Abstract
Myeloïde cellen zijn de meest voorkomende immune cellen in tumoren en is aangetoond tumorprogressie promoten. Moderne intravitale beeldvormende technieken maken de observatie van live-cellulaire gedrag in het orgel, maar kan een uitdaging in sommige vormen van kanker als gevolg van organen en tumor toegankelijkheid zoals darm. Directe waarneming van darmtumoren is niet eerder gerapporteerd. Een hier beschreven chirurgische ingreep maakt directe observatie van myeloïde cel dynamiek binnen de darmtumoren in levende muizen met behulp van transgene fluorescerende reporter muizen en injecteerbare tracers of antilichamen. Voor dit doel, heeft een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale microscoop die op lange termijn continue beeldvorming met snelle beeldopname maakt gebruikt. Apc Min / + muizen die meerdere adenomen in de dunne darm te ontwikkelen zijn gekruist met c-fms-EGFP muizen myeloïde cellen te visualiseren en ACTB-ECFP muizenintestinale epitheelcellen van de crypten visualiseren. Procedures voor de etikettering verschillende tumor componenten, zoals bloedvaten en neutrofielen, en de procedure voor het positioneren van de tumor beeldvorming via serosale oppervlak beschreven. Time-lapse films samengesteld uit verscheidene uren beeldvorming kan de analyse van myeloïde celgedrag in situ in de intestinale micro.
Introduction
Overweldigend bewijs blijkt nu dat de tumor micro-omgeving, bestaande uit heterogene celpopulaties, waaronder fibroblasten, endotheelcellen, immune en inflammatoire cellen, extracellulaire matrix en oplosbare factoren, speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en progressie van vaste tumoren door tot bijna alle kenmerken van kanker 1. Inderdaad, bij tumorprogressie, er voortdurend dynamische interacties tussen getransformeerde kankercellen en stromale cellen die zich ontwikkelen tot een micro gunstig maligniteit 2 genereren. Onder de immune cellen die de tumor micro infiltreren, myeloïde cellen zijn de meest voorkomende 3. Bestaande uit tumor-geassocieerde macrofagen (TAM), myeloide suppressor cellen (MDSCs), dendritische cellen (DC) en neutrofielen (PMN), myeloïde cellen worden gerekruteerd uit beenmerg en geleidelijk infiltreren tumoren vrijgeven cytokines, groeifactoren en proteasen die kan bevorderentumorgroei en verspreiding 4. De overspraak tussen kankercellen en myeloïde cellen is complex en dynamisch. Dus het begrip van de aard van hun interacties cruciaal voor het bepalen waarom deze cellen te promoten kankerprogressie plaats van deelnemen aan een anti-tumor immuunreactie, en kunnen helpen om nieuwe targets te beheersen vinden.
Directe observatie door opklaren geeft informatie over mobiele dynamiek binnen de weefsels van levende muizen 5. Een vier-kleur, multi-regio, micro lensed spinning disk confocale systeem werd ontworpen om stromale cellen te bestuderen binnen borsttumoren 6. Deze benadering maakt langdurige continue beeldvorming en bevat diverse voordelen zoals (a) snelle beelden overname bewegingsartefacten minimaliseren, (b) langdurige anaesthesie, (c) vier kleuren overname verschillende celtypen volgen, (d) fluorescentielabelling verschillende tumorale componenten, en (e) observatie van verschillende tumor micro-omgevingen within dezelfde muis muis om de muis variabiliteit 7-9 voorkomen. Met deze technologie zijn andere cel gedrag vastgesteld in de mammaire tumor virus (MMTV)-promotor aangedreven polyoma midden T oncogen (PyMT) model dat geleidelijk van tumorigenese weergeeft. Regulatoire T-lymfocyten (Tregs, gevisualiseerd door de Foxp3 EGFP transgen) migreren bij voorkeur in de nabijheid van de bloedvaten terwijl DCS (CD11c-DTR-EGFP),-carcinoom geassocieerd fibroblasten (FSP1 + / + -EGFP) en myeloïde cellen (c-fms -EGFP) vertonen een hogere beweeglijkheid op de tumor periferie dan binnen de tumor. In de toestand van acute systemische hypoxie, cellen gemigreerd anders: Tregs stop migreren in tegenstelling tot myeloïde cellen die blijven bewegen 6. Bovendien, in hetzelfde muismodel, is aangetoond dat doxorubicine gevoeligheid verandert met tumor stadium is geneesmiddelverdeling verband met drugs respons en doxorubicinebehandeling verkrijgt men CCR2-afhankelijke rekrutering van myeloïde cellen tumoren. Aldus kunnen levende beeldvorming worden gebruikt om inzicht in drug reacties in situ en de biologie van chemoresistance 10,11 verkrijgen.
