골수 세포 역학의 실시간 영상 APC 최소 / + 소장 종양 디스크 공 초점 현미경을 회전시켜

요약

형질전환 리포터 마우스와 주사 가능한 형광 라벨을 사용함으로써, 장기 생체 내 회전 디스크 컨포칼 현미경 검사는 Apc^Min/+ 대장암 모델에서 장 선종에 대한 골수성 세포 거동을 직접 시각화할 수 있습니다.

초록

골수 세포는 종양 내에서 가장 풍부한 면역 세포이며 종양 진행을 촉진하는 것으로 나타났다. 현대의 intravital 이미징 기술은 기관 내부의 살아있는 세포 행동의 관찰을 가능하게되지만, 소장으로 인한 장기 및 종양 접근성 일부 암에서 문제가 될 수 있습니다. 장내 종양의 직접적인 관찰은 이전에보고되지 않았습니다. 여기에 설명 된 수술은 형질 전환 형광 기자 마우스와 주사 추적자 또는 항체를 사용하여 살아있는 생쥐의 장내 종양 내에서 골수 세포 역학의 직접 관찰 할 수 있습니다. 이를 위해, 신속한 화상 취득 장기 연속 촬상을 허용 4 색 멀티 영역, 마이크로 렌즈 효과 스피닝 디스크 공 촛점 현미경을 사용하고있다. 교차 소장의 여러 선종 개발 APC ^{최소 / +} 마우스 골수 세포를 시각화하는 C-FMS-EGFP 마우스와 ACTB-ECFP 마우스와 함께지하실의 장 상피 세포를 시각화합니다. 이러한 혈관 및 호중구 및 장막 표면을 통해 이미징 종양을 위치시키기위한 절차와 다른 종양 성분을 라벨링하는 절차도 설명된다. 영상의 몇 시간에서 컴파일 시간 경과 영화는 장 미세 환경에서 현장에서 골수 세포 행동의 분석을 할 수 있습니다.

서론

절대적인 증거 해주기 섬유 아세포, 내피 세포, 면역 및 염증 세포, 세포 외 기질, 및 가용성 인자를 포함한 이종 세포 집단 이루어진 종양 미세 환경은, 거의 모든 기여함으로써 개시 및 고형 종양의 진행에 중요한 역할을한다는 것을 보여 암 ^하나의 특징. 사실상, 종양 진행 중에, 악성 ^종양이 유리한 미세 환경을 생성하도록 형질 전환 된 진화 암세포 및 간질 세포 간의 일정한 동적 상호 작용이있다. 종양 미세 환경에 침투 면역 세포 중 골수 세포는 ^세 가장 풍부하다. (TAM) 종양 관련 대 식세포로 구성된 골수 유래 억제 세포 (MDSCs), 수지상 세포 (DC) 및 호중구 (백혈구), 골수 세포는 골수에서 모집하고 점진적으로 사이토 카인, 성장 인자 및 단백질 분해 효소 방출, 종양에 침투 홍보 할 수 있습니다종양의 성장 및 ^4를 확산. 암 세포와 골수 세포 사이의 크로스 토크는 복잡하지만 동적이다. 따라서, 상호 작용의 성질에 대한 이해는 이들 세포 대신 항 종양 면역 반응에 참여하는 암의 진행을 촉진 결정하는 중요한 이유이며, 그것을 제어하기위한 새로운 타겟을 찾는 데 도움이 될 수있다.

의 intravital 현미경으로 직접 관찰은 살아있는 쥐

프로토콜

주 : 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC), UCSF의 승인 절차에 따라 수행 하였다. 모든 촬상 실험 비 생존 절차이었고 동물은 화상 획득의 종료 후 즉시 안락사시켰다.

마우스의 1 세대

참고 : APC 유전자에 돌연변이를 들고 APC ^{최소 / +} 마우스는, 자발적으로 소장에서 50 ~ 100 선종을 개발한다.

1. 크로스 APC ^최소 골수 세포를 감지하는 C-FMS 프로모터에서 EGFP을 표현하는 C-FMS-EGFP 라인 ACTB-ECFP의 액틴 프로모터에서 ECFP을 표현 라인, 또한과 ^{/ +} 마우스. ACTB-ECFP 및 C-FMS-EGFP 이형 동물 형광을 감지하는 데 사용됩니다.
2. 이미지를 명확하게 검출 선종에 연령 3 ~ 4 개월에 마우스를 사용합니다.

