Abstract
Myeloidceller är de mest rikligt förekommande immunceller inom tumörer och har visats för att främja tumörprogression. Moderna intravital avbildningstekniker möjliggör observation av levande cell beteende inne i orgeln, men kan vara en utmaning i vissa typer av cancer på grund av orgel och tumör tillgänglighet som tarmen. Direkt observation av intestinala tumörer har inte tidigare rapporterats. Ett kirurgiskt ingrepp som beskrivs här möjliggör direkt observation av myeloida celldynamik inom tarmtumörer hos levande möss med hjälp av transgena fluorescerande reporter möss och injicerbara spårämnen eller antikroppar. För detta ändamål har en fyra-färg, multi-region, mikro lensed snurrande skiva konfokalmikroskop som gör att långsiktigt kontinuerlig avbildning med snabb bildtagning använts. Apc Min / + möss som utvecklar multipla adenom i tunntarmen korsas med c-fms-EGFP möss för att visualisera myeloidceller och med ACTB-ECFP mössatt visualisera intestinala epitelceller i kryptorna. Rutiner för märkning olika tumörkomponenter, såsom blodkärl och neutrofiler, och förfarandet för positionering av tumören för avbildning genom serosala ytan beskrivs också. Time-lapse filmer som sammanställts från flera timmars avbildning tillåter analys av myeloid cellbeteende på plats i tarmmikromiljö.
Introduction
Överväldigande bevis visar nu att tumören mikromiljön, som består av heterogena cellpopulationer, inklusive fibroblaster, endotelceller, immunologiska och inflammatoriska celler, extracellulära matrix och lösliga faktorer, spelar en avgörande roll för initiering och progression av solida tumörer genom att bidra till nästan alla kännetecken cancer 1. Faktum är att under tumörprogression, det finns ständiga dynamiska interaktioner mellan transcancerceller och stromaceller som utvecklas för att skapa en mikromiljö som är gynnsam för malignitet 2. Bland de immunceller som infiltrerar tumören mikromiljö, myeloida celler är den mest förekommande 3. Bestående av tumörassocierade makrofager (TAM), myeloid-härledda suppressorceller (MDSCs), dendritiska celler (DC) och neutrofiler (PMN: er), är myeloida celler rekryteras från benmärg och successivt infiltrera tumörer, släppa cytokiner, tillväxtfaktorer och proteaser, vilka kan främjatumörtillväxt och spridning 4. Den överhörning mellan cancerceller och myeloida celler är komplex men dynamisk. Förståelsen av arten av deras interaktioner är alltså avgörande för att fastställa varför dessa celler främjar cancerutveckling i stället för att delta i en antitumörimmunsvar, och kan hjälpa till att hitta nya mål för att styra den.
Direkt observation genom intravital mikroskopi ger information om celldynamik inom vävnader i levande möss 5. En fyra färger, multi-region, mikro lensed spinning disk konfokala systemet utformades för att studera stromalceller inom brösttumörer 6. Detta tillvägagångssätt möjliggör långsiktig kontinuerlig avbildning och innehåller flera fördelar såsom (a) snabba bilder förvärv för att minimera rörelseartefakter, (b) långvarig anestesi, (c) fyra färger förvärvet att följa olika celltyper, (d) fluorescerande märkning olika tumör komponenter och (e) observation av olika tumörmikromiljöer within samma mus undvika mus till mus variabilitet 7-9. Med denna teknik har olika cellbeteenden har rapporterats i brösttumörvirus (MMTV) promotor driven polyoma mitten T onkogen (pymt) modell som visar progressiva stadier av tumörbildning. Regulatoriska T-lymfocyter (tregs, visualiserade genom Foxp3 EGFP transgenen) migrerar företrädesvis i närhet till blodkärlen DCS (CD11c-DTR-EGFP), karcinom-associerat fibroblaster (Fsp1 + / + -EGFP) och myeloida celler (c-fms -EGFP) uppvisar högre motilitet vid tumör periferin än i tumörmassan. I det tillstånd av akut systemisk hypoxi, migrerade cellerna på olika sätt: tregs sluta migrera till skillnad från myeloida celler som fortsätter att flytta 6. Dessutom i samma musmodell, har det visat sig att doxorubicin känslighet ändras med tumörstadium, är läkemedelsdistribution relaterad till läkemedelssvar och doxorubicinbehandling leder till CCR2 beroende rekrytering av myeloida celler till tumörer. Således kan Bildproduktion också användas för att få insikt i svaren drog in situ och biologi chemoresistance 10,11.