Adenomateuze polyposis coli (APC) genmutaties vaak voorkomen in humane colorectale adenomen en carcinomen 12 en mutatie van een enkele kopie van het Apc-gen resultaten in familiaire adenomateuze polyposis (FAP), die een uitzonderlijk hoog risico op colonkanker 13 verleent. De muis stam Apc Min / + draagt een truncatie mutatie op codon 850 van het APC-gen en spontaan ontwikkelt meerdere darmadenomen over de dunne darm 14-16. Langdurige intravitale beeldvorming van de darm is uitdagend door de invasiviteit van de procedure, aangezien het openen van de buikholte noodzakelijk om toegang tot de darm. Korte termijn live-imaging studies zijn eerder gepubliceerd op gezonde darm 17,18, maar langdurige directe waarneming van darmtumoren is niet gemeld. Een chirurgische ingreep is ontwikkeld en verfijnd om tumoren te visualiseren door het serosale oppervlak van de darm via de intravitale draaiende schijf microscopiesysteem voorheen het beeld borsttumoren 6,10. In dit document wordt een protocol beschreven waarmee men het gedrag van myeloïde cellen in de tumoren in de dunne darm te volgen met Apc Min / + muizen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de procedures die door de Institutional Animal Care en gebruik Comite (IACUC), UCSF goedgekeurd. Alle imaging experimenten waren niet-overleving procedures en de dieren werden gedood onmiddellijk na afloop van beeldopname.
1 Generatie van Muizen
OPMERKING: Apc Min / + muizen, die een mutatie op de Apc-gen, ontwikkelen spontaan 50-100 adenomen in de dunne darm.
- Cross Apc Min / + muizen met de ACTB-ECFP lijn, die ECFP expressie onder de actine promoter, en verder met de c-fms-EGFP lijn, die EGFP expressie onder de c-fms, teneinde het myeloïde cellen te detecteren. Heterozygote dieren ACTB-ECFP en c-fms-EGFP worden gebruikt om fluorescentie te detecteren.
- Gebruik muizen op 3-4 maanden oud op de foto duidelijk opspoorbaar adenomen.
2 Voorbereiding van de Materialen Voor de operatie
LET OP: De gegevens van de microscoop set-up hebben eerder beschreven 6,7.
- Microscoop
- Zet de verwarming deken. Zet de argon laser voor 488 nm excitatie en het vaste stof 405 nm, 561 nm en 640 nm lasers. Zet de microscoop, de draaiende schijf besturingseenheid, de AOTF, de laser besturing en de camera-controller.
- Open de microscoop sluiter, die de LED rood wordt. Zet de computer en de camera software.
- Imaging Platform
- Zorg ervoor dat het podium insert is schoon. Anders schoon met water en zeep en vervolgens droog.
- Neem twee dekglaasjes en gebruiken lab tape om ze vast op de insert. Plaats het element op het podium en maak hem schoon met alcohol doekjes.
- Met behulp van lab tape, hechten de verwarming deken aan de rechterkant van het podium.
- Controleer de integriteit van het rubber membraan op de neus en vervang indien necessary. Positie en bevestig de neuskegel voor isofluraananesthesie levering aan het dier met behulp van gaas en lab tape.
- Isofluraananesthesie System
- Vul de isofluraan tank.
