Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

التفكك الحاد من الجلكى الشبكي المحاوير لتمكين تسجيل من الإصدار الوجه غشاء من محطات قبل المشبكي الوظيفية الفردية

Published: October 1, 2014 doi: 10.3791/51925
Automatic Translation
1, 1
1Biological Sciences, University of Illinois at Chicago

Abstract

انتقال متشابك هو عملية سريعة للغاية. إمكانات العمل مدفوعة تدفق الكالسيوم 2+ في محطة قبل المشبكي، من خلال قنوات الكالسيوم الجهد بوابات (VGCCs) الموجود في غشاء الوجه الإفراج عنهم، هو على الزناد لانصهار حويصلة والافراج عن العصبي. حاسمة بالنسبة لسرعة انتقال متشابك هو التزامن المكاني والزمني بين وصول إمكانات العمل، VGCCs وآلية إطلاق ناقل عصبي. القدرة على تسجيل مباشرة الكالسيوم 2+ التيارات من الغشاء الإفراج وجه محطات قبل المشبكي الفردية أمر حتمي لفهم دقيق للعلاقة بين الكالسيوم قبل المشبكي 2+ وإطلاