Summary
Her beskriver vi en fenotypisk analyse som gjelder for høygjennomstrømnings-/høyinnholdsskjermer av småintervenenserende syntetiske RNA (siRNA), kjemisk forbindelse og Mycobacterium tuberkulosemutantbiblioteker. Denne metoden er avhengig av påvisning av fluorescerende merket Mycobacterium tuberculosis innen fluorescerende merket vertscelle ved hjelp av automatisert konfikal mikroskopi.
Abstract
Til tross for tilgjengeligheten av terapi og vaksine, er tuberkulose (TB) fortsatt en av de mest dødelige og utbredte bakterielle infeksjonene i verden. Siden flere tiår er det plutselige utbruddet av multi- og omfattende legemiddelresistente stammer en alvorlig trussel for kontroll av tuberkulose. Derfor er det viktig å identifisere nye mål og veier som er kritiske for tuberkuloseens årsaksmiddel, Mycobacterium tuberkulose (Mtb) og å søke etter nye kjemikalier som kan bli TB-stoffer. En tilnærming er å sette opp metoder som passer for genetiske og kjemiske skjermer av store biblioteker som muliggjør søking av en nål i en høystakk. For dette formål utviklet vi en fenotypisk analyse som er avhengig av påvisning av fluorescerende merket Mtb i fluorescerende merkede vertsceller ved hjelp av automatisert konfokal mikroskopi. Denne in vitro-analysen tillater en bildebasert kvantifisering av koloniseringsprosessen til Mtb i verten og ble optimalisert for 384-brønns mikroplateformat, som er riktig for skjermer av siRNA-, kjemisk forbindelse- eller Mtb mutantbiblioteker. Bildene behandles deretter for multiparametrisk analyse, som gir avlesning på patogenesen av Mtb i vertsceller.
Introduction
Blant de fremvoksende og nye smittsomme patogenene som er rapportert i løpet av de siste årene, har Mycobacterium tuberculosis (Mtb) et fremtredende sted å være ansvarlig for 1,4 millioner dødsfall og 8,7 millioner nye infeksjoner i 2011 (Global tuberculosis report 2012, www.who.int/topics/tuberculosis/en/). Til tross for tilgjengeligheten av multidrug terapier, antall infiserte mennesker er fortsatt på vei opp og multidrug resistente (MDR) samt omfattende narkotikaresistente (XDR) Mtb sprer seg raskt over hele verden1. Videre, når man tar hensyn til tilstedeværelsen av Mtb antigener, er det tydelig at en tredjedel av den globale befolkningen anses å være latent smittet av Mtb. Statistisk sett, i ett tilfelle av ti, er det evolusjon mot den aktive sykdomsformen med påfølgende kliniske symptomer2. Derfor er det nødvendig med nye midler for å bekjempe Mtb. I denne sammenhengen utviklet vi en in vitro visuell fenotypisk analyse som er avhengig av å overvåke Mtb-invasjon og multiplikasjon i vertsceller ved automatisert konfokal fluorescensmikroskopi3. Tilpasningen av analysen i 384-brønns mikrotiterplater i kombinasjon med automatisert bildeanskaffelse og analyse tillot high-content/High-throughput Screening (HC/HTS) av mellomstore biblioteker av forbindelser, siRNAer og bakterielle mutanter. Screeningen av et genom bredt RNAi-bibliotek på denne fenotypiske analysen gjorde det dermed mulig å identifisere de viktigste vertsfaktorene som er involvert i Mtb-trafficking og intracellulær replikasjon, men også belysningen av vertsveier utnyttet av tuberkelbacillusen. En annen tilpasning av denne spesielle fenotypiske analysen var for identifisering av bakteriefaktorer som er avgjørende for Mtb intra-fagocomiell utholdenhet. For eksempel anses arrestasjonen av fagfellemodning som en av de viktigste mekanismene som letter overlevelse og replikering av Mtb i makrofag. Overvåkingen av subcellulær lokalisering av Mtb knock-out mutanter i fluorescerende merket-sure rom tillatt for identifisering av bakterielle gener involvert i overlevelsesprosessen4. Til slutt tilbyr høyinnholdsavbildningen av Mtb også en utmerket metode for å kvantifisere legemiddeleffektivitet for å hemme ulike fenomener som intracellulær bakterievekst3. Til sammen tillater denne typen høy gjennomstrømning fenotypisk analyse akselererende narkotikaoppdagelse mot TB, og dataene som samles inn av disse forskjellige tilnærmingene, bidrar til en bedre forståelse av vertsmanipulasjonen som utøves av Mtb.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Høy gjennomstrømning Genome-wide siRNA Screening
Screening utført i en human Type-II pneumocytter modell A549 celle linje ved infeksjon med Mtb H37Rv uttrykker Grønn Fluorescerende Protein (GFP). Denne fremgangsmåten er beskrevet i Figur 1A.
- Resuspend det tørkede siRNA-biblioteket som er lagret i moderplater (96-brønnsplater) med 1x siRNA-buffer for å nå en konsentrasjon på 4 μM, og overfør deretter 10 μl av blandingen til en 384-brønns datterplate (datterplate 1).
