Summary
Uma descrição de como calibrar transferência Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) no perfil metabólico situ é apresentado. Os FIBS pode ser utilizado para medir os níveis intracelulares de metabolitos de forma não invasiva, contribuindo para o desenvolvimento de modelos metabólicas e elevado rendimento de rastreio de condições de bioprocessamento.
Abstract
Na era da biologia computacional, novos sistemas experimentais de alto rendimento são necessárias para preencher e refinar os modelos para que possam ser validadas para fins preditivos. Idealmente esses sistemas seria baixo volume, o que impede análises de amostragem e destrutivas, quando os dados do curso do tempo devem ser obtidos. O que é necessário é uma ferramenta de monitoramento em situ que pode relatar as informações necessárias em tempo real e de forma não invasiva. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres de concentrações intracelulares baseados em proteína. Uma classe especial de in vivo biossensores que tem encontrado aplicações em metabolito quantificação baseia-se na transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) entre duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha celular, eles têm tempos de resposta rápidos e sua cha espectralcas mudar de acordo com a concentração de metabolito no interior da célula. Neste papel, o método para a construção de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para glicose e glutamina e calibrar os FIBS in vivo em cultura de células em lotes a fim de permitir futura quantificação da concentração intracelular do metabolito é descrito. Os dados de batelada alimentada CHO culturas celulares demonstra que os FIBS foi capaz, em cada caso, para detectar a alteração resultante na concentração intracelular. Usando o sinal de fluorescência a partir das FIBS e a curva de calibração construída anteriormente, a concentração intracelular foi determinada com precisão, como confirmado por um ensaio enzimático independente.
Introduction
Monitoramento metabolito tem diversas aplicações em bioprocessing, incluindo o desenvolvimento de processos, mídia e design de alimentação e engenharia metabólica. Vários métodos estão disponíveis para as medições de concentração através da utilização de um enzimática, química 2, ou ensaios de ligação 3. Uma opção interessante é a utilização de fluorescência, em sensores biológicos in vivo como repórteres da concentração intracelular de metabolitos essenciais à base de proteínas. Em ensaios de ultra-baixo volume, a fluorescência é uma ferramenta conveniente como miniaturização realmente melhora a taxa de 4,5 sinal-ruído e sensores à base de proteínas podem ser geneticamente codificados sentido de que não há reagentes exógenos são necessários para análise de metabolitos. Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) biossensores consistem de duas proteínas fluorescentes ligadas por um domínio de ligação ao ligando. FRET é uma transferência não radiativa de energia a partir de um doador de foto-animado para um receptor molécula fluorescente loca ed em estreita proximidade (<100). Clivagem ligando ou ligação provoca uma alteração conformacional no sensor, o qual, por sua vez, induz uma mudança na proximidade dos fluoróforos, conduzindo a uma alteração na eficiência de TERF medido pela alteração no espectro de emissão. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) são constitutivamente produzido dentro da linha de células e as suas características espectrais são alteradas com base na concentração de metabolito no interior da célula. FIBS têm tempos de resposta rápidos, tornando-os ideais para a tomada de medidas para os modelos dinâmicos 6. Aplicações anteriores incluem o monitoramento único 7-9 e múltiplas 10 metabólitos e fornecendo dados sobre a distribuição espaço-temporal 11. FIBS podem ser criados de duas configurações: Apo-Max, onde a ligação do ligando perturba a proximidade dos fluoróforos reduzindo a transferência de energia e de Apo-Min, onde a ligação do ligando traz os dois fluoróforos em contacto mais próximo (Figura 1).
_content "> Neste trabalho, um protocolo para a construção são apresentados de ovário de hamster chinês (CHO), linhas celulares que expressam constitutivamente um FIBS para um metabolito de glucose ou glutamina. está estabelecido um método para a calibração do sensor in vivo, para permitir futura quantitativa medições de concentração de metabolito intracelular, tal como apresentado na Figura 2. Baseado nisto, a concentração intracelular de glucose ou glutamina pode ser determinada em fed-batch culturas de células CHO, em que os dois nutrientes foram adicionados em concentrações elevadas no processo. Os resultados demonstram que a utilização do sinal de fluorescência a partir das FIBS e da curva de calibração previamente construído, com precisão de previsão da concentração intracelular é possível, tal como foi confirmado por um ensaio enzimático independente. Este método oferece vantagens substanciais em relação às tecnologias analíticas correntes, porque ele não é invasivo, de baixo custo e rápida, dando um sinal em tempo real dos FIBS que podem ser monitored em toda a cultura.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Celular Linha Revival e Manutenção
- Reviver as células CHO em 9 ml de meio CD-CHO suplementado com 8 mM de L-glutamina e 10 ml / L de suplemento de 100x hipoxantina / timidina (meio de crescimento completo).