Adenomatös polypos coli (APC) genmutationer uppträder vanligen i humana kolorektala adenom och karcinom 12 och mutation av en enda kopia av APC-genen resulterar i familjär adenomatös polypos (FAP), som ger en extremt hög risk för koloncancer 13. Musen stammen Apc Min / + bär en trunke mutation vid kodon 850 av APC genen och spontant utvecklar flera intestinala adenom hela tunntarmen 14- 16. Långsiktig intravital avbildning av tarmen är utmanande på grund av invasivitet av förfarandet, sedan att öppna den peritoneala kaviteten är nödvändig för tillträde till tarmen. Kortfristiga Bildproduktion studies har tidigare publicerats på friska tarmen 17,18, men långsiktigt direkt observation av tarmtumörer har inte rapporterats. Ett kirurgiskt ingrepp har konstruerats och förfinats för att visualisera tumörer genom serosala ytan i tarmen med hjälp av intravital spinning disk mikroskopi systemet tidigare använts för att avbilda brösttumörer 6,10. I detta dokument är ett protokoll som beskrivs som gör att man kan följa beteendet hos myeloida celler i tumörer i tunntarmen med hjälp Apc Min / + möss.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök har utförts i enlighet med förfaranden som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC), UCSF. Alla bildexperiment var procedurer för icke-överlevnad och djuren avlivades omedelbart efter utgången av bilden förvärvet.
1 Generering av möss
OBS: Apc Min / + möss, som bär en mutation i APC-genen, spontant utvecklar 50-100 adenom i tunntarmen.
- Cross Apc Min / + möss med ACTB-ECFP linje, som uttrycker ECFP under aktinpromotorn, och vidare med c-fms-EGFP linje, som uttrycker EGFP under c-fms promotor för att upptäcka de myeloida cellerna. Heterozygota djur för ACTB-ECFP och c-fms-EGFP används för att detektera fluorescens.
- Använd möss vid 3-4 månaders ålder till bild klart påvisbara adenom.
2 Beredning av Material innan operationen
OBS: Detaljerna i mikroskop set-up har tidigare beskrivits 6,7.
- Mikroskop
- Slå på värmefilt. Slå på argonlaser för 488 nm excitation och solid-state 405 nm, 561 nm och 640 nm laser. Slå på mikroskopet, i spinnskivan styrenhet, AOTF, laser styrenheten och kameran styrenheten.
- Öppna mikroskop slutaren, som vänder LED röd. Slå på datorn och kamerans programvara.
- Imaging Plattform
- Säkerställ att det stadium insatsen är ren. Annars rent med tvål och vatten och sedan torka.
- Ta två täckglas och använd lab tejp för att fästa dem på insatsen. Placera insatsen på scenen och rengör den med desinfektionsservetter.
- Med hjälp av lab tejp, fäst värmefilt på höger sida av scenen.
- Verifiera integriteten hos gummimembran på noskonen och ändra det om necessary. Placera och fixera noskonen för isoflurananestesi leverans till djuret med hjälp av gasväv och lab tejp.
- Isoflurananestesi System
- Fyll på isofluran tanken.
- Slå på vakuum och justera till 1,2 L / min.
- Tillsätt destillerat vatten till nebulisatorn och anslut nebulisatorn till isofluran systemet.
- Slå på syreanalysator och anslut den till isofluran systemet. Slå på syretank och se till att syreanalysator visar 100%. Justera O 2 flödet till 0,2 l / min.
- Sätt på kvävebehållaren och justera flödet vid 0,8 l / min. Se till att syreanalysator visar 21%.
- Beredning av kirurgi och Plattform
- Clean 2 par dissektion pincett och sax med tvål och vatten.
- Slå på den heta pärla autoklav och låt den nå 250 ° C. Sterilisera kirurgi i 30 sekunder. Låt dem svalna.
- Placera ett labb soaker på operationen bänken.
- Använd en frigolit lock som en kirurgisk plattform. Täck med en bit lab soaker. Förbered en andra bit lab soaker att ändra efter rakning musen.
