skilde sig inte signifikant mellan grupperna. Emellertid var triglyceridnivåer signifikant lägre i den experimentella gruppen (utan ägg 292 ± 64 mg / dL) än i kontrollgruppen (med ägg 457 ± 25 mg / dL, P = 0,03).
| & Nbsp; | Med tillgång till ägg | Utan tillgång till ägg |
| Totalt kolesterol (mg / dl) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - kolesterol (mg / dl) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - kolesterol (mg / dl) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Triglycerider (mg / dl) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tabell 1. Kolesterol och triglycerider seric nivå för båda studerade grupperna (med tillgång till ägg och utan tillgång till ägg) uttryckt i medelvärde ± standardavvikelse.
* Statistiskt signifikant (P = 0,03). Students t-test.
| Aut hors | Plats för snittet | Skörd metod | Anestesi | Mängden uppsamlat blod |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Micro dissekering posteriort ryggfenan | Mikropipett | Som inte nämns MS222 3% i kallt vatten | 1 en 5 ^ il 5 en 10 | il |
| Eames et al., 2010 | Dekapitering | Mikro kapillärer röret | MS222 0,02% 28 ° C vatten | 5 en 10 | il |
| Föreliggande studie | Incision mellan analfena och stjärtfena | Mikropipett och låga tips bevarande | Vatten och is chips | 5 en 20 | il |
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar en enkel teknik som tillåter ytterligare blod och serum analys i zebrafisk experiment. Denna teknik har potential att bidra till framtida zebrafisk hematologiska studier kräver uppgifter blod parameter. Det bör också möjliggöra större tillämpningar av zebrafisk som en experimentell modell.
Denna teknik kräver inga speciella kunskaper eller genomförande av en exakt teknik. Dessutom möjliggör den upp dubbla mängden blod som skall samlas i förhållande till andra tekniker, vilket möjliggör användning av mindre fisk för att erhålla den erforderliga mängden av biologiskt material. Tekniken har en avgörande steg, nämligen att blod prover hanteras försiktigt eftersom zebrafisk blod kan ådra hemolys mycket lätt. Tidsfördröjningen mellan blodinsamling och centrifugering skall begränsas. En 10-minuters gräns bör förhindra hemolys. Hastigheten och varaktigheten av centrifugering (0,5 g under 10 minuter) shouLD också vara strikt.
Andra blodprovstagning tekniker försökt innan denna teknik utvecklades. Var dock antalet använda djur stora och mycket små mängder blod togs från varje fisk. Denna nya teknik tillåtit användning av färre djur, visade sig vara genomförbart med låga utövare kompetensnivå och gav bättre resultat än andra metoder när det gäller den mängd blod som samlas in från varje fisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo en Pesquisa e Eventos
Capes - Coordenação de Aperfeiçoamento de pessoal de Nivel Överlägsen
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low retention tips | Applied Biosystems | 022493020 | |
| Eppendorf Centrifuge 5415D | Eppendorf | Discontinued |
References
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P.
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717 (2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126 (2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L.