- Centrifugar a 100 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células em 10 ml de meio de crescimento completo fresco.
- Retirar uma amostra de 1 ml e determinar a concentração de células viáveis por microscopia de luz, utilizando o método de exclusão do corante azul tripano num hemocitómetro.
- Iniciar uma cultura com uma densidade de sementeira de 3 x 10 5 células / ml em 125 ml de frascos de agitação.
- Manter a cultura numa incubadora a 37 ° C, numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2, numa plataforma de agitação orbital rotativo a 120 rpm.
- Subcultura a cada 3-4 dias em meio de crescimento completo com uma densidade de sementeira de 2 x 10 5 células / ml.
2. A transfecção da linha celular com o plasmídeo Containing o Biosensor Gene
- Preparar DNA de plasmídeo utilizando um kit de purificação de plasmídeo em larga escala.
- Manter as células em condições adequadas (37 ° C, 5% CO 2) 12-24 h antes da transfecção para assegurar que as células são activamente dividir no tempo de transfecção.
- Contar as células usando o método de exclusão do corante azul de tripano, em seguida, se preparar um volume de trabalho de 20 ml de cultura de células em um frasco de agitação de 125 ml a uma concentração de 1 x 10 6 células / ml.
- Usar um kit de transfecção adequado para a linha celular em uso. O DNA de plasmídeo a proporção de reagentes de transfecção vai ser dependente da linha de células e o vector. Recomenda-se que esta é otimizado pelo teste de uma gama de relações dentro do intervalo especificado pelo fabricante antes de realizar as transfections finais. Também manter, pelo menos, uma cultura de controlo negativo que contém as células, mas não o ADN.
- Incubar durante 4 dias em modo estático e, em seguida, transferir para um Shaking plataforma rotativa a 125 rpm.
- Adicionar o antibiótico apropriado para a selecção do plasmídeo a uma concentração apropriada, tal como determinado por uma curva de mortalidade. Neste estudo, zeocina foi adicionado a uma concentração final de 400 ug / ml para selecção de células transfectadas.
- Mudança de mídia em um intervalo de tempo adequado para a linha celular, acrescentando antibiótico a cada vez, até que as células em controle de poço morreram.
- Use os poços mais confluentes para avançar para agitando culturas.
- Estabelecer um banco de células, congelando as células em frascos criogénicos contendo 10 7 células viáveis em 1 ml da mistura de congelação. Neste trabalho, esta é constituída por 92,5% de meio de crescimento e de 7,5% de dimetil sulfóxido.
3. Batch e Fed-batch Crescimento Celular Curve
- Seguir as instruções para a manutenção das células acima para estabelecer culturas de células em triplicado de células CHO transfectadas em 250 ml de frascos de agitação com um volume de trabalho de 50 ml.
- Manter a cultures em um incubador humidificado de células a 37 ° C, com 5% de CO 2, numa plataforma de agitação orbital rotativo a 125 rpm, e retirar amostras de 4,1 ml a partir de cada cultura de crescimento a intervalos de 24 h.
- Utilizar 100 ul da amostra para determinar a concentração de células e viabilidade celular viável com o método de exclusão de corante azul de tripano.
- Repetir até que a concentração de células viáveis é reduzido a zero.
- Repetir para as culturas de células alimentado com alimentação suplementar com a quantidade apropriada de glicose ou glutamina no dia 6 para restaurar as suas concentrações para os seus valores iniciais de 36 mM e 4 mM, respectivamente. Recomenda-se que as culturas de controlo adicional, também são mantidos, que estão a ser alimentados com o mesmo volume (12 ml, no caso) de água pura.
4. FRET Medidas Relação
- Tome 2 ml das amostras diárias removidos na etapa 3.2 e centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspterminou o sedimento celular em 2 ml de gelo frio de fosfato salina tamponada (PBS). Transferir este em uma placa de 6 poços e adicionar uma amostra de branco não contendo células para um poço.