- Placera noskon med raden av anestesi på den täckta frigolit locket och fäst den i locket frigolit (inte på labbet soaker) med lite tejp och använder två nålar på båda sidor av noskonen för att hålla den på plats.
- Montera Betadine, spritkompresser, steril gasbinda, superlim, objektglas, elektrisk rakapparat, och 4 bitar av lab tejp.
3 Beredning av injektionsvätskor
- Under huven, utarbeta en insulinspruta (28 G x ½ tum) med 7 l av lager AF647-konjugerad Ly-6G (Gr1) antikroppar (1 mg / ml) till 100 ^ 2.000 kDa Rhodamine-dextran (4 mg / ml ) för retro-orbital injektion. Retro-orbital injektion rekommenderas i Apc Min / + möss eftersom anemi som utvecklas i dessa djur gör svans vener difficult att detektera via huden.
- Bered en andra insulinspruta med en mg / kg atropin späddes i 150 pl PBS för subkutan (SC) injektion innan bildbehandling för att dämpa peristaltiska rörelser i tarmen.
4 Beredning av tarmen för Imaging
- Verifiera att anestesi linje till induktionskammaren är öppen, och att ledningarna till det kirurgiska bordet och mikroskop är stängda.
- Överför djuret till anestesikammaren. Stäng anestesi kammaren och slå på isofluran till 4% (med 21% O2).
- När musen andas djupt och långsamt (efter 5-6 min), överför den till den kirurgiska scenen på sin flank och injicera Gr1 antikroppslösningen och / eller dextranlösning retroorbitalt.
- Öppna anestesi linje kopplad till kirurgiska plattformen. Stäng linjen till anestesikammaren och sätta musen på rygg med nosen i anestesi konen.
- Minska isoflurankoncentration från 4% till 2,5%.
- Kontrollera att musen är väl bedövas genom att nypa sin trampdynan och testa hornhinnans reflex.
- Lägg oftalmologiska smörj salva på ögonen för att förhindra torrhet under narkos.
- Säkra lemmar musen till kirurgiska scenen genom att lägga till lab tejp.
- Ta bort hår från den ventrala ytan med hjälp av en elektrisk rakapparat. Tag även bort håret från vänster bakben för att placera oximetern innan förvärvet. Ta labbet soaker från operations scenen och ersätta med en ren för att undvika kontaminering hår.
- Desinficera den ventrala ytan med spritkompresser och Betadine.
- Injicera atropin lösningen (från 3,2) fm i ena flanken av musen.
- Lägg till en 1 cm ventral mittlinje snitt genom huden och peritoneum genom användning av sax och en pincett. Dra försiktigt ut 3-4 cm av tarmen och identifiera en eller flera tumörer i bilden.
- Ta ett glas MICRoscope slide och position en slinga av tarmen på den med en tumör på toppen.
- Lägg till lite superlim på några ställen längs tarmen för att fästa den på bilden. Vänta en minut för limmet torka. Använd en markör för att rita en linje på bilden pekar på tumören för att underlätta dess lokalisering med konfokala.
5. Placering av musen på scenen och Förberedelse för Image Acquisition
- Ta lab tejpen från armar och ben.
- Öppna anestesi linje till mikroskopställningen och stänga en till det kirurgiska plattformen.
- Överför musen noga på mikroskop scenen med sin ventrala sidan nedåt och nosen i noskonen. Säkra anestesi linje med vissa lab tejp.
- Åter placera musen och / eller glid för att få tarmen i mitten av en av täck-halkade fönster. Tejpa försiktigt ner bilden med lab tejp.
- Fäst pulsoximeter-givare till vänster delen av musen för attfölja dess hjärta och andningsfrekvens och arteriell syremättnadsnivåer.
- Täck musen med värmefilt för att undvika hypotermi.
- Minska isofluran koncentrationen från 2,5% till 1-1,5% för avbildning.
6 Förvärv av bilder med hjälp μManager Software
- Öka CSUX hastigheten till 2500 rpm för att förbättra bildkvaliteten i konfigurationsinställningar.
- Använd Mål rullgardinsmenyn för att välja 10X 0,5 NA eller 20X 0,75 NA Fluar lins mål.
- Välj lasern 405 nm från Color rullgardinsmenyn.
- Klicka på Live och justera fokus med mikroskopet.
