Abstract
תאי מיאלואידית הם התאים חיסוניים הנפוצים ביותר בגידולים והוכחו לקדם התקדמות גידול. טכניקות הדמיה intravital מודרניות מאפשרות התצפית של התנהגות תאית חי בתוך האיבר אבל יכולות להיות מאתגר בסוגים מסוימים של הסרטן בשל נגישות איבר וגידול כגון מעי. תצפית ישירה של גידולים במעי לא דווחה בעבר. הליך כירורגי המתואר כאן מאפשר תצפית ישירה של דינמיקת תא מיאלואידית בתוך הגידולים במעיים בעכברים חיים באמצעות עכברי כתב ניאון מהונדסים וקליעים נותבים או נוגדנים להזרקה. לצורך כך, נעשה שימוש בארבעה צבעים, רב אזור, מיקרוסקופ confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו, המאפשר הדמיה רציפה ארוך טווח עם רכישת תמונה מהירה. Apc מינימאלי עכברים / + המתפתחים אדנומות מרובות במעי הדק הם חצו עם עכברי c-FMS-EGFP לדמיין תאי מיאלואידית ועם עכברי ACTB-ECFPלדמיין תאי אפיתל במעי של מאורות. נהלים לתיוג רכיבי גידול שונים, כגון כלי דם ונויטרופילים, ואת ההליך למיצוב גידול הדמיה דרך פני השטח serosal גם מתוארים. זמן לשגות סרטים מלוקט מכמה שעות של הדמיה מאפשרים הניתוח של מיאלואידית התנהגות תא באתרו בmicroenvironment המעיים.
Introduction
ראיות מכריעות עכשיו מוכיחות כי microenvironment הגידול, בהיקף של אוכלוסיות תאים הטרוגנית, הכוללים פיברובלסטים, תאי אנדותל, תאי מערכת חיסונית ודלקתיים, מטריצת חוץ תאית, וגורמים מסיסים, ממלא תפקיד מכריע בייזום ובהתפתחות של גידולים מוצקים על ידי תרומה לכמעט כל סימני ההיכר של סרטן 1. ואכן, במהלך התקדמות גידול, יש אינטראקציות דינמיות מתמידים בין תאים סרטניים ותאי סטרומה הפכו להתפתח ליצור microenvironment חיובי לממאירות 2. בין תאי מערכת החיסון שלהסתנן microenvironment הגידול, תאי מיאלואידית הם בשפע 3 ביותר. בהיקף של מקרופאגים גידולים הקשורים (TAM), תאים המדכאים המופקת מיאלואידית (MDSCs), תאים דנדריטים (DC) ונויטרופילים (PMNs), תאי מיאלואידית מגויסים ממח עצם ובהדרגה לחדור גידולים, משחררים ציטוקינים, גורמי גדילה ופרוטאזות ה יכול לקדםצמיחה וגידול התפשטה 4. Crosstalk בין תאים סרטניים ותאי מיאלואידית הוא מורכב, אך דינמי. כך ההבנה של מהות יחסי הגומלין שלהם היא קריטית לקביעה מדוע תאים אלה לקדם התקדמות הסרטן במקום משתתף בתגובה חיסונית כנגד גידול, ועשויה לעזור למצוא מטרות חדשות כדי לשלוט בו.
תצפית ישירה על ידי מיקרוסקופ intravital מספקת מידע על דינמיקת תאים בתוך הרקמות של עכברים חיים 5. ארבעת צבעים, רב אזור, מערכת confocal דיסק מסתובב עם עדשות מיקרו נועד ללמוד תאי סטרומה בתוך גידולי החלב 6. גישה זו מאפשרת הדמיה רציפה לטווח ארוך וכוללת מספר יתרונות כגון (א) רכישת תמונות מהירות כדי למזער ממצא תנועה, (ב) הרדמה לטווח ארוך, ארבע רכישת צבע למעקב תאים מסוגים שונים (ג), תיוג ניאון (ד) רכיבים שונים של tumoral, ותצפית (ה) של שנינות microenvironments גידול שונהHin אותו העכבר כדי להימנע מעכבר ל7-9 השתנות עכבר. בעזרת טכנולוגיה זו, התנהגויות תאים שונות כבר דיווחו בוירוס גידול החלב מודל (MMTV) אונקוגן T אמצע polyoma מונע אמרגן (PyMT) המציג שלבים מתקדמים של יצירת גידולים. לימפוציטים מסוג T רגולטורים (Tregs, דמיין ידי transgene FOXP3 EGFP) להעביר באופן מועדף בסמוך לכלי דם ואילו DCS (CD11c-DTR-EGFP), פיברובלסטים הקשורים קרצינומה (Fsp1 + / + -EGFP) ותאי מיאלואידית (c-FMS -EGFP) מפגין תנועתיות גבוהה יותר בפריפריה מאשר הגידול במסת הגידול. במצב של היפוקסיה המערכתית החריפה, תאים נדדו באופן שונה: Tregs להפסיק נודדים בניגוד לתאי מיאלואידית שימשיכו לנוע 6. בנוסף, באותו מודל העכבר, זה כבר הראה כי רגישות דוקסורוביצין שינויים בשלב גידול, הפצת סמים קשורה לתגובת סמים, ודוקסורוביציןטיפול מביא לגיוס CCR2 תלוי של תאי מיאלואידית לגידולים. לפיכך, הדמיה חיה יכולה לשמש גם כדי לקבל תובנות לתוך תגובות בסמים באתר והביולוגיה של chemoresistance 10,11.