- Tilsett 10 μl 1x siRNA buffer i datterplate 1 for å fortynne siRNA med 2 ganger. Etter siRNA-resuspension forsegles plater med peelbar aluminiumsforsegling og kan lagres ved -20 °C minst 6 måneder og opptil 2-3 år, men lagringstiden kan variere avhengig av siRNA-bibliotekprodusentens anbefalinger.
- Fortynn siRNAer i datterplate 1 i datterplate 2 for å nå en konsentrasjon på 500 nM. Etter siRNA-resuspension forsegles plater med peelbar aluminiumsforsegling og kan lagres ved -20 °C minst 6 måneder og opptil 2-3 år, men lagringstiden kan variere avhengig av siRNA-bibliotekprodusentens anbefalinger.
- Før bruk, tine datter plate 2 ved romtemperatur.
- Ta 2,5 μl siRNA fra datterplate 2 og legg den i en 384-brønns analyseplate.
- I den samme 384-brønns analyseplaten i trinn 1,5, tilsett 2,5 μl negativ og positiv kontroll siRNA til sine respektive brønner.
- Fortynn transfeksjonsreagenset i 1x D-PBS for å gi nok løsning til å gi 0,1 μl transfeksjonsreagens i hver brønn og preinkubatere den fortynnede transfeksjonsløsningen ved romtemperatur i 5 minutter.
- Tilsett 7,5 μl av transfeksjonsreagens-/PBS-oppløsningsblandingen til hver brønn i analyseplaten og inkuber i 30 minutter ved romtemperatur.
- Tilsett 40 μl A549 celler (1500 celler/brønn) suspendert i RPMI 1640 medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS). Opprettholde celler i en 3 dagers inkubasjonsperiode ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2. Disse cellene deler seg hver 24 timer, og dermed er ca 12.000 celler i brønnene tre dager etter transfeksjon.
- Vask en to uker gammel GFP-uttrykkende Mtb H37Rv kultur ut med D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2) ved sentrifugering ved 4000 x g i 5 minutter og kast vaskene. Gjenta dette trinnet 3x. (For kulturbetingelser forGFP-Mtb H37Rv se protokoll 3).
- Suspender bakteriell pellet i 10 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og dekanter i 1 time ved romtemperatur for å tillate bakterielle aggregater til sediment.
- Samle bakteriell supernatant og mål OD600 (OD600 bør være mellom 0,6-0,8) og GFP-fluorescens (RFU-verdi) ved hjelp av en mikroplateleser for å bestemme bakteriekonsentrasjonen. Beregn titeren av suspensjonen ved hjelp av en referanseregresjonslinje som viser RFU-verdi = f (CFU-verdi) som var generert før eksperimentet på en annen kultur som var utarbeidet under de samme forholdene. Forbered bakteriell suspensjon som inneholder 2,4 x 106 bakterier/ml, noe som tilsvarer en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 5.
- Fjern mediet i den 384-brønns analyseplaten og tilsett 25 μl nylaget bakteriell suspensjon.
- Inkuber den 384-brønns analyseplaten ved 37 °C i 5 timer i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Fjern mediet og vask cellene forsiktig med RPMI medium supplert med 10% FBS 3x.
- For å drepe de resterende ekstracellulære bakteriene, behandle cellene med 50 μl fersk RPMI-FBS medium som inneholder 50 μg/ ml amikacin ved 37 °C i 1 time i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Fjern den middels inneholdende amikacin og tilsett 50 μl fersk RPMI medium supplert med 10% FBS. Inkuber den 384-brønns analyseplaten ved 37 °C i 5 dager i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Før bildeoppkjøp, tilsett 10 μl nytilberedt 30 μg/ml DAPI i PBS (sluttkonsentrasjon 5 μg/ml) og inkuber i 10 minutter ved 37 °C.
- Legg platen i et automatisert konfikalt mikroskop.
Klikk her for å vise større bilde. - Angi eksponeringsparameterne. Registrer DAPI fluorescens ved hjelp av eksitasjonslaser 405 nm med utslippsfilter 450 nm og GFP fluorescens ved hjelp av eksitasjonslaser 488 nm med utslippsfilter 520 nm.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Velg brønnene og feltene i hver brønn som skal anskaffes, som deretter kalles parametere for oppsett og underoppsett.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Generer eksperimentfilen ved hjelp av parameterne fra trinn 1.20 og 1.21, og kjør den automatiske anskaffelsen.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Overfør bilder til ekstern server.
Klikk her for å vise større bilde. - Evaluer bilder ved hjelp av programvare for bildeanalyse. Oppdag cellekjerner fra DAPI-kanal ved hjelp av nukleideteksjonsalgoritmen og bakterieområdet fra GFP-kanalen ved hjelp av algoritmen for pikselintensitetsegenskaper (Figur 4A).