- Klicka på Auto för att automatiskt justera högsta och lägsta pixelintensiteter av visningsbilden baserat på de extrema pixelvärdena i bilden. Ett histogram av display bildens pixelintensiteter presenteras i grafen i den nedre delen av huvudfönstret.
- Justera kamerans exponering i fönstret Piper Kontrollpanelen genomatt ändra antalet klockor (En klocka är 33,333 ms).
- Om signalen är för ljus med den lägsta exponeringen minskar laserintensiteten med hjälp av mikroskop styrenheten.
- Kontrollera signalstyrkan för 488 nm, 561 nm och 640 nm laserlinjer. Justera laserintensiteten med lasern egen kontrollenhet (488 nm och 561 nm) eller mikroskopet styrenheten.
- I Multi D Acquisition fönster, kryssrutan tidpunkterna och skriv in antal tidpunkter och önskat tidsintervall.
- Kryssa i rutan Z-stackar, välj "relativ Z" och definiera Z-start och Z-end i förhållande till den aktuella positionen.
OBS: För 10X eller 20X objektiv, börja med 3 Z flygplan, 8 ^ m eller 4 ^ m avstånd från varandra. - Kontrollera flera positioner (XY) box för avbildning flera platser, sedan på Redigera positionen listan, markera 4-6 olika positioner.
- Kryssa i rutan Kanaler och lägga till kanaler från New och välj lasrar linjer från rullgardinsmenyn och type på exponering för varje kanal (i multiplar om 33,333 ms).
- Kolla Spara bilder i "Multi D förvärvet" fönstret.
- Välj en mapp och alla bilder som förvärvas automatiskt sparas i den här mappen med namnet prefixet givet.
OBS: Varje kontinuerlig Förvärvet kommer att sparas i en separat undermapp som enskilda TIFF-filer för varje Z skiva i varje färg vid varje tidpunkt. - Spara alla inställningar genom att klicka på Spara inställningar i Multi D Acquisition fönstret.
- Klicka Acquire i flerdimensionFörvärvs fönstret för att starta förvärvet.
- Om oximetern sonden inte används eller slutar fungera väl (när pulsen är inte stabil eller svårt att upptäcka), kontrollera hur effektiva anestesi var 15 min under avbildningsförfarandet genom att klämma trampdynan och kontrollera hornhinnans reflex. Justera anestesi om musen reagerar på dessa stimuli.
- Efter förvärvet euthanize musen genom att öka isofluran concentranson till 5%. När inga andningsrörelser är detekterbara, ta bort musen från scenen och gör en halsdislokation.
7 analys av bilder med hjälp Imaris Software
- Konvertering till .ims Files (kompletterande figur 1 A)
- Öppna kamerans programvara, klicka på Arkiv sedan Batch Converter.
- Klicka på Lägg till filer och välj den första filen i den första positionen. Upprepa för varje position.
- För varje fil laddas upp, klicka på Inställningar och kontrollera att inställningarna "t" för Time, "c" för kanaler och "z" för Z-stackar visas i den ordningen.
- Spara i önskad mapp. Bläddra och skapa en ny fil som konverteras.
- Klicka på Ange för alla och Start.
- Justeringar (kompletterande figur 1B)
- Gå in i den specifika Konverterad mappen och öppna den första filen.
- I Display Justering fönster, justera bakgrundssignalbryt genom att ändra Minsta antal för varje kanal om det behövs.
- Justera vid behov signalstyrkan genom att ändra Max numret (ju lägre Max antal i den högre intensiteten i signalen).
OBS: Justering av signalintensiteten / kontrast möjliggöra höjdpunkten av en cellbeteende eller ett fack för att få ett trevligare visualisering. Det ändrar inte resultatet i sig. - Klicka på Redigera och Bildegenskaper.
- Ändra x, y, och z-värden (för en 10X objektiv, x och y = 0,712, z = 8 | im, för en 20X objektiv: x och y = 0,36, z = 4 ^ m).
- Klicka på All Ekvidistanta att justera tidpunkter. Lägg startdatum och starttid för förvärvet. Lägg slutdatum och sluttid för förvärvet (kompletterande figur 1C).
- Klicka på Play-knappen för att titta på filmen.
- Klicka på Redigera och Ta bort tidpunkter för att ta bort suddiga bilder.