- Schakel de stofzuiger en aan te passen tot 1,2 L / min.
- Voeg gedestilleerd water aan de vernevelaar en sluit de vernevelaar aan de isofluraan systeem.
- Schakel de zuurstof analyzer en sluit deze aan op de isofluraan systeem. Zet de zuurstoftank en ervoor zorgen dat de zuurstof analyser toont 100%. Pas de O 2 stroom tot 0,2 L / min.
- Zet de stikstof tank en stel de stroom bij 0,8 l / min. Zorg ervoor dat de zuurstof analyser toont 21%.
- Voorbereiding van de operatie-instrumenten en het Platform
- Clean 2 paar dissectie pincet en een schaar met water en zeep.
- Zet de hete kraal sterilisator en laat bereikt 250 ° C. Steriliseer de chirurgie gedurende 30 sec. Laat ze afkoelen.
- Plaats een lab soaker op de operatie bank.
- Gebruik een piepschuim deksel als een chirurgische platform. Dek af met een stuk van lab soaker. Bereid een tweede stuk van lab soaker te veranderen na het scheren van de muis.
- Plaats de neuskegel met de lijn van de anesthesie op het overdekte piepschuim deksel, en bevestig deze aan de piepschuim deksel (niet op het lab soaker) met wat tape en gebruik twee naalden aan beide zijden van de neus tot het op zijn plaats te houden.
- Assembleren betadine, alcohol doekjes, steriel gaas, superlijm, objectglaasjes, elektrisch scheerapparaat, en 4 stuks van lab tape.
3 Bereiding van injecties
- Onder de motorkap bereidt een insulinespuit (28 G x ½ cm) met 7 pl stock AF647-geconjugeerd Ly-6G (GR1) antilichaam (1 mg / ml) in 100 pl van 2.000 kDa rhodamine-dextran (4 mg / ml ) voor de retro-orbitale injectie. Retro-orbitale injectie wordt aanbevolen in Apc Min / + muizen sinds bloedarmoede die zich ontwikkelt in deze dieren maakt de staart aderen difficuHet detecteren door de huid.
- Bereid een tweede insuline spuit met 1 mg / kg atropine verdund in 150 ul PBS subcutaan (sc) injectie voor beeldvorming ter peristaltische bewegingen van de darm dempen.
4 Voorbereiding van de darm voor Imaging
- Controleer of de verdoving lijn naar de inductie kamer is geopend, en de lijnen naar de operatietafel en microscoop gesloten.
- Breng het dier naar de anesthesie kamer. Sluit de anesthesie kamer en zet de isofluraan tot 4% (met 21% O 2).
- Wanneer de muis ademt diep en langzaam (na 5-6 min), over te dragen aan de chirurgische fase op zijn flank en injecteer de Gr1 antilichaam oplossing en / of dextran oplossing retro-orbitaal.
- Open de anesthesie regel gekoppeld aan de chirurgische platform. Sluit de lijn naar de anesthesie kamer en zet de muis op de rug met de neus in de anesthesie kegel.
- Verminder de isofluraanconcentratie van 4% tot 2,5%.
- Controleer of de muis goed is verdoofd door knijpen haar voetzool en het testen van de cornea reflex.
- Voeg oogheelkundige smeren zalf op de ogen tot droog te voorkomen terwijl ze onder narcose.
- Bevestig de ledematen van de muis om de chirurgische fase door het toevoegen lab tape.
- Verwijder het haar van het ventrale oppervlak met behulp van een elektrisch scheerapparaat. Verwijder ook het haar van de linker achterpoot van de oximeter voor overname te positioneren. Verwijder het lab soaker van de chirurgische podium en te vervangen door een schone om haar te voorkomen.
- Ontsmet het ventrale oppervlak met alcohol doekjes en betadine.
- Injecteer de atropine-oplossing (vanaf 3.2) v in een flank van de muis.
- Wordt 1 cm ventrale middellijn incisie door de huid en het buikvlies met schaar en een pincet. Trek voorzichtig 3-4 cm van de darm en identificeren van een of meerdere tumoren op de foto.