Merk: Denne protokollen er optimalisert for å studere effekten av genaktivering på den intracellulære Mtb-veksten. Mtb er en bakterie med langsom vekst som deler hver 20. Etter 5 dager etter infeksjon er mengden ekstracellulær Mtb fortsatt lav i fravær av cellelys og påvirket ikke kvaliteten på analysen. Denne protokollen må optimaliseres når det gjelder lengde på antibiotikabehandling og inkubasjonstid som skal tilpasses siRNA-skjermer ved hjelp av hurtigvekstbakterier som Mycobacteria smegmatis og Escherichia coli som er omfattende utgitt og kan infisere nye celler.
2. Høy gjennomstrømning sammensatt screening
Screening utført på Mtb H37Rv infiserte vertsceller. Denne fremgangsmåten er beskrevet i Figur 1B.
- Tine de 384-brønns moderplatene som inneholder det sammensatte biblioteket, solubilisert i DMSO 100%. Overfør 0,5 μl av forbindelsene i 384-brønns datterplater som inneholder 10 μl RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS.
- Vask en to uker gammel GFP-uttrykkende Mtb H37Rv kultur ut med D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2) ved sentrifugering ved 4000 x g i 5 minutter og kast vaskene. Gjenta dette trinnet 3x (for kulturforholdene GFP-Mtb H37Rv se protokoll 3).
- Suspender bakteriell pellet i 10 ml RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og dekanter i 1 time ved romtemperatur for å tillate bakterielle aggregater til sediment.
- Samle bakteriell supernatant og mål OD600 (OD600 bør være mellom 0,6-0,8) og GFP-fluorescens (RFU-verdi) ved hjelp av en mikroplateleser. Beregn titeren av suspensjonen ved hjelp av en referanseregresjonslinje som viser RFU-verdi = f (CFU-verdi) som var generert før eksperimentet. Typisk konsentrasjon er 1 x 108 bakterier/ml.
- Høst 6 dager gamle primære menneskelige makrofager ved 4 x 105 celler/ml i RPMI 1640 medium supplert med 10% foster bovint serum (FBS) og 50 ng/ml rekombinant human M-CSF (For human Perifert blod Monocytt Celler rensing og makrofager differensiering se Protokoll 4).
- Inkuber de fortynnede primærcellene med baciller ved forskjellige MOI, alt fra 1-5, i suspensjon med mild risting ved 90 rpm i 2 timer ved 37 °C.
- Vask de infiserte cellene ved sentrifugering ved 350 x g for å fjerne de ekstracellulære bakteriene. Etter hvert sentrifugeringstrinn, resuspend pellet i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS. Gjenta dette trinnet 2x.
- Suspender de infiserte cellene i RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og amikacin ved 50 μg/ml og inkuber suspensjonen med mild risting i 1 time ved 37 °C.
- Fjern cellekulturmediet som inneholder amikacin ved sentrifugering ved 350 x g og vask de infiserte cellene med fullstendig RPMI 1640 medium supplert med 10% FBS og 50 ng / ml rekombinant human M-CSF. Gjenta én gang.
- Tilsett 40 μl av de infiserte makrofagene suspensjon i samme analyseplate i trinn 2.1, som allerede inneholder 10 μl av forbindelsens fortynning. Den endelige konsentrasjonen av DMSO i hver brønn har nå nådd 1%.
- Inkuber analyseplatene i 5 dager ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2.
- Flekk levende celler med celle-permeant fjernrød fluorescerende fargestoff.
- Legg platen i et automatisert konfikalt mikroskop.
Klikk her for å vise større bilde. - Angi eksponeringsparameterne. Registrer fjernrød fluorescens ved hjelp av eksitasjonslaser 640 nm med utslippsfilter 690 nm og GFP fluorescens ved hjelp av eksitasjonslaser 488 nm med utslippsfilter 520 nm.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Velg brønnene og feltene i hver brønn som skal anskaffes, som deretter kalles parametere for oppsett og underoppsett.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Generer eksperimentfilen ved hjelp av parameterne fra trinn 2.14 og 2.15 og kjør den automatiske anskaffelsen.
Klikk her for å vise større bilde.
Klikk her for å vise større bilde. - Overfør bilder til ekstern server.
Klikk her for å vise større bilde. - Evaluer bilder ved hjelp av programvare for bildeanalyse. Oppdag celleområde fra fjernrød kanal ved hjelp av algoritmen for egenskaper for pikselintensitet og bakterieområde fra GFP-kanal ved hjelp av algoritmen for bildepunktintensitetsegenskaper (Figur 4B).
Merk: Denne protokollen kan tilpasses for Mtb mutant bibliotek screening ved å erstatte forbindelser ved mutanter som uttrykker et fluorescerende protein (En brønn / En mutant) (Figur 1C, se også Brodin et al. 4). Fluorescerende mutanter blir først sådd i brønner (20 μl bakteriell suspensjon per brønn). Bakterier gjenvinnes deretter med 30 μl celleoppheng. Etter sentrifugering ved 350 x g i 1 min inkuberes platen ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2. Inkubasjonstid og MOI avhenger av analysen. Som et eksempel, for visualisering av tidlige cellulære hendelser som fagsforsuring, kan cellene bli smittet i 2 timer med MOI fra 1-20. Lysosomer er farget ved hjelp av Lysotracker fargestoff ved 2 μM i 1,5 timer ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5% CO2 og deretter festet med enten 10% formalin eller 4% paraformaldehyd (PFA). Confocal-bilder anskaffes og til slutt analyseres ved hjelp av bildeanalyseskript med passende algoritmer for lysosomer deteksjon og subcellulær lokalisering4.