- Medir os níveis de fluorescência azul e amarelo imediatamente em um comprimento de onda de excitação de 430/435 nm e emissão de comprimentos de onda 465/435 nm (azul) e 520/510 nm (amarelo).
- Calcular as relações de FRET (razão de fluorescência amarela detectados mais de fluorescência azul detectado).
5. Metabolite Ensaios
- Tome 2 ml das amostras diárias removidos na etapa 3.2 e centrifugar a 100 xg durante 5 min a 4 ° C. Remover o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento de células em 3 ml de PBS gelado e centrifugar novamente a 100 x g durante 5 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 3 ml de PBS gelado, como acima. Sonicar o 5x amostra por 3 min cada um em um pulso de 15 segundos ligado e 15 segundos desligado. Neste ponto, a célula adicionalcts podem ser congeladas, se desejar.
- Utilizado um kit de ensaio de glucose apropriada conforme as instruções do fabricante, em amostras de extractos de células para determinar a concentração de glucose intracelular (ver tabela de materiais).
Nota: Use padrões apropriados para a construção de uma curva padrão. Neste trabalho, a concentração dos padrões variaram entre 0-100 mM. - Usando as leituras para os padrões, construir a curva padrão e encontrar a equação linear de melhor ajuste (neste caso: y = 1310.51x - 723,43, onde y é a leitura de absorvância e x é a concentração de glucose).
- Calcular as concentrações de glicose utilizando a curva padrão e tendo em conta a diluição. A concentração de glucose intracelular pode ser calculada utilizando a seguinte equação:
Para as células CHO, o volume da célula única foi calculada usando um diâmetro de célula de 12 pM 12 - Usar um kit de ensaio de glutamina apropriado conforme as instruções do fabricante, em amostras de extractos de células para determinar a concentração de glutamina intracelular (ver tabela de materiais).
Nota: Use padrões apropriados para a construção de uma curva padrão. Neste trabalho, a concentração dos padrões variaram entre 0-2 mM. - Como em 5.5 acima, a curva de calibração (neste caso, y = 203.1x + 17.1, onde y é a leitura de absorvância e x é a concentração de glucose)
- Usando a curva padrão, calcular a concentração de glutamina das amostras, tendo em conta a diluição. A concentração de glutamina intracelular pode ser calculado usando a Equação 1 acima.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uma visão geral da metodologia é apresentada na Figura 2. No trabalho aqui apresentado, as células CHO foram transfectadas com o vector de linhas de células estáveis foram seleccionadas FIBS e a uma pressão de antibiótico de 400 ug / ml de zeocina. Por conseguinte, foram criadas duas linhas de células estáveis que expressam constitutivamente separados os sensores de glicose e glutamina. Figura 1 representa as configurações dos dois biossensores utilizados neste estudo. O sensor de glicose é baseado no princípio de Apo-Max e o plasmídeo correspondente é pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Esta é uma fusão de proteína fluorescente ciano melhorada (ECFP) e a variante Afrodite da proteína fluorescente verde melhorada (EYFP), para o mutante F16A da E. glicose coli / galactose periplasmáticas proteína de ligação. 11 resíduos de aminoácidos foram removidos da região ligante para melhorar a eficiência da TERF 13. Este vector foi clonado no vector pCDNA4/TO usando o unique Eco RI e Pst I sítios de restrição, que utiliza um promotor de citomegalovírus e um potenciador de SV40.
O sensor de glutamina é baseado no princípio de Apo-min (Figura 1) e o plasmídeo correspondente foi derivado a partir de uma inserção do amarelo citrino proteína fluorescente em E. periplasmático glutamina coli ligação às proteínas entre os aminoácidos 98 e 99 com uma ECFP ligado ao C-terminal. A estrutura foi rigidificado por deleção de resíduos da região de ligação, enquanto que a substituição de aminoácido D157N foi feito para o QBP para aumentar a afinidade para a glutamina, seguido por várias mutações para optimizar a eficiência de TERF 8. A glutamina FRET construção foi fornecido na pUTKan planta vector de expressão e foi digerido com BamHl e Sall para libertar o inserto. O último foi clonado nos sítios de restrição correspondentes do vector pET41a em moldura com a purificação de N-terminal de tAGS. A mesma inserção foi ligada ao vector pCDNA4/TO, após ter sido digerido com Bam HI e Xho I utilizando as extremidades coesivas compatíveis produzidos por Sall e Xhol, para produzir o vector de expressão de mamífero.