מוטציות גנטיות coli polyposis (APC) adenomatous בדרך הכלל מתרחשות באדנומות אנושיות מעי גס וקרצינומה 12 ומוטציה של עותק בודד של תוצאות גן APC בpolyposis המשפחתי adenomatous (FAP), אשר מקנה סיכון גבוה ביותר לסרטן מעי גס 13. זן העכבר Apc מינימום / + נושא מוטציה עיצור בקודון 850 של הגן APC ואופן ספונטני מתפתח אדנומות במעי מרובה בכל רחבי המעי הדק 14- 16. ההדמיה intravital לטווח ארוך של המעי היא מאתגרת בגלל הפולשנות של ההליך, שכן פתיחת חלל הצפק היא הכרחית לגישה למעי. הדמיה חיה לזמן קצר studies כבר פורסם בעבר במעי בריא 17,18, אבל תצפית ישירה לטווח הארוך של גידולים במעי לא דווחה. הליך כירורגי תוכנן ומעודן לדמיין גידולים דרך פני השטח serosal של המעי, תוך שימוש במערכת מיקרוסקופ דיסק ספינינג intravital ששימשה בעבר לגידולי שד תמונת 6,10. במאמר זה, פרוטוקול מתואר המאפשר אחד כדי לעקוב אחר התנהגותם של תאי מיאלואידית בתוך הגידולים במעי הדק באמצעות Apc מינימום / + עכברים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לנהלים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית הטיפול בבעלי חיים והשימוש (IACUC), קליפורניה בסן פרנסיסקו. כל ניסויי ההדמיה היו נהלים שאינם הישרדות ובעלי החיים מומתים מייד לאחר תום רכישת תמונה.
.1 דור של עכברים
הערה: APC מינימאלי עכברים / +, נושאת מוטציה בגן APC, באופן ספונטני לפתח 50-100 אדנומות במעי הדק.
- צלב Apc מינימאלי עכברים / + עם קו ACTB-ECFP, המבטא ECFP תחת האמרגן אקטין, ועוד יותר עם קו c-FMS-EGFP, המבטא EGFP תחת אמרגן c-FMS כדי לזהות תאי מיאלואידית. בעלי חיים הטרוזיגוטיים לACTB-ECFP וג-FMS-EGFP המשמשים לאיתור הקרינה.
- השתמש בעכברים ב3-4 חודשים של גיל לאדנומות להבחין בבירור תמונה.
2 הכנת Materials לפני הניתוח
הערה: הפרטים של הגדרת מיקרוסקופ כבר בעבר תיארו 6,7.
- מיקרוסקופ
- הפעל את שמיכת החימום. הפעל את לייזר הארגון ל488 עירור ננומטר וננומטר של מצב המוצק 405, 561 ננומטר, ו640 לייזרי ננומטר. הפעל מיקרוסקופ, יחידת בקרת דיסק ספינינג, AOTF, יחידת בקרת לייזר, ואת הבקר המצלמה.
- לפתוח את תריס מיקרוסקופ, ההופך את הנורית אדומה. הפעל את תוכנת מחשב ומצלמה.
- פלטפורמת הדמיה
- ודא שהוספת השלב היא נקייה. אחרת, נקי עם מים וסבון ולאחר מכן יבש.
- קח שני coverslips ולהשתמש מעבדה קלטת כדי לאבטח אותם בכנס. במקום להכניס על הבמה ולנקות אותו עם מגבוני אלכוהול.
- באמצעות מעבדה קלטת, לצרף את שמיכת החימום לצד הימני של הבמה.