3. Grønt fluorescerende protein som uttrykker mykobakterier tuberkulose H37Rv (GFP-H37Rv) kulturforhold
For langtidslagring ble GFP-H37Rv frosset i D-PBS (rundt 1 x 108 mykobakterier per hetteglass).
- Resuspend en frossen-lager hetteglass med GFP-H37Rv i en Erlenmeyer kolbe som inneholder 50 ml av 7H9 buljong medium supplert med Middlebrook OADC berikelse 10%, Glycerol 0,5%, Tween-80 0,05%, og Hygromycin B (50 μg/ml).
- Inkuber 8 dager ved 37 °C.
- Mål OD600 av GFP-H37Rv-kulturen.
- Fortynn GFP-H37Rv-kulturen for å oppnå OD600 = 0,1 i ferskt 7H9 buljongmedium supplert med Middlebrook OADC-berikelse 10%, Glyserol 0,5%, Tween-80 0,05% og Hygromycin B (50 μg/ml).
- Inkuber GFP-H37Rv ved 37 °C i 8 dager til før bruk til analysen.
4. Human perifere blodmonocyttceller Rensing fra fullblods- eller buffy-frakkpreparat
- Fortynn blodposen 2x i 1x D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2) som inneholder 1% FBS.
- Isoler monocyttene med Ficoll tetthet gradient sentrifugering ved 400 x g i 20 min.
- Samle de isolerte monocyttene.
- Vask monocyttene 3x med 1x D-PBS (fri for MgCl2 og CaCl2) som inneholder 1% FBS ved sentrifugering ved 400 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
- Konsentrer cellene opp til 1 x 107 celle / ml.
- Rens monocytter ved hjelp av CD14-magnetiske perler i henhold til produsentens protokoll (se Materialer).
- Etter CD14-monocytter rensing, frø cellene på 1,5 x 106 celle / ml i RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 40 ng / ml av menneskelige makrofager koloni stimulerende faktor (hM-CSF) og inkuberes i 4 dager ved 37 ° C i en atmosfære som inneholder 5% CO2.
- Etter 4 dager erstatte medium med frisk RPMI 1640 supplert med 10% FBS og 40 ng/ml hM-CSF og inkubert i 2 dager ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5% CO2.
- Etter 6 dager kan cellene brukes til analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Høy gjennomstrømning genom-bred siRNA screening
Mtb er i stand til å kolonisere immunceller in vitro samt flere andre lunge epitelceller. For eksempel er Mtbi stand til å infisere og skade A549 epitelceller som ofte brukes som modell for humane type II pneumocytter5-7. Dectin-1 ble rapportert som en vertscellereseptor involvert i Mtb-opptak, proinflammatorisk respons og antibakteriell effekt på intracellulær mykobakteriell vekst i A549 celle8. siRNA-tilstand beskrevet i protokoll 1 førte til 85 % av silencingeffektiviteten (data vist ikke). Silencing Dectin-1 uttrykk med siRNA førte til en reduksjon av intracellulær mykobakterier mengde i A549 celler. Faktisk, etter 3 dager med silencing og 5 dager med infeksjon, reduseres prosentandelen av infiserte celler to ganger i Dectin-1 taus A549-celler sammenlignet med celler transfektert med ikke-målrettende scramble siRNA (Figur 2A og 2B). Vi brukte prøvebasert normalisering av siRNA målrettet Dectin-1 sammenlignet med scramble for å definere Z-score. Som vist i figur 2C, fikk vi et Z-score gjennomsnitt rundt -15 for siRNA målrettet Dectin-1. Dectin-1 kan brukes som positiv kontroll for siRNA-skjermen for å oppdage andre nye vertsfaktor involvert i Mtb-kolonisering i pneumocytter som kan ha samme fenotype som med Dectin siRNA. Bruken av en siRNA som påvirker fenotypen som en kontroll på hver mikroplate under skjermen tillater normalisering av hver plate, noe som er nyttig når man ønsker å utføre hele genomskjermanalysen. Den statistiske parameteren Z' var 0,1 ved hjelp av kontrollbasert normalisering på scramble og siRNA målrettet Dectin1, som er en akseptabel verdi for validering av siRNA screening data.