O plasmídeo de expressão foi confirmada por quantificar os níveis de mRNA dos biossensores utilizando qRT-PCR. Ambos os FIBS foram encontrados para ser activamente transcrita em 25-44 cópias de mRNA por célula assumindo β-actina em 3.000 transcrições por célula no nível médio-exponencial 14.
Batch cobrir as culturas de cada linha de células foram mantidas a recolha de amostras diárias para a calibração in vivo de cada FIBS. O perfil do crescimento de células viáveis das duas linhas de células é mostrada na Figura 3 e as medições correspondentes FRET e as concentrações do metabolito intracelular determinadas por ensaios enzimáticos são apresentados na Tabela 1. Um leitor de placas de fluorescência foi utilizada para medirfluorescência de amostras em um comprimento de onda de excitação de 430/35 nm e comprimentos de onda de emissão de 465/435 nm para ciano e 520/510 nm para amarelo. Verificou-se que o número de células presentes em baixas os primeiros 4 dias de cultura levou a FRET sinal confiável. Da mesma forma, o nível elevado de células lisados presente após 8 dias de cultura produziu uma quantidade de dispersão da luz. Somente os dados para os dias 4-8, por conseguinte, utilizados para construir as curvas de calibração para os FIBS glicose e glutamina, as equações para os quais são apresentados na Tabela 1. Os resultados mostram que o sinal FIBS produz uma correlação de confiança com as concentrações intracelulares entre 1-5 mM de glicose e 0,3-2 mM de glutamina.
Após isso e para validar as conclusões anteriores, descontínuo alimentado crescer demais culturas das duas linhas de células foram realizadas. Uma alimentação contendo uma elevada concentração de substrato (glicose no caso dos FIBS glicose e glutamina no caso de os FIBS glutamina) foi suplementadono dia 6 de cultura de células para elevar as concentrações extracelulares de substrato. No caso da cultura de glucose alimentada a concentração de glucose extracelular foi aumentada novamente até 36 mm, enquanto que para a cultura de glutamina-prandial, a concentração de glutamina foi aumentada para 4 mM. Figura 4 mostra resultados representativos deste estudo Figuras 4A e. 4C retratam as relações traste a cada dia, que respondem claramente à alimentação, invertendo a tendência de eles seguiram até ao dia 6. Especificamente, na Figura 4A, a proporção de FRET para a glicose FIBs linha celular CHO diminui no dia 7 em resposta à glicose, além disso, uma vez que os FIBS glicose segue a configuração APO-On. De modo semelhante, na Figura 4C, o rácio de FRET para a glutamina FIBs CHO linha celular aumenta em resposta à adição de glutamina, em conformidade com o princípio de sensores de Apo-Off.
Estas medições foram finalmente FRET utilizada para calcUlate o correspondente concentrações de glicose e glutamina intracelular com base nas curvas de calibração acima mencionados e os resultados são apresentados na Figura 4B para a glucose e a Figura 4D para glutamina. Eles são comparados com as concentrações intracelulares reais desses substratos, como determinado com a glicose e os ensaios enzimáticos de glutamina, e mostram concordância adequada.
.. Tabela 1 Resultados in vivo para a calibração da razão de FRET para glicose e glutamina FIBS As curvas de calibração são descritos pelas seguintes equações, que podem ser usados para fazer previsões: y = 8,034 + 1.232x para a glucose (R 2 = 0,961), e y = 0,332 + 1.892x por glutamina (R 2 = 0,879), onde y é a proporção de FRET e x é a concentração em mM.
Figura 1. Princípios do FIBS utilizados neste estudo. Os FIBS glutamina (esquerda) segue o princípio de Apo-Min, pelo que a glutamina se liga aos domínios de detecção e gera uma mudança conformacional que traz duas proteínas fluorescentes mais próximos, aumentando assim a FRET. Os FIBS glicose (direita) segue o princípio de Apo-Max, pelo qual a glucose se liga ao domínio de detecção e gera uma alteração conformacional que separa as proteínas fluorescentes, diminuindo, assim, a FRET.