- Neem een glas microscope glijbaan en positie een lus van de darm op het met een tumor op de top.
- Voeg wat superlijm om enkele plaatsen langs de darm om het te hechten aan de dia. Wacht een min voor de lijm drogen. Gebruik een marker van een lijn op de dia wijst naar de tumor om de lokalisatie van de confocale vergemakkelijken.
5 Plaatsing van de muis in het werkgebied en Voorbereiding voor Image Acquisition
- Verwijder lab tape van de ledematen.
- Open de anesthesie regel de microscoop podium en die dicht bij de chirurgische platform.
- Breng de muis voorzichtig naar de microscoop podium met zijn buikzijde naar beneden en haar neus in de neuskegel. Bevestig de anesthesie lijn met wat lab tape.
- Opnieuw positioneren van de muis en / of de schuif om de darm in het centrum van een van het deksel gleed ramen. Zachtjes tape van de glijbaan af met lab tape.
- Bevestig de oximetersonde links onderdeel van de muisvolgt haar hart en de ademhaling en de arteriële zuurstofverzadiging niveaus.
- Bedek de muis met de verwarming deken om onderkoeling te voorkomen.
- Verlaag de isofluraan concentratie van 2,5% naar 1-1,5% voor de beeldvorming.
6 Overname van afbeeldingen met behulp van μManager Software
- Verhoog CSUX snelheid tot 2.500 toeren om de beeldkwaliteit in de configuratie-instellingen te verbeteren.
- Gebruik het menu Doelstelling dropdown 10x 0,5 NA of 20X 0,75 NA Fluar lens objectief kiezen.
- Kies de laser 405 nm van Color dropdown menu.
- Klik op live en pas de scherpstelling aan met de microscoop.
- Klik op Automatisch om de maximale en minimale pixel intensiteiten van de beeldweergave op basis van de extreme pixelwaarden in het beeld automatisch aan te passen. Een histogram van het beeld scherm van pixel intensiteiten wordt weergegeven in de grafiek in het onderste gedeelte van het hoofdvenster.
- Pas de belichting camera in het venster Piper Configuratiescherm doorhet veranderen van het aantal klokken (Een klok is 33.333 msec).
- Als het signaal te licht met de laagste blootstelling verminderen laserintensiteit de microscoop besturingseenheid.
- Controleer de intensiteit van het signaal voor 488 nm, 561 nm en 640 nm laser lijnen. Pas laserintensiteit met eigen controle-eenheid van de laser (488 nm en 561 nm) of de microscoop regeleenheid.
- In het venster Multi D Acquisitie, vink het vakje Time punten en typ in het aantal tijdstippen en het gewenste tijdsinterval.
- Vink het vakje aan Z-stacks, kies "relatieve Z" en definieer Z-start en Z-end ten opzichte van de huidige positie.
OPMERKING: Voor 10X of 20X objectief, beginnen met 3 Z vliegtuigen, 8 micrometer of 4 micrometer respectievelijk uit elkaar. - Vink het vakje Meerdere posities (XY) voor beeldvorming van meerdere locaties, klik op Bewerken lijst positie, markeer 4 tot 6 verschillende posities.
- Vink het vakje aan kanalen en zenders uit Nieuw toevoegen en selecteer lasers lijnen uit het dropdown-menu en type in belichting voor elk kanaal (in veelvouden van 33.333 msec).
- Controleer beelden opslaan in het venster "Multi D overname".
- Selecteer een map en alle verkregen beelden worden automatisch opgeslagen in de map met de naam voorvoegsel gegeven.
Opmerking: Elke continue verwerving wordt over een aparte submap als afzonderlijke tiff files voor elke Z segment in elke kleur op elk tijdstip worden opgeslagen. - Spaar alle instellingen door te klikken op Instellingen opslaan in het venster Multi D Acquisition.
- Klik verwerven in de Multi-dimensionale Acquisitie venster om acquisitie te beginnen.