Høyinnholds sammensatt screening
Sammensatt effektivitet på intracellulær bakterievekst evalueres ved å etablere en doseresponskurve (DRC) og normaliseres til referansepositive sammensatte og negative sammensatte løsningsmiddelkontroller. Representativ DRC for to referanseforbindelser, isoniazid (INH) og rifampicin (RIF), aktiv mot Mtb-vekst er vist i figur 3. Disse kurvene er oppnådd i humane primære makrofager infisert av en GFP-uttrykkende Mtb H37Rv-stamme, med avlesning etter 5 dager etter infeksjon. DMSO og INH ved en endelig konsentrasjon på henholdsvis 1% og 0,1 μg/ ml brukes ofte som negative og positive kontroller, noe som gir basale effektivitetsnivåer (0 og 100%) (Figur 3A). Etter bildeanalyseprosessen som er beskrevet i figur 4B,hentes multiparametriske data fra konfokale fluorescensbilder av infiserte menneskelige makrofager tatt av automatisert konfokalt mikroskop. Aktive forbindelser som påvirker den intracellulære replikeringen av Mtb i vertsceller førte til en reduksjon av mykobakteriell belastning, noe som tilsvarer området av GFP-signalet i celler på bilder (Figur 3B). Forholdet mellom intracellulært bakterieområde og totalt celleområde, beregnet ved hjelp av bildebasert analyseprogramvare, er plottet inn i funksjon av sammensatt konsentrasjon, som genererer DRC (Figur 3B). Disse kurvene tillater bestemmelse av både konsentrasjonen som kreves for å redusere bakteriebelastningen med 50% (IC50) og den minimale konsentrasjonen som kreves for å hemme 99% av bakteriell replikasjon (MIC99) (Figur 3C). Z' basert på kontrollen DMSO 1% og kontrollen INH 0,1 μg/ml var 0,49. Denne Z', virkelig nær 0,5, er akseptabel for å validere denne analysen.
Figur 1. Visual High Content Screening tilnærminger. Skjematisk representasjon av Mtb infeksjon modellsystem som brukes for siRNA (A), kjemiske forbindelser (B) og Mtb mutanter (C) skjermer. (A) siRNA bibliotekskjerm: cellene ble transfektert med siRNA i 3 dager i 384-brønnsplater ved hjelp av omvendt transfeksjonsmetode. siRNA transfected celler ble infisert medGFP-Mtb og inkubert i 5 dager ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5% CO2. Cellene ble deretter farget og bilder ble samlet inn ved hjelp av et automatisert konfikalt mikroskop. (B) Sammensatt bibliotekskjerm: forbindelsene ble fordelt i 384-brønnsplater. Cellefjæring ogGFP-Mtb ble inkubert sammen i 2 timer ved 37 °C. Infiserte celler ble sådd i platene og inkubert i 5 dager ved 37 °C i en atmosfære som inneholder 5 % CO2. Cellene ble deretter farget og bilder ble samlet inn ved hjelp av et automatisert konfikalt mikroskop. (C) Fluorescerende-Mtb mutantbibliotek: de fluorescerende Mtb-mutantene ble sådd i 384-brønnsplater og vertscellefjæringen ble distribuert. Inkubasjonstiden varierte avhengig av analysen. Cellene eller cellulære vesicles ble farget før automatisert bildeinnhenting. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 2. Dectin-1 silencing påvirker Mtb kolonisering i A549 celler. (A) Representative konfokale bilder (10X luftlinse) av A549 celler transfektet med ikke-målrettende siRNA (scramble) eller med siRNA spesifikk for Dectin-1 og infisert med GFP-Mtb H37Rv (MOI5) i 5 dager. Skalalinjen representerer 200 μm (A) GFP-Mtb H37Rv ble visualisert i grønt og cellene i rødt. Antall celler (A. Celledeteksjon) og den intracellulære GFP-Mtb H37Rv-belastningen (A. Bakterieområde) ble bestemt ved hjelp av bildebasert analyseprogramvare. (B) Grafisk fremstilling av prosentandelen infiserte A549-celler i 5 replikerer (w1 til w5) av Scramble siRNA (blå sirkler) og Dectin-1 siRNA (røde sirkler). (C) Grafisk fremstilling av Z-skår gjennomsnittet av Scramble siRNA og Dectin-1 siRNA. (*** p-verdi < 0,0001). Klikk her for å vise større bilde.
Figur 3. Doseresponskurve for aktive referanseforbindelser mot Mtb i humane makrofager. (A og B) Representative konfokale bilder (20X vannlinse) av menneskelige makrofager (rød, celle merket med rødt fluorescerende fargestoff) infisert med GFP-Mtb H37Rv (grønn) med en MOI1 i 5 dager. Skalalinjen representerer 50 μm. (A) Bilder av infiserte celler inkubert med DMSO 1% brukt som negativ kontroll i analysen. (B) Bilder av infiserte celler inkubert med økende konsentrasjon av to referanseforbindelser isonazid (INH) og rifampicin (RIF). (C) Doseresponskurver (DRC) av INH og RIF. Bildebasert analyse tillot bestemmelse av DRC for hver forbindelse som ble testet. DRC representerer forholdet mellom intracellulært GFP-bakterieområde og totalt celleområde (Y-akse), i funksjon av sammensatt konsentrasjon (loggskala, x-akse). I hver graf ble DRC av forbindelsen normalisert til den negative kontrollen DMSO 1% (0% hemming) og den positive kontrollen INH ved en konsentrasjon på 0,1 μg / ml (100% hemming). For hver forbindelse ble konsentrasjonen som kreves for å hemme 50% av bakteriekoloniseringen (IC50) og den minimale hemmende konsentrasjonen (MIC99) beregnet fra DRC. Klikk her for å vise større bilde.