- לוודא את התקינות של הסרעפת הגומי בחרטום ולשנות אותו אם necessary. עמדה ולתקן את חרטומו למסירת ההרדמה isoflurane לבעלי החיים על ידי שימוש בגזה ומעבדת קלטת.
- מערכת הרדמת Isoflurane
- למלא את מיכל isoflurane.
- הפעל את הוואקום ולהתאים ל1.2 ליטר / דקה.
- הוסף מים מזוקקים לnebulizer ולחבר את nebulizer למערכת isoflurane.
- הפעל את מנתח החמצן ולחבר אותו למערכת isoflurane. הפעל את מיכל החמצן ולהבטיח כי מנתח חמצן תערוכות 100%. התאם את זרימת O 2 ל0.2 ליטר / דקה.
- הפעל את טנק החנקן ולהתאים את הזרימה ב0.8 ליטר / דקה. ודא שמנתח חמצן תערוכות 21%.
- הכנת כלים לכירורגיה ופלטפורמה
- 2 זוגות נקיים של מלקחיים לנתיחה ומספריים במים וסבון.
- הפעל מעקר את החרוז החם ולתת לו להגיע 250 ° C. לעקר את הכלים ניתוח ל30 שניות. תן להם להתקרר.
- הנח שתיין מעבדה על ספסל הניתוחים.
- השתמש מכסה קלקר כפלטפורמה כירורגית. כסה עם חתיכת מעבדה שתיינית. הכן פיסת מעבדה שתיינית שנייה לשנות לאחר גילוח העכבר.
- הנח את חרטומו עם השורה של הרדמה על מכסה הקלקר המכוסה, ולצרף אותו למכסה הקלקר (לא על שתיין המעבדה) עם כמה קלטת ולהשתמש בשתי מחטים בשני הצדדים של חרטומו כדי לשמור אותו במקום.
- להרכיב בטאדין, מגבוני אלכוהול, גזה סטרילית, דבק סופר, שקופיות מיקרוסקופ, מכונת גילוח חשמלי, ו4 חתיכות של מעבדה קלטת.
.3 הכנת זריקות
- מתחת למכסה המנוע, להכין מזרק אינסולין (28 G x ½ ב) עם 7 μl של-6G Ly נוגדן המניה AF647 מצומדות- (Gr1) (1 מ"ג / מ"ל) לתוך של 2,000 (4 מ"ג rhodamine-dextran kDa / מ"ל 100 μl ) להזרקת רטרו מסלולית. הזרקת רטרו מסלולית מומלצת בApc מינימום / + עכברים מאז אנמיה שמתפתחת בבעלי החיים אלה הופכת את difficu ורידי זנבlt לזהות דרך העור.
- הכן מזרק אינסולין שני עם 1 מ"ג / קילוגרם אטרופין בדילול מלא ל150 μl PBS לתת עורית (SC) הזרקה לפני ההדמיה לצנן תנועות נפיחה של המעי.
.4 הכנת המעי להדמיה
- ודא ששורת ההרדמה לתא האינדוקציה היא פתוחה, והקווים לשולחן ומיקרוסקופ הניתוחיים סגורים.
- מעבירים את החיה לחדר ההרדמה. סגור את תא ההרדמה ולהדליק את isoflurane עד 4% (עם 21% O 2).
- כאשר סמן העכבר נושם עמוק ולאט (אחרי 5-6 דק '), להעביר אותו לשלב הניתוחי באגף שלו ומחדיר את תמיסת נוגדן Gr1 ו / או פתרון dextran רטרו orbitally.
- פתח את שורת ההרדמה צמודה לפלטפורמה כירורגית. לסגור את הקו לתא ההרדמה ולשים את העכבר על גבה עם האף שלה בחרוט ההרדמה.
- להפחית את isofluraneריכוז מ -4% ל 2.5%.
- ודא שהעכבר הוא מורדם גם על ידי צובט שודד דרכיה ובדיקת רפלקס בקרנית.
- להוסיף משחה סיכה עיניים על עיניים כדי למנוע יובש ואילו בהרדמה.
- אבטח את הגפיים של העכבר לשלב הניתוחי על ידי הוספת מעבדה קלטת.
- להסיר את השיער ממשטח הגחון באמצעות מכונת גילוח חשמלית. גם להסיר את השיער מהאיבר האחורי השמאלי כדי למקם את oximeter לפני הרכישה. הסר את שתיינית המעבדה משלב הניתוח ולהחליף עם אחד נקי, כדי למנוע זיהום שיער.
- לחטא את פני השטח הגחון עם מגבוני אלכוהול ובטאדין.