- Als de oximetersonde niet wordt gebruikt of niet meer goed werkt (als puls is niet stabiel of moeilijk op te sporen), controleer dan eerst of de anesthesie om de 15 minuten tijdens de beeldvorming procedure door te knijpen de voetzool en het controleren van de cornea reflex. Stel de anesthesie of de muis reageert op deze stimuli.
- Na de overname, euthanaseren de muis door het verhogen van de isofluraan concentrantsoen tot 5%. Als er geen ademhalingsbewegingen zijn detecteerbaar, verwijdert u de muis van het podium en het uitvoeren van een cervicale dislocatie.
7 Analyse van de beelden met behulp van Imaris Software
- Conversie naar bestanden (aanvullende figuur 1A) ims
- Open de camera software, klik dan op Bestand vervolgens Batch Converter.
- Klik op Bestanden toevoegen en selecteer het eerste bestand van de eerste positie. Herhaal dit voor elke positie.
- Voor elk bestand geupload, klik op Instellingen en controleer of de instellingen "t" voor Time, "c" voor kanalen en "z" voor Z-stapels lijken in die volgorde.
- Behalve in de gewenste map. Blader en maak een nieuw bestand geconverteerd.
- Klik op Set voor iedereen en Start.
- Aanpassingen (aanvullende figuur 1B)
- Ga naar de specifieke Converted map en open het eerste bestand.
- In venster Weergave aanpassen, stel de achtergrondcutoff signaal door aanpassing van de Min nummer voor elk kanaal indien nodig.
- Indien nodig past u de intensiteit van het signaal door het wijzigen van het Max nummer (hoe lager het Max getal, hoe hoger de intensiteit van het signaal).
OPMERKING: Aanpassingen van de signaalintensiteit / contrast staat het hoogtepunt van een cel gedrag of een compartiment om een mooier visualisatie. Het maakt niet het resultaat zelf te veranderen. - Klik op Eigenschappen bewerken en Beeld.
- Verander de x, y en z waarden (een 10X objectief, x en y = 0,712, z = 8 urn, een 20X objectief: x en y = 0,36, z = 4 micrometer).
- Klik op Alle gelijke afstand tot tijd punten aan te passen. Voeg de startdatum en starttijd van de overname. Voeg de einddatum en eindtijd van de acquisitie (aanvullende figuur 1C).
- Klik op de knop Afspelen om de film te bekijken.
- Klik op Bewerken en Verwijderen tijdstippen om wazige beelden te wissen.
- Om twee afzonderlijke overnames together in een film, ga naar het laatste tijdstip van de eerste film en klik op Bewerken> Toevoegen tijdstippen naar het tweede bestand toe te voegen.
- Het opslaan als een film (aanvullende figuur 1D)
- Klik op Record, kies de mov extensie en een compressiefactor van 0.
- Klik op Opslaan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Via draaiende schijf confocale microscopie, niet-tumorale en tumorweefsels in de dunne darm van Apc Min / +; ACTB-ECFP c-fms-ECFP muizen kunnen worden gevisualiseerd van het serosale oppervlak. Na de belichting, wordt de camera-software gebruikt voor het analyseren en aanpassen van de acquisitie (aanvullende figuur 1). Na intraveneuze (iv) injectie van fluorescent 2000 kDa dextran-rhodamine en Ly-6G 647 geconjugeerd antilichaam, bloedvaten en PMN respectievelijk kan worden gedetecteerd (Figuur 1). Peyer's vlekken die combinaties van lymfoïde weefsel en vol myeloïde cellen kan gemakkelijk worden gezien (Figuur 1A). De crypten van de dunne darm zijn omgeven door bloedvaten en myeloïde cellen (Figuur 1A en 1B). Tumorweefsel is vaak gevasculariseerd en geïnfiltreerd door myeloïde cellen en de structuur van de crypten minder well georganiseerd (figuur 1A en 1B) afhankelijk van de grootte van de tumor. Overname kan worden gedaan met behulp van een 10X 0,5 NA (Figuur 1A) en 20X 0,75 NA Fluar lenzen (Figuur 1B), maar we verkregen de beste prestaties met de 10X 0,5 NA Fluar lens die helder was, zodat de verwerving van een groot gebied (676 x 676 urn) en mogelijk beelden te leveren van maximaal 70 urn in het weefsel. De gladde spierlaag uiten actine-ECFP kan soms maken de focus op het darmepitheel moeilijk (Figuur 1B, rechter paneel). Myeloïde cellen dynamiek in tumoren kan worden gevolgd in real time voor een paar uur, zoals in de Animated / Video Figuur 2. Overwegende neutrofielen (Gr1 + cellen) circuleren in de bloedvaten en patrouilleren in de weefsels, andere myeloïde cellen, vooral macrofagen, omringen de crypten en zijn minder beweeglijk (Animated / Video Figuur 2).