Figur 4. Standard bildebasert analyse for å bestemme fluorescerende intracellulær mykobakterier. Bilder fra 384-brønnsplater ble anskaffet ved hjelp av et automatisert konfikalt mikroskop. I dette tilfellet ble 4 forskjellige bilder av samme brønn (felt) registrert. Hvert felt ble deretter analysert ved hjelp av bildebasert analyseprogramvare Acapella 2.6 (Perkin Elmer). (A) Hvert felt inneholdt to kanaler (to farger), en for bakteriene (grønn) og en for cellekjernene (blå kanal), som ble segmentert ved hjelp av følgende algoritme: i) nuclei-deteksjon ved hjelp av en innebygd Acapella-prosedyre, ii) cytoplasmadeteksjon, basert på nukleipopulasjonen, ved hjelp av en innebygd Acapella-prosedyre, iii) bakteriedeteksjon ved å holde bare piksler som intensiteten er høyere enn en manuelt definert terskel, iv) slå sammen celler posisjon med bakterier posisjon for å identifisere infiserte celler. Endelige resultater, uttrykt som et gjennomsnitt av de fire feltene, er det totale bakterieområdet, totalt antall celler, prosentandelen infiserte celler og bakterieområdet per celle (gjennomsnitt av alle infiserte celler). (B) Hvert felt inneholdt to kanaler, en for bakteriene (grønn kanal) og en for cellekjerner og cytoplasma (fjernrød kanal), som ble segmentert ved hjelp av følgende algoritme: i) filtrerer den opprinnelige kanalen ved hjelp av et anti-medianfilter, ii) og beholder bare bildepunkter der intensiteten er høyere enn en manuelt definert terskel (hver kanal har sin egen terskel), iii) som teller det gjenværende antallet piksler for hver kanal, iv) som slår sammen kanaler og teller antall piksler som deles av både bakterier og kjerner for å kvantifisere intracellulære bakterier. Endelige resultater, uttrykt som et gjennomsnitt av de fire feltene, er det totale bakterieområdet, det totale cellulære området, det totale arealet av intracellulære bakterier og forholdet mellom intracellulært bakterieområde og totalt celleområde. Klikk her for å vise større bilde.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her metodene som kreves for en fenotypisk analyse ved hjelp av en GFP-uttrykkende Mtb H37Rv-stamme for å infisere fluorescerende merkede vertsceller, noe som gjør det hensiktsmessig for skjermer med høyt innhold / høy gjennomstrømning. Denne protokollen kan brukes på et bredt spekter av forbindelser, fluorescerende sonder og Mtb-mutanter. For hver protokoll som er beskrevet ovenfor, kan fikserings- og immunmerkingstrinn utføres før bildeinnhenting. Vi bruker et automatisert fluorescerende konfokalt mikroskop utstyrt med en 20X (NA 0.70) eller 60X (NA 1.2) vannlinse for å skaffe bilder. Det konfiskere mikroskopet er utstyrt med 405, 488, 561 og 640 nm eksitasjonslasere. Den avgitte fluorescensen fanges opp ved hjelp av 3 kameraer forbundet med et sett med filtre som dekker en deteksjonsbølgelengde fra 450-690 nm. Det er viktig å merke seg at justeringen av mikroskopets eksitasjons- og utslippsinnstillinger avhenger av typen fargestoffer eller fluorokromer som brukes i hvert eksperiment. For fenotypiske analyser brukes DAPI eller Hoechst ofte ved 5 μg/ml i 10 minutter for å flekke kjerner. Celler kan imidlertid også farges med forskjellige fluorescerende fargestoffer som er spesifikke for påvisning av cytoplasma, membran eller cytoskjelett. Etter bildeinnhenting bør bilder analyseres ved hjelp av en bildebasert analyseprogramvare. Cellesegmenteringsalgoritmer basert på intensiteten til hvert bildepunkt bør brukes til å fastslå antall celler eller det intracellulære bakterieområdet (se figur 4). De genererte dataene bør veies opp mot et statistisk basert akseptkriterium for å validere robustheten og nøyaktigheten av analysen.
Skjermer med høy gjennomstrømning i stor skala er tids- og ressurskrevende eksperimenter. Derfor er det av største betydning å vurdere analysens egnethet på forhånd. Dataene som ble samlet inn fra fenotypiske skjermer ble visualisert ved hjelp av regnearkprogramvare som Excel og generelt normalisert per plate. De vanligste kvalitetsmålingene som brukes for både siRNA- og småmolekylskjermer er Z. Z er definert med gjennomsnitts- og standardavvik for både positive og negative kontroller9. Z kvantifiserer om analyseresponsen er stor nok til å validere søknaden for en fullskala skjerm med prøver. Rekkevidden til Z er negativ uendelig til 1, med >0,5 som en veldig god analyse, >0 en akseptabel analyse og <0 en uakseptabel analyse. Sammenlignet med de små molekylskjermene som styrken på kontrollene tillater validering av analysen med Z-> 0,5, påvirker variasjonen av siRNA-skjermer Z som pleier å være lavere (ofte mellom 0,0-0,5)10. Faktisk er suksessen til siRNA-skjermer avhengig av optimalisering av i) effektiviteten av siRNA-levering i cellene, ii) cytotoksisiteten indusert av transfeksjonen og iii) analysebetingelsen for effektiviteten av genaktivering. SiRNA kan enkelt transfekteres i ulike cellelinjer, for eksempel HeLa, etter produsentens transfeksjonsprotokoll, men effektiv siRNA-transfeksjon i noen cellelinjer, inkludert makrofager, er fortsatt en utfordring. Likevel kan viral vektormediert uttrykk for korte hårnål RNAer (shRNA) representere et godt alternativ11. For å unnslippe tolkningsvansker normaliseres dataene som samles inn fra siRNA-skjermer ofte i forhold til normal standardfordeling for å definere Z-poengsummen (også kalt Z-verdi) for hvert punkt10,12. Deretter ble treffprøver rangert i henhold til Z-poengsummen som vanligvis tilhører mindre enn -2 eller mer enn +2. Til slutt ble utvalgte treff på den primære skjermen testet på nytt i en sekundær skjerm, inkludert flere replikeringer for å bekrefte fenotypen som ble observert på primærskjermen.
Vår protokoll kan enkelt brukes på små skjermer med utstyr. For å oppnå dette er det nødvendig med analyse miniatyrisering i mikrotitreplatene og manipulering av bibliotek av molekyler for å optimalisere prosessen med bevaring, dispensering og blanding13. Videre anbefales det å bruke en automatisert robotplattform, inkludert dispensere, for å nøyaktig og reprodusere analyseforholdene i mikrotitreplatene. Den enorme mengden data produsert av høy gjennomstrømningsscreening (HTS) bør også administreres av database og et tilpasset rørledning for bildeanalyse av det konfiskere bildet, datalagring og overføring. Analysene som ble presentert i denne rapporten ble utført i Biosafety Level 3-innretningen (BSL3). Den strenge overholdelsen av sikkerheten i BSL3 øker vanskeligheten med skjermene. Faktisk må mye utstyr som kreves for skjermene være tilgjengelig i BSL3 og isolert for å beskytte arbeideren og miljøet mot forurensning. Derfor krevde installasjonen av den tilpassede rørledningen i BSL3 mye plass. Av denne grunn ble vår protokoll utviklet for å få maksimalt utført BSL3 som siRNA-transfeksjon og sammensatt overføring til platene. Celleinfeksjonen gjennom bildeinnhentingstrinn ble utført under BSL3-forhold. Bildene ble deretter overført i en dedikert server og analysert ut av BSL3.
Den fenotypiske analysen som er beskrevet her, var basert på to metoder for bildeanalyse (Figur 4). Den første metoden, som brukes til siRNA-screening, ble designet for å gi antall infiserte celler. Denne parameteren ble funnet å effektivt sammenligne effekten av genaktivering på Mtb intracellulær replikasjon. Ved screening av forbindelser var imidlertid en mer grunnleggende avlesning basert på det totale celleområdet tilstrekkelig til å tydelig identifisere aktive forbindelser. Siden denne andre metoden er raskere og enklere å implementere, ble den foretrukket for analyse av bilder som oppstår fra forbindelser screening. For å gå videre, kan mer fluorescerende fargestoffer og / eller merkingssonder legges til, og bildeanalyseskript kan optimaliseres for å generere multiparametriske data som colokalisering, nuklei og cellemorfologi, celledød, bakteriell aggregering, samt intracellulær smugling av bakteriene. Det er viktig å merke seg at for intracellulær handel eller colokaliseringsanalyser er det viktig å få Z-stabler for å kunne anvende en kumulativ vurdering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter er erklært.