- הזרק פתרון אטרופין (מ3.2) sc באגף אחד של העכבר.
- לעשות חתך 1 סנטימטר הגחון קו האמצע דרך העור והצפק על ידי מספריים באמצעות וזוג אחד של מלקחיים. משכו בזהירות את 3-4 סנטימטר של מעי ולזהות גידולים אחד או כמה לתמונה.
- קח MICR זכוכיתשקופית oscope ועמדת לולאה של המעי על זה עם גידול בראש.
- להוסיף קצת דבק סופר לכמה מקומות לאורך המעי לצרף אותו לשקופית. חכה דק אחת לדבק להתייבש. השתמש סמן כדי לצייר קו בשקופית המצביעה על הגידול על מנת להקל הלוקליזציה שלה עם confocal.
.5 מיקום העכבר על הבמה והכנה לרכישת תמונה
- הסר מעבדה קלטת מהגפיים.
- פתח את שורת ההרדמה לבמה מיקרוסקופ ולסגור את אחד לפלטפורמה כירורגית.
- העבר את העכבר בזהירות לבמה מיקרוסקופ עם הצד שלה הגחון למטה ואפה בחרטומו. לאבטח את קו ההרדמה עם כמה מעבדה קלטת.
- Re-מקם את העכבר ו / או השקופיות כדי שיהיה לי המעי במרכזו של אחד מהחלונות החליק כיסוי. בעדינות קלטת את השקופית עם מעבדה קלטת.
- צרף את הבדיקה oximeter לאיבר השמאלי של העכבר כדיאחרי הלב שלו ורמות שיעור וריווי חמצן עורקי נשימה.
- כסה את העכבר עם שמיכת החימום, כדי למנוע היפותרמיה.
- להקטין את ריכוז isoflurane מ2.5% ל1-1.5% להדמיה.
.6 רכישת תמונות על ידי שימוש בתוכנת μManager
- להגדיל את מהירות CSUX ל -2,500 סל"ד כדי לשפר את איכות התמונה בהגדרות התצורה.
- השתמש בתפריט הנפתח המטרה לבחור 10X 0.5 NA או 20X 0.75 אובייקטיבי עדשת NA Fluar.
- בחר ננומטר לייזר 405 מתפריט הנפתח צבע.
- לחץ על חיים ומכוונים את הפוקוס במיקרוסקופ.
- לחץ על Auto כדי להתאים באופן אוטומטי עוצמות פיקסל מינימום ומקסימום של תמונת התצוגה המבוססים על ערכי פיקסל הקיצוניים בתמונה. היסטוגרמה של עוצמות פיקסל של תמונת התצוגה מוצגת בגרף בחלקו התחתון של החלון הראשי.
- התאם את חשיפת המצלמה בחלון פייפר לוח הבקרה על ידישינוי המספר של שעונים (שעון אחד הוא 33.333 אלפיות שני).
- אם האות בהיר מדי עם החשיפה הנמוכה ביותר, להקטין את עוצמת לייזר באמצעות יחידת בקרת מיקרוסקופ.
- בדוק את עוצמת האות ל488 ננומטר, 561 ננומטר ו640 קווי לייזר ננומטר. להתאים את עוצמת לייזר עם היחידה של הלייזר של שליטה (488 ננומטר ו561 ננומטר) או יחידת בקרת מיקרוסקופ.
- בחלון Multi D הרכישה, סמן את תיבת נקודות זמן והקלד במספר נקודות זמן, ומרווח זמן רצוי.
- סמן את תיבת Z-הערימות, לבחור "Z היחסי" ומגדיר את Z-התחלה ויחסית Z-קץ למיקום הנוכחי.
הערה: לקבלת 10X או 20X אובייקטיבי, להתחיל עם 3 מטוסי Z, 8 מיקרומטר או 4 מיקרומטר בנפרד בהתאמה. - סמן את תיבת עמדות מרובות (XY) להדמית מספר מקומות, ולאחר מכן לחץ על רשימת עמדת עריכה, לסמן 4 עד 6 עמדות שונות.
- סמן את תיבת הערוצים ולהוסיף ערוצים מניו ובחר לייזרי קווים מהתפריט הנפתח והמשאדואר בחשיפה לכל ערוץ (בכפולות של 33.333 אלפיות שני).
- בדקו תמונות שמור בחלון "רכישת Multi D".
- בחר תיקייה וכל התמונות שנרכשו תישמר באופן אוטומטי בתיקייה זו עם השם שניתנת קידומת.