Figuur 1 vertegenwoordiger foto's verkregen met de draaiende schijf confocale van niet-tumorale en tumorweefsel van Apc Min / + muizen. (A) Vier kleurenafbeeldingen (Fluar 10X, NA 0,5 lens) van de dunne darm epitheel van het serosale oppervlak van Apc Min / +; ACTB-ECFP, CFMS-EGFP muis die iv fluorescent 2000 kDa dextran-rhodamine ontvangen (red) en een Ly-6G 647 geconjugeerd antilichaam (wit). Het linker paneel toont de niet-tumorale epitheel en het rechter paneel toont een tumor van dezelfde Apc Min / +; ACTB-ECFP; CFMS-EGFP muis. Myeloïde cellen zijn groen en epitheelcellen zijn blauw. Een cluster van c-fms + cellen waargenomen in de niet-tumorale darmweefsel in een Peyer's patch (witte pijl), schaal bar = 100 urn. (B) Vier kleurenafbeeldingen (Fluar 20X, NA 0,5lens) van de dunne darm epitheel van het serosale oppervlak van een Apc Min / +; ACTB-ECFP, CFMS-EGFP tumor. In het linkerpaneel worden verschillende dubbel-positieve Gr1 + c-fms + cellen gedetecteerd in het tumorweefsel. Het rechter paneel toont een beeld van de gladde spierlaag uiten actine-ECFP dat de focus op het darmepitheel moeilijk, schaal bar = 50 micrometer kunnen maken.
Animated / Video Figuur 2 . myeloïde cel dynamiek in een 3 mm adenoom van een Apc Min / + muis. Vier kleuren time-lapse van de dunne darm epitheel (10X Fluar, 0,5 NA lens) uit de sereuze oppervlak van een Apc Min / + , ACTB-ECFP, CFMS-EGFP mouse co-geïnjecteerd met fluorescerende 2000 kDa dextran-rhodamine (rood) en Ly-6G 647 geconjugeerd antilichaam (wit). Myeloïde cellen zijn groen enepitheelcellen zijn blauw. Myeloïde cellen rond de crypten niet bewegen. Sommige neutrofielen (Gr1 + cellen in het wit) patrouilleren in de weefsels. Dit is een 2 uur acquisitie en de film is versneld 295 keer.
Aanvullende Figuur 1 . Screen shots van de camera software voor overname analyse. (A) Eerst moeten de bestanden worden omgezet in ims extensie. (B) Dan kunnen geven beelden worden aangepast, zoals specifieke signalen kunnen worden verhoogd en de achtergrond gedaald . (C) Datum en tijd moeten worden aangepast om een real-time film te krijgen. (D) De overname kan worden opgeslagen als een film.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze paper wordt een gedetailleerd protocol beschreven voor spinning disk confocale beeldvorming van myeloïde cel dynamiek in darmtumoren gedurende enkele uren in een levend dier, belicht vanuit de serosal kant van de darm.