Acknowledgments
Økonomisk støtte til dette arbeidet ble gitt av Det europeiske fellesskap (ERC-STG INTRACELLTB Grant n° 260901, MM4TB Grant n° 260872), Agence Nationale de Recherche, Feder (12001407 (D-AL) Equipex Imaginex BioMed) og Regionen Nord Pas de Calais. Vi anerkjenner takknemlig den tekniske hjelpen til Gaspard Deloison, Elizabeth Werkmeister, Antonino Bongiovanni og Frank Lafont fra plattformen BICeL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µclear-plate black, 384-well | Greiner Bio-One | 781091 | 127.8/86/15 MM with Lid, TC treated |
| CellCarrier 384-well plate | PerkinElmer | 6007550 | Black, Clear Bottom, with Lid, TC treated |
| V-bottom white, 384-well plate | Greiner Bio-One | 781280 | |
| sealing tape, breathable, sterile | Corning | 3345 | |
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | Transfection reagent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 34943 | |
| RPMI 1640 + GlutaMAX-I | Life Technologies | 61870-010 | Cell culture medium |
| D-PBS 1x [-]MgCl2/[-]CaCl2 | Life Technologies | 14190-094 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| D-PBS 1x [+]MgCl2/[+]CaCl2 | Life Technologies | 14190-091 | Dulbecco's Phosphate Salin Buffer |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 2610040-79 | |
| Ficoll Paque PLUS | Dutscher | 17-1440-03 | Ficoll for Peripherical Blood Monocyte Cells purification |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi | 130-050-201 | Purification of CD14+ Monocytes |
| Human M-CSF, premium gr. (1000 μg) | Miltenyi | 130-096-493 | Macrophage Colony Stimulating Factor |
| LS Columns | Miltenyi | 130-042-401 | Columns for CD14+ Monocytes isolation |
| Tween 80 | Euromedex | 2002-A | Mycobacteria culture |
| Glycerol high purity | Euromedex | 50405-EX | Mycobacteria culture |
| Middlebrook OADC enrichment | Becton-Dickinson | 211886 | Mycobacteria culture |
| 7H9 | Becton-Dickinson | W1701P | Mycobacteria culture |
| Versene 1x | Life Technologies | 15040033 | Nonenzymatic cell dissociation solution |
| DAPI | Life Technologies | D1306 | Nuclei dye |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | Nuclei dye |
| Syto60 | Life Technologies | S11342 | Nuclei/cytoplasm dye |
| Formalin | Sigma-Aldrich | HT5014 | Cell fixation solution |
| siRNA targeting Dectin-1 | Santa-Cruz | sc-63276 | |
| *siGenome* Nontargeted siRNA pool | Dharmacon | D-001206-14 | |
| Rifampicin | Sigma-Aldrich | R3501 | antibiotic |
| Isoniazid (INH) | Sigma-Aldrich | I3377-50G | antibiotic |
| Hygromycin B | Life Technologies | 10687-010 | antibiotic |
| Amikacin | Sigma-Aldrich | A1774 | antibiotic |
| Automated Confocal Microscope OPERA | PerkinElmer | Image acquisition | |
| Columbus 2.3.1 Server Database | PerkinElmer | Data transfer, storage, and analysis | |
| Acapella 2.6 software | PerkinElmer | Image-based analysis | |
| GraphPad Prism5 software | GraphPad | Statistical analysis | |
| Excel 2010 | Microsoft | Statistical analysis |
References
- Gandhi, N. R., et al. Multidrug-resistant and extensively drug-resistant tuberculosis: a threat to global control of tuberculosis. Lancet. 375, 1830-1843 (2010).
- Barry, C. E., et al. The spectrum of latent tuberculosis: rethinking the biology and intervention strategies. Nat. Rev. Microbiol. 7, 845-855 (2009).
- Christophe, T., Ewann, F., Jeon, H. K., Cechetto, J., Brodin, P. High-content imaging of Mycobacterium tuberculosis-infected macrophages: an in vitro model for tuberculosis drug discovery. Future Med. Chem. 2, 1283-1293 (2010).
- Brodin, P., et al. High content phenotypic cell-based visual screen identifies Mycobacterium tuberculosis acyltrehalose-containing glycolipids involved in phagosome remodeling. PLoS Pathog. 6, (2010).
- Bermudez, L. E., Goodman, J. Mycobacterium tuberculosis invades and replicates within type II alveolar cells. Infect. Immun. 64, 1400-1406 (1996).
- Dobos, K. M., Spotts, E. A., Quinn, F. D., King, C. H. Necrosis of lung epithelial cells during infection with Mycobacterium tuberculosis is preceded by cell permeation. Infect. Immun. 68, 6300-6310 (2000).
- McDonough, K. A., Kress, Y. Cytotoxicity for lung epithelial cells is a virulence-associated phenotype of Mycobacterium tuberculosis. Infect. Immun. 63, 4802-4811 (1995).
- Lee, H. M., Yuk, J. M., Shin, D. M., Jo, E. K. Dectin-1 is inducible and plays an essential role for mycobacteria-induced innate immune responses in airway epithelial cells. J. Clin. Immunol. 29, 795-805 (2009).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J. Biomol. Screen. 4, 67-73 (1999).
- Birmingham, A., et al. Statistical methods for analysis of high-throughput RNA interference screens. Nat. Methods. 6, 569-575 (2009).
- Carralot, J. P., et al. Automated high-throughput siRNA transfection in raw 264.7 macrophages: a case study for optimization procedure. J. Biomol. Screen. 14, 151-160 (2009).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. J. Biomol. Screen. 16, 775-785 (2011).
- Song, O. R., et al. Confocal-based method for quantification of diffusion kinetics in microwell plates and its application for identifying a rapid mixing method for high-content/throughput screening. J. Biomol. Screen. 15, 138-147 (2010).