- För att gå med två separata förvärv together in i en film, gå till den sista tidpunkten för den första filmen och klicka på Redigera> Lägg till tidpunkter för att lägga den andra filen.
- Spara som en film (kompletterande figur 1D)
- Klicka på Record, välj MOV förlängning och en komprimeringsfaktor på 0.
- Klicka på Spara.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att använda spinning disk konfokalmikroskopi, icke-tumorala och tumorala vävnader i tunntarmen av Apc Min / +; ACTB-ECFP; c-fms-ECFP möss kan visualiseras från serosala ytan. Efter bildbehandling, kameran programvara som används för att analysera och justera förvärvet (kompletterande figur 1). Efter intravenös (iv) injektion av fluorescerande 2.000 kDa dextran-rodamin och Ly-6G 647 konjugerad antikropp, blodkärl och PMN kan upptäckas respektive (Figur 1). Peyers plack som är sammansättningar av lymfvävnad och full av myeloida celler kan ses lätt (Figur 1A). De kryptor i tunntarmen är omgiven av blodkärl och myeloida celler (fig 1a och 1b). Tumörvävnad är ofta mer vaskulariserad och mer infiltreras av myeloida celler, och strukturen i kryptorna är mindre well organiserade (figur 1A och 1B), beroende på storleken på tumören. Förvärv kan ske med hjälp av en 10X 0.5 NA (figur 1 A) och 20X 0,75 NA Fluar linser (Figur 1B) men vi fick det bästa resultatet med 10X 0,5 NA Fluar lins som var ljusa, tillåta förvärv av en stor region (676 x 676 nm) och kan ge bilder från upp till 70 pm i vävnaden. Den släta muskellagret som uttrycker aktin-ECFP kan ibland göra fokus på tarmepitelet svårt (Figur 1B, högra panelen). Myeloida celler dynamik i tumörer kan följas i realtid under några timmar som visas i den animerade / Video Figur 2. Följande skäl neutrofiler (Gr1 + celler) cirkulera i blodkärlen och patrullera vävnader, andra myeloida celler, främst makrofager, omger kryptor och är mindre rörliga (Animated / Video Figur 2).
Figur 1. Representativa bilder erhållits med snurrande skiva konfokala icke tumör och tumörvävnad från APC Min / + möss. (A) Fyra färgbilder (10X Fluar, 0,5 NA objektiv) i tunntarmen epitel från serosala yta Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus som fått iv fluorescerande 2.000 kDa dextran-Rhodamine (röd) och Ly-6G 647 konjugerad antikropp (vit). Den vänstra panelen visar den icke tumör epitel och den högra panelen visar en tumör från samma Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP mus. Myeloida celler är gröna och epitelceller är blå. Ett kluster av c-fms + celler ses i icke tumörtarmvävnad i en Peyers plaque (vit pil), skala bar = 100 nm. (B) med fyra färgbilder (20X Fluar, 0,5 NAlins) i tunntarmen epitel från serosala ytan av en Apc Min / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP tumör. I den vänstra panelen, finns flera dubbel positiva Gr1 + c-FMS + celler påvisas i tumörvävnaden. Den högra panelen visar en bild av den glatta muskulaturen lagret uttrycker aktin-ECFP som kan göra fokus på tarmepitelet svårt, skala bar = 50 pm.
Animerad / Video Figur 2 . myeloidcell dynamiken i en 3 mm adenom från en APC Min / + mus. Fyra färgtidsförlopp av tunntarmen epitel (10X Fluar, 0,5 NA objektiv) från serosala ytan av en Apc Min / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP co-injicerade mus med fluorescerande 2.000 kDa dextran-Rhodamine (röd) och en Ly-6G 647 konjugerad antikropp (vit). Myeloida celler är gröna ochepitelceller är blå. Myeloida celler runt kryptor rör sig inte. Vissa neutrofiler (Gr1 + celler i vitt) patrullerar i vävnaderna. Detta är en 2 tim förvärv och filmen har påskyndas 295 gånger.
Kompletterande Figur 1 . Skärmdumparna av kamerans mjukvara för förvärvsanalys. (A) För det första filerna måste konverteras till .ims förlängning. (B) Sedan kan visa bilder justeras, till exempel specifika signaler kan ökas och bakgrund minskade . (C) Datum och tid behöver justeras för att få en realtids film. (D) Förvärvet kan sparas som en film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta dokument är ett detaljerat protokoll som beskrivs för spinning disk konfokala avbildning av myeloida celldynamik i tarmtumörer i flera timmar i ett levande djur, avbildas från serosala sidan av tarmen.