Om ontsteking te voorkomen en optimale fysiologische voorwaarden, beeldvorming van de darm moet worden gedaan op de intacte orgaan. Echter, weergave van de serosale zijde van de darm is een uitdaging, omdat het licht moet door verschillende weefsellagen zoals gladde spier alvorens de epitheel. Focussen op het epitheel kan moeilijk zijn in sommige gebieden, met name in de actine-ECFP reporter muizen sinds actine hoog tot expressie door gladde spiercellen. Hoewel twee-foton microscopie heeft het voordeel van diepere penetratie in vergelijking met confocale microscopen, we vonden dat de draaiende schijf confocale microscoop krachtig genoeg om een goede visualisatie van de intestinale epitheliale structuur verkrijgen. De o voordelenf draaiende schijf microscopie onder meer de capaciteit voor zeer snelle acquisitie en unieke gevoeligheid zonder concessies confocale resolutie. Deze kwaliteiten kan de observatie van dynamische processen, zelfs als sommige tijdstippen moeten worden verwijderd als gevolg van beweging artefacten, minimaliseren photodamage, en kan de beeldvorming van relatief zwak fluorescerende moleculen.
Imaging darm van de serosale zijde kan ook moeilijk zijn vanwege de endogene peristaltische bewegingen van dit orgaan. In dit protocol wordt een sc injectie met atropine gegeven vóór beeldvorming en deze efficiënt vermindert de beweging. Het is echter belangrijk op te merken dat peristaltische beweging uitgebreider in de dikke darm, maar niet goed geremd door atropine behandeling, waardoor beeldvorming moeilijk in dit deel van de darm. De gladde spierlaag in de colon is wat prominent c ompared de dunne darm en lijkt meer contractiele zijn. Daaromis bijna onmogelijk om zich te concentreren op het epitheel in de actine-ECFP reporter muizen. Bovendien, naast deze endogene bewegingen kan drijven orgaan optreden, maar in dit geval posterieure drift correctie kan worden uitgevoerd door de software te gebruiken.
Een grote uitdaging invasieve beeldvorming experimenten is om de muis levend en gezond lang mogelijk onder verdoving houden. De darm is toegankelijk door de peritoneale holte. Aldus is de procedure invasief zijn dan voor borstkanker beeldvorming, die kan tot 40 uur omdat de integriteit van het peritoneum. De maximale overname gedaan met de buikholte geopend was 6 uur, maar de muis was nog in leven, zonder duidelijke tekenen van nood, dus nog langer acquisitie kan haalbaar zijn.
In deze studie myeloïde kan celgedrag te volgen binnen de intestinale tumor met fluorescente reporter muizen en ook fluorochroom-geconjugeerde t geanalyseerdracers of antilichamen. Deze benadering kan ook worden gebruikt voor observatie andere celtypes zoals Tregs, dendritische cellen of fibroblasten met Foxp3-EGFP of CD11c-DTR-EGFP of FSP1-EGFP reporter muizen respectievelijk, zoals het is gebruikt in de borstkanker onderzoek 6 . Ook kunnen fluorescente antilichamen tegen andere celpopulaties dan neutrofielen worden geïnjecteerd iv Daarnaast kunnen celgedrag worden geanalyseerd in verschillende omstandigheden, zoals hypoxie. Dergelijke experimenten kunnen nieuwe inzichten geven in het gedrag van die stroma cellen na behandeling met chemotherapie of doelgerichte therapie. Tenslotte kan dit protocol worden gebruikt in andere muismodellen darmkanker en in verschillende stadia van tumorprogressie. Apc Min / + muizen ontwikkelen alleen intestinale adenomateuze poliepen, die niet ontwikkelen tot maligniteit omdat de muizen een verkorte levensduur. Het zal interessant zijn om de dynamiek van myeloïde cellen in andere darmkanker modellen studeren met meer aggressive en invasieve tumoren zoals muizen die mutaties in K-ras 19-21 of Smad4 22 genen in aanvulling op de Apc mutatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
We willen graag Ying Yu bedanken voor Apc Min / + muizen genotypering. Deze studie werd ondersteund door fondsen van INSERM en subsidies (CA057621 en AI053194) van de National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1x PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1 mg/kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28 G x 1/2 in. insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24x50-1 |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30 min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| Stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| μManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R.
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