הערה: כל רכישה רציפה תישמר בתיקיית משנה נפרדת כקבצי TIFF פרטניים לכל פרוסה Z בכל צבע בכל נקודת זמן. - שמור את כל ההגדרות על ידי לחיצה על שמור הגדרות בחלון Multi D הרכישה.
- לחץ לרכוש בחלון הרכישה רב ממדי להתחיל רכישה.
- אם הבדיקה oximeter אינה משמשת או מפסיקה לעבוד היטב (כאשר הדופק אינו יציב או קשה לזהות), לבדוק את היעילות של הרדמה כל 15 דקות במהלך הליך ההדמיה על ידי צובט שודדת הדרכים ובדיקת רפלקס בקרנית. התאם את ההרדמה אם העכבר הוא מגיב לגירויים אלה.
- לאחר רכישה, להרדים את העכבר על ידי הגדלת concent isofluraneמנה עד 5%. כאשר אין תנועות נשימה הן לגילוי, להסיר את העכבר מהבמה ולבצע נקע בצוואר הרחם.
.7 ניתוח של תמונות על ידי שימוש בתוכנת Imaris
- המרה ל.ims קבצים (איור 1 א המשלים)
- פתח את תוכנת המצלמה, לחץ על קובץ ולאחר מכן אצווה ממיר.
- לחץ על הוסף קבצים ולבחור את הקובץ הראשון של העמדה הראשונה. חזור על פעולה עבור כל עמדה.
- עבור כל קובץ שהועלה, לחץ על הגדרות ולוודא שההגדרות "t" עבור הזמן, "ג" לערוצים ו" z "עבור Z-ערימות מופיעות לפי הסדר הזה.
- חוסך בתיקייה הרצויה. לגלוש וליצור קובץ חדש כמומר.
- לחץ על הגדר עבור כל והתחל.
- התאמות (משלים איור 1)
- לכו אל תיקיית המרה הספציפית ולפתוח את הקובץ הראשון.
- בחלון התאמת תצוגה, להתאים את הרקעהפסקת אות על ידי שינוי המספר מינימאלי לכל ערוץ במידת צורך.
- במידת צורך, להתאים את עוצמת האות על ידי שינוי המספר מקסימאלי (המספר מקסימאלי נמוך יותר, גבוה יותר את עוצמת האות).
הערה: התאמות של עוצמה / ניגוד האות לאפשר גולת הכותרת של התנהגות תא או תא על מנת שתהיה יותר נחמדה להדמיה. זה לא משנה את התוצאה עצמה. - לחץ על ערוך מאפיינים ותמונה.
- לשנות את x, y, z וערכים (ל10X אובייקטיבי, x, y = 0.712, z = 8 מיקרומטר; ל20X מטרה: x, y = 0.36, z = 4 מיקרומטר).
- לחץ על כל מרחק שווה להתאים נקודות זמן. הוסף את תאריך ההתחלה ושעת התחלה של הרכישה. הוסף את תאריך הסיום ושעת סיום של הרכישה (1C איור משלים).
- לחץ על כפתור Play כדי לראות את הסרט.
- לחץ על עריכה ומחיקה נקודות זמן למחוק תמונות מטושטשות.
- כדי להצטרף ט.ו.ג. שתי רכישות נפרדותיס לתוך סרט אחד, ללכת לנקודת הזמן האחרונה של הסרט הראשון ולחץ על Edit> הוסף נקודות זמן להוסיף את הקובץ השני.
- שמירה כסרט (1D איור משלים)
- לחץ על רשומה, לבחור את סיומת .mov וגורם דחיסה של 0.