Figura 2. Visão geral da metodologia para a calibração FIBS e posterior quantificação não-invasiva de glicose intracelular e concentrações de glutamina.
Perfil de concentração de células Figura 3. Viável para lote cobrir culturas de FIBS-glicose e glutamina FIBS-expressam as linhas de células CHO (n = 2 repetições biológicas com três medições por linha celular).
Figura 4. Cultura lote Fed de FIBS produtoras de células CHO e medições traste correspondente. (A) Daily measurements de rácio de FRET de batelada alimentada CHO culturas de células que expressam FIBS glicose. A seta indica a adição de glicose ao meio de cultura de células. (B) o perfil de concentração de glucose intracelular real medida utilizando um kit de ensaio de glucose contra valores previstos com base em glicose in vivo curva de calibração (tabela 1). (C) medições diárias de relação FRET de batelada alimentada CHO culturas de células que expressam FIBS glutamina. A seta indica a adição de glutamina à cultura de células. (D) A real perfil de concentração de glutamina intracelular medida utilizando um kit de ensaio de glutamina contra valores previstos com base em in vivo glutamina curva de calibração (tabela 1). Em todos os casos, n = 2 repetições biológicas com três medições por linha celular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os FIBS activar in vivo e in situ, a quantificação de moléculas-chave, neste caso nutrientes limitantes do crescimento, eliminando incertezas decorrentes de têmpera e métodos de extracção. Os resultados sugerem que existe uma boa correlação entre o sinal FIBS e as concentrações intracelulares na gama de 1-5 mM de glicose e 0,3-2 mM de glutamina. No lote CHO cultura de células, estas concentrações são encontradas nas fases de declínio exponencial, estacionárias, e no início. As fases exponencial e estacionária são os mais críticos em termos de concepção de estratégias adequadas de alimentação, o uso destes biossensores para estimar as exigências metabólicas das células, portanto, industrial relevante. Os resultados do experimento em batelada alimentada confirmar a adequação dos FIBS para fornecer estimativas de glicose intracelular e concentrações de glutamina. Desvios exibidos em momentos anteriores pode ter surgido por causa da menor num células viáveisbros e / ou por causa da interferência de outros metabolitos, por exemplo, por galactose, no caso de os FIBS de glucose, e por outros aminoácidos, no caso de os FIBS glutamina. Especificamente, demonstrou-se que uma redução de até 20% na proporção de FRET pode ocorrer na presença de aspartato, glutamato, glicina, treonina, valina e tirosina 15. No geral, estes resultados sugerem que o sinal de erro na FIBS é bastante baixa.
Embora esta metodologia só pode monitorar um número limitado de moléculas de cada vez, pode fornecer informações úteis para a linha celular e desenvolvimento de processos, ou mesmo a aquisição de dados para a validação de modelos matemáticos. Dada a diversidade de proteínas de ligação periplasmáticas, biossensores semelhantes podem ser desenvolvidos para uma série de moléculas pequenas, incluindo outros aminoácidos, açúcares, e iões, tais como o sulfato e fosfato de 16, tornando este um método versátil para o metabolito quantificação em tempo real em células vivas .
Um dos principais benefícios da utilização dos FIBS é a capacidade de obter medições em linha, potencialmente, de uma forma contínua. Por isso, o método se presta para aplicações de alto rendimento que pode reduzir a movimentação manual e acelerar os esforços de desenvolvimento. Com o aumento da disponibilidade de ambientes microreactor com funcionalidade built-in para a detecção de fluorescência, prevê-se que um metabólito habilitados para FIBS perfil de plataforma pode ser usada para triagem celular, mídia e otimização de processos e processo de scale-up.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Agradecemos ao professor Lobo Frommer (Carnegie Institution for Science, da Universidade de Stanford) para gentilmente nos fornecer a glicose FRET plasmídeo e Dr. Uwe Ludewig (Universidade Hohenheim) por gentilmente fornecer a glutamina FRET construir no pUTKan planta vetor de expressão. AB é financiado pelo programa Studentships Prioritárias BBSRC alvejado. Ambos CK e KP são suportados por RCUK Bolsas em Processamento de Biofármacos. CK também agradece a Lonza Biologics pelo apoio financeiro. O Centro de Biologia Sintética e Inovação é generosamente apoiado pelo EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