För att undvika inflammation och för att ha optimala fysiologiska betingelser, har avbildning av tarmen som skall göras på det intakta organet. Dock är avbildning från serosala sidan av tarmen utmanande, eftersom ljuset måste gå genom olika vävnadsskikt såsom glatt muskulatur innan epitelet. Med fokus på epitelet kan vara svårt i vissa områden, särskilt i aktin-ECFP reporter möss eftersom aktin starkt uttryck av glatta muskelceller. Även två-foton mikroskopi har fördelen av djupare vävnadspenetration jämfört med konfokala mikroskop, fann vi att den snurrande skivan konfokalmikroskop är kraftfull nog för att få en bra visualisering av tarmens epitel strukturen. Fördelarna of spinning disk mikroskopi inkluderar kapaciteten för mycket snabb förvärv och unik känslighet utan att offra konfokala upplösning. Dessa egenskaper gör det möjligt att observation av dynamiska processer, även om vissa tidpunkter måste tas bort på grund av rörelseartefakter, minimerar fotoskador, och göra det möjligt för avbildning av relativt svagt fluorescerande molekyler.
Imaging tarmen från serosala sidan kan också vara utmanande på grund av de endogena peristaltiska rörelser detta organ. I detta protokoll är en sc injektion av atropin ges före avbildning, och den effektivt minskar rörelsen. Det är emellertid viktigt att notera att peristaltiska rörelse är mer omfattande i tjocktarmen, men är inte väl inhiberas av atropin behandling, framförande avbildning ganska svårt i denna del av tarmen. Den glattmuskelskikt i tjocktarmen är något mer framträdande c ompared till tunntarmen och verkar vara mer kontraktila. Därför detär nästan omöjligt att fokusera på epitelet i aktin-ECFP reporter möss. Dessutom, utöver dessa endogena rörelser, kan organ drifting förekomma, men i det här fallet bakre driftkorrigering kan utföras med hjälp av kamerans mjukvara.
En annan stor utmaning i invasiva avbildningsexperiment är att hålla musen levande och friska så länge som möjligt under narkos. Tarmen har nåtts genom att öppna den peritoneala kaviteten. Förfarandet är sålunda mer invasiv än den som används för brösttumöravbildning, vilket kan ske i upp till 40 h på grund av integriteten för peritoneum. Den maximala Förvärvet görs med bukhålan öppnades var 6 timmar, men musen fortfarande levde utan några tydliga tecken på ångest, så ännu längre förvärv kan vara genomförbart.
I denna studie myeloid cellens beteende kan följas och analyseras inom tarm tumören med hjälp av fluorescerande reporter möss och även fluorokromkonjugerade tåkare eller antikroppar. Detta tillvägagångssätt kan också användas för att observera andra celltyper, såsom tregs, dendritiska celler eller fibroblaster med hjälp av Foxp3-EGFP eller CD11c-DTR-EGFP eller Fsp1-EGFP reporter möss respektive, såsom det har använts i brösttumörstudie 6 . Dessutom kan fluorescerande antikroppar mot andra cellpopulationer än neutrofiler injiceras iv Dessutom kan cellbeteende också analyseras i olika förhållanden, såsom hypoxi. Sådana experiment kan ge nya insikter i beteendet hos dessa stromaceller efter behandling med kemoterapi eller målsökande behandling. Slutligen kan detta protokoll användas i andra musmodeller av tarmcancer och i olika stadier av tumörprogression. Apc Min / + möss utvecklar tarm adenomatös polyper enbart, som inte kommer fram med malignitet eftersom mössen har en förkortad livslängd. Det ska bli intressant att studera dynamiken i myeloida celler i andra tarmcancermodeller med mer aggressive och invasiva tumörer som möss som bär på mutationer i K-ras 19-21 eller Smad4 22 gener utöver Apc mutationen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi vill tacka Ying Yu för Apc Min / + möss genotypning. Denna studie stöddes av medel från INSERM och bidrag (CA057621 och AI053194) från National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1x PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1 mg/kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28 G x 1/2 in. insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24x50-1 |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30 min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| Stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| μManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R.
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