M의 2 준비수술 전에 aterials

참고 : 현미경 셋업의 세부 이전 된 ^6,7 설명했다.

1. ....

결과

ACTB-ECFP; APC ^{최소 / +의} 소장에서 회전 디스크 초점 현미경, 비 종양 및 종양 조직을 이용하여 C-FMS-ECFP 마우스는 장막 표면에서 시각화 될 수있다. 촬영 후, 카메라 소프트웨어 분석 및 수집 (보충 그림 1)을 조정하는 데 사용됩니다. 형광 2,000 kDa의 덱스 트란 - 로다의 정맥 주입 및 LY-6G 항체 컨쥬 게이트 647, 후 혈관과 백혈구가 각각 (도 1)을 검출 할 수있다. 림프 조직의 집계하고 골수 세포의 전체를 쉽게 볼 수 있습니다 Peyer의 패치 (그림 1A). 소장의 지하실은 혈관 및 골수 세포 (도 1A 및 1B)에 의해 둘러싸여있다. 종양 조직 혈관 종종 더 많은 골수 세포 침투 및 소낭의 구조 w 이하엘 종양의 크기에 따라 <.......

토론

본 논문에서는 상세한 프로토콜은 창자의 장막 측에서 몇 군데 살아있는 동물에서 몇 시간 동안 장내 종양에서 골수 세포 역학의 디스크 공 촛점 이미징 회전에 설명되어 있습니다.

염증을 방지하기 위해 최적의 생리 학적 조건을 가지고, 소장의 이미지는 그대로 기관에서 수행해야합니다. 광이 도달하기 전에 상피 평활근 같은 상이한 조직 층을 통과해야하기 때문에, 소장의 장막 측으로부터 촬상는 도전적이다. 말라가 매우 평활근 세포에 의해 표현되기 때문에 상피 세포에 초점을 맞춘 것은 특히 액틴 ECFP 기자 쥐, 일부 지역에서는 어려울 수 있습니다. 두 개의 광자 공 초점 현미경은 현미경에 비해 깊은 조직 관통하는 이점을 갖고 있지만, 우리는 회전 디스크 공 초점 현미경은 장내 상피 구조의 좋은 시각화를 획득하기에 충분히 강력하다 것을 알았다. 장점 오F 회전 디스크 현미경 공 초점 해상도 저하없이 매우 빠른 수집 및 고유 감도 능력을 포함한다. 이러한 특성은 몇몇 시점 인해 움직임 아.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
ApcMin/+ 마우스	Jackson Laboratory	2020
ACTB-ECFP 마우스	Jackson Laboratory	3773
cfms-EGFP 마우스	Jackson Laboratory	18549
2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated	Invitrogen	D7139
Isoflurane	Butler Animal Health Supply	29450
질소	UCSF
산소	UCSF
1x PBS	UCSF 세포 배양 시설
식염수 완충액	UCSF 세포 배양 시설
안티 마우스 Ly-6G (GR1) 항체 AF647	UCSF 단클론 항체 코어		재고 1 mg/ml. 7 &mu에서 사용; g/마우스
아트로핀	LARC UCSF		1mg/kg 마우스
알코올 물티슈	Becton Dickinson	326895
28G x 1/2인치 인슐린 주사기	Becton Dickinson	329465
레뮴 커버 유리	Fisher Scientific	12-548-5M	24x50-1
Betadine	LARC UCSF
열 담요	Gaymar에서 사용 산업
핫 비드 살균기	Fine Science Tools	18000-45	사용 30 분 전 켜기
코튼 팁 애플리케이터 6 인치	전자 현미경 과학	72310-10
마취 시스템	Summit 마취 지원
도립 현미경	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
스테이지 인서트	적용된 Sientific Instrumentation
Mouse Ox 산소 농도계, 소프트웨어 및 센서	Starr Life Sciences	MouseOx
Nebulizer	Summit 마취 지원
Imaris	Bitplane
μ 관리자	Vale lab, UCSF		오픈 소스 소프트웨어
ICCD 카메라	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
Spinning disk confocal sacan-head	Yokogawa	Corporation CSU-10b