- לחץ על Save.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות מיקרוסקופיה confocal הדיסק מסתובבת, רקמות שאינן tumoral וtumoral במעי הדק של Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; ניתן דמיינו עכברים c-FMS-ECFP מפני שטח serosal. לאחר הדמיה, תוכנת מצלמה משמשת כדי לנתח ולהתאים את הרכישה (איור משלים 1). לאחר (iv) הזרקה תוך ורידית של dextran-rhodamine 2,000 kDa ניאון ונוגדנים מצומדות Ly-6G 647, ניתן לאתר כלי דם וPMNs בהתאמה (איור 1). הטלאים של Peyer שהם מקבצים של רקמת הלימפה ומלאה של תאי מיאלואידית ניתן לראות בקלות (איור 1 א). מאורות של המעי הדק מוקפים בכלי דם ותאי מיאלואידית (איור 1 א ו -1 B). רקמת Tumoral היא לעתים קרובות יותר כלי דם ועוד חדר על ידי תאי מיאלואידית, והמבנה של מאורות הוא פחות w מאורגן ell (איור 1 א ו -1 B) בהתאם לגודלו של הגידול. רכישה יכולה להיעשות על ידי שימוש בNA 10X 0.5 (איור 1 א) ו20X 0.75 עדשות NA Fluar (איור 1), אך השגנו את הביצועים הטובים ביותר עם עדשת 10X 0.5 NA Fluar שהייתה בהיר, מאפשר הרכישה של אזור גדול (676 x 676 מיקרומטר) ויכול לספק תמונות ממרחק של עד 70 מיקרומטר לתוך הרקמה. יקטין ECFP שכבת שריר להביע החלק לפעמים יכול להפוך את הפוקוס על אפיתל המעיים קשה (איור 1, פנל מימין). ניתן בעקבות דינמיקת תאי מיאלואידית בגידולים בזמן אמת לכמה שעות כפי שמוצגת באנימציה / וידאו איור 2. בעוד נויטרופילים (Gr1 + תאים) לזרום בכלי דם ולסייר ברקמות, תאי מיאלואידית אחרים, בעיקר מקרופאגים, מקיפים את מאורות והם פחות נעימים ב( אנימציה / וידאו איור 2).
n-page = "תמיד"> 
איור 1 תמונות נציג שהושגו עם confocal דיסק ספינינג של רקמה שאינה tumoral וtumoral מApc מינימום / + עכברים. () תמונות ארבעה צבעים (10X Fluar, 0.5 עדשת NA) של אפיתל המעי הדק מפני שטח serosal של Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; cfms-EGFP עכבר שקיבל ניאון iv 2,000 dextran-rhodamine kDa (אדום) ו647 נוגדן Ly-6G מצומדות (לבנה). הלוח השמאלי מציג את האפיתל שאינו tumoral והפנל הימני מראה גידול מאותו Apc מינימום / +; ACTB-ECFP; עכבר cfms-EGFP. תאי מיאלואידית ירוקים ותאי האפיתל הם כחולים. מקבץ של c-FMS + תאים נראה ברקמת המעי שאינו tumoral בתיקון של Peyer (חץ לבן), סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (ב ') תמונות ארבעה צבעים (20X Fluar, 0.5 NAעדשה) של אפיתל המעי הדק מפני שטח serosal של מינימום Apc / +; ACTB-ECFP; גידול cfms-EGFP. בפנל מהשמאל, כמה c-FMS Gr1 + כפול חיובי + תאים מזוהים ברקמת tumoral. הפנל הימני מראה תמונה של שכבת השריר החלקה להביע תקטין ECFP שיכול להפוך את הפוקוס על אפיתל המעיים קשה, סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר.
אנימציה / וידאו איור 2. דינמיקת תא מיאלואידית באדנומה 3 מ"מ מנגמ"ש מינימום / + עכבר. ארבעה צבע זמן לשגות של האפיתל המעי הדק (10X Fluar, 0.5 עדשת NA) מפני שטח serosal של Apc מינימום / + ; ACTB-ECFP; cfms-EGFP שיתוף הזריק עכבר עם dextran-rhodamine ניאון 2,000 kDa (אדום) ו647 נוגדן Ly-6G מצומדות (לבנה). תאי מיאלואידית ירוקים ותאי האפיתל הם כחולים. תאי מיאלואידית סביב מאורות לא זזים. נויטרופילים מסוימים (תאי Gr1 + בלבן) מפטרלים ברקמות. זוהי רכישה 2 שעות והסרט כבר האיץ 295 פעמים.
איור משלים 1. צילומי מסך של תוכנת מצלמה לניתוח רכישה. () ראשית, הקבצים צריכים להיות מומרים להארכת .ims. (B) ואז, יכולות להיות מותאמות תמונות תצוגה, כגון אותות ספציפיים יכול להיות מוגבר ורקע ירידה תאריך. (C) וזקוק לזמן כדי להיות מותאם על מנת לקבל סרט בזמן אמת. (ד ') הרכישה ניתן לשמור כסרט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במאמר זה, פרוטוקול מפורט מתואר לספינינג confocal הדמיה דיסק של דינמיקת תא מיאלואידית בגידולים במעי במשך כמה שעות בחי, צילמו מהצד serosal של המעיים.
כדי להימנע מדלקת ויש להם תנאים פיסיולוגיים אופטימליים, הדמיה של המעי צריכה להיעשות על האיבר שלם. עם זאת, הדמיה מהצד serosal של המעי היא מאתגרת, מאחר שהאור צריך לעבור שכבות רקמה שונות כגון שריר חלק לפני שהגיע לאפיתל. התמקדות באפיתל יכולה להיות קשה באזורים מסוימים, בעיקר בעכברי הכתב יקטין ECFP מאז אקטין באו לידי הביטוי בחום על ידי תאי שריר חלק. למרות ששני הפוטונים במיקרוסקופ יש את היתרון של חדירה לרקמות עמוקה יותר בהשוואה למיקרוסקופי confocal, מצאנו כי מיקרוסקופ confocal דיסק ספינינג הוא חזק מספיק כדי להשיג הדמיה טובה של מבנה אפיתל במעי. יתרונות oמיקרוסקופיה הדיסק מסתובב f כוללת את היכולת לרכישה מהירה מאוד ורגישות ייחודית מבלי להקריב רזולוציה confocal. איכויות אלו מאפשרות התצפית של תהליכים דינמיים גם אם כמה נקודות זמן צריכה להיות נמחקו בשל חפצי תנועה, למזער photodamage, ולאפשר ההדמיה של מולקולות יחסית חלש ניאון.
מעי הדמיה מהצד serosal יכול גם להיות מאתגר בגלל תנועות peristaltic אנדוגני של איבר זה. בפרוטוקול זה, הזרקת sc של אטרופין ניתנת לפני ההדמיה, ובו ביעילות מקטינה את התנועה. עם זאת, חשוב לשים לב כי תנועת peristaltic היא יותר נרחבת במעי הגס, אך לא בלמה היטב על ידי טיפול אטרופין, טיוח הדמיה די קשה בחלק זה של המעי. שכבת שריר החלק במעי הגס היא קצת יותר בולטת ג ompared למעי הדק ונראה יותר התכווצות. לכן,כמעט בלתי אפשרי להתמקד באפיתל בעכברי הכתב יקטין ECFP. יתר על כן, בנוסף לתנועות אנדוגני אלה, נסחף איבר יכול להתרחש, אבל בתיקון להיסחף אחורי מקרה זה יכול להתבצע על ידי שימוש בתוכנת המצלמה.
אתגר מרכזי נוסף בניסויי הדמיה פולשנית הוא לשמור על העכבר חי ובריאים זמן רב ככל האפשר בהרדמה. הוא הגיע המעי על ידי פתיחת חלל הצפק. כך ההליך הוא יותר חודרני מזה המשמש להדמית גידול החלב, שיכול להיעשות עד 40 שעה בגלל היושרה של הצפק. הרכישה המרבית נעשתה עם חלל הצפק פתח הייתה 6 שעות, אבל העכבר עדיין היה בחיים ללא סימנים ברורים של מצוקה, כך שגם רכישה עוד עשויה להיות אפשרית.
במיאלואידית מחקר זה התנהגות תא יכולה להיות אחרי ונותחה תוך הגידול במעי באמצעות עכברי כתב ניאון וגם לא fluorochrome מצומדות-מרוץ או נוגדנים. גם גישה זו יכולה לשמש להתבוננות סוגי תאים אחרים כגון Tregs, תאים או fibroblasts דנדריטים באמצעות FOXP3-EGFP או CD11c-DTR-EGFP, או עכברי כתב Fsp1-EGFP בהתאמה, כפי שנעשה בו שימוש במחקר גידול החלב 6 . כמו כן, ניתן להזריק נוגדני ניאון נגד אוכלוסיות תאים אחרות מאשר נויטרופילים iv בנוסף, התנהגות תא יכולה גם להיות מנותחת בתנאים שונים, כגון חוסר חמצן. ניסויים אלה עשויים לתת תובנות חדשות על התנהגותם של תאי סטרומה אלה לאחר טיפול בכימותרפיה או טיפול ממוקד. לבסוף, פרוטוקול זה יכול לשמש במודלים של עכברים אחרים של סרטן מעי גס ובשלבים שונים של התקדמות גידול. Apc מינימום / + עכברים לפתח פוליפים במעי adenomatous רק, שאינו להתקדם לממאירות, כי יש לי העכברים תוחלת חיים מקוצרים. יהיה מעניין ללמוד את הדינמיקה של תאי מיאלואידית בדגמי סרטן מעי אחרים עם יותר AGGגידולי ressive ופולשניים כגון עכברים שנשאו מוטציות בK-ras 19-21 או Smad4 22 גנים בנוסף למוטצית APC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ליינג יו לגנוטיפ / + עכברי Min APC. מחקר זה נתמך על ידי כספים מINSERM ומענקים (CA057621 וAI053194) מהמכון הלאומי לבריאות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ApcMin/+ mice | Jackson Laboratory | 2020 | |
| ACTB-ECFP mice | Jackson Laboratory | 3773 | |
| cfms-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 2,000 kDa Dextran, rhodamine-conjugated | Invitrogen | D7139 | |
| Isoflurane | Butler Animal Health Supply | 29450 | |
| Nitrogen | UCSF | ||
| Oxygen | UCSF | ||
| 1x PBS | UCSF cell culture facility | ||
| Saline Buffer | UCSF cell culture facility | ||
| Anti-mouse Ly-6G (GR1) antibody AF647 | UCSF Monoclonal antibody core | Stock 1 mg/ml. Use at 7 μg/mouse | |
| Atropine | LARC UCSF | Use at 1 mg/kg mouse | |
| Alcohol wipes | Becton Dickinson | 326895 | |
| 28 G x 1/2 in. insulin syringe | Becton Dickinson | 329465 | |
| Remium cover glass | Fisher Scientific | 12-548-5M | 24x50-1 |
| Betadine | LARC UCSF | ||
| Heat blanket | Gaymar Industries | ||
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 18000-45 | Turn ON 30 min before use |
| Cotton tipped apllicators 6-inch | Electron Microscopy Sciences | 72310-10 | |
| Anesthesia system | Summit Anesthesia Support | ||
| Inverted microscope | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| Stage insert | Applied Sientific Instrumentation | ||
| Mouse Ox oximeter, software and sensors | Starr Life Sciences | MouseOx | |
| Nebulizer | Summit Anesthesia Support | ||
| Imaris | Bitplane | ||
| μManager | Vale lab, UCSF | Open-source software | |
| ICCD camera | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| Spinning disk confocal sacan-head | Yokogawa Corporation | CSU-10b |
References
- Hanahan, D., Weinberg, R. A.
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21 (3), 309-322 (2012).
- Schouppe, E., De Baetselier, P., Van Ginderachter, J. A., Sarukhan, A. Instruction of myeloid cells by the tumor microenvironment: Open questions on the dynamics and plasticity of different tumor-associated myeloid cell populations. Oncoimmunology. 1 (7), 1135-1145 (2012).
- Egeblad, M., Nakasone, E. S., Werb, Z. Tumors as organs: complex tissues that interface with the entire organism. Dev Cell. 18 (6), 884-901 (2010).
- Lohela, M., Werb, Z. Intravital imaging of stromal cell dynamics in tumors. Curr Opin Genet Dev. 20 (1), 72-78 (2010).
- Egeblad, M., et al. Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy. Dis Model Mech. 1 (2-3), discussion 165 155-167 (2008).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Dynamic long-term in vivo imaging of tumor-stroma interactions in mouse models of breast cancer using spinning-disk confocal microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb top97 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5563 (2011).
- Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Preparation of mice for long-term intravital imaging of the mammary gland. Cold Spring Harb Protoc. 2011 (2), pdb prot5562 (2011).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), e50088 (2013).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Walther, A., et al. Genetic prognostic and predictive markers in colorectal cancer. Nat Rev Cancer. 9 (7), 489-499 (2009).
- Fearon, E. R.
- Moser, A. R., Pitot, H. C., Dove, W. F. A dominant mutation that predisposes to multiple intestinal neoplasia in the mouse. Science. 247 (4940), 322-324 (1990).
- Su, L. K., et al. Multiple intestinal neoplasia caused by a mutation in the murine homolog of the APC gene. Science. 256 (5057), 668-670 (1992).
- Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
- McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
- Xu, C., Shen, Y., Littman, D. R., Dustin, M. L., Velazquez, P. Visualization of mucosal homeostasis via single- and multiphoton intravital fluorescence microscopy. J Leukoc Biol. 92 (3), 413-419 (2012).
- Haigis, K. M., et al. Differential effects of oncogenic K-Ras and N-Ras on proliferation, differentiation and tumor progression in the colon. Nat Genet. 40 (5), 600-608 (2008).
- Sansom, O. J., et al. Loss of Apc allows phenotypic manifestation of the transforming properties of an endogenous K-ras oncogene in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (38), 14122-14127 (2006).
- Janssen, K. P., et al. APC and oncogenic KRAS are synergistic in enhancing Wnt signaling in intestinal tumor formation and progression. Gastroenterology. 131 (4), 1096-1109 (2006).
- Takaku, K., et al. Intestinal tumorigenesis in compound mutant mice of both Dpc4 (Smad4) and Apc genes. Cell. 92 (5), 645-656 (1998).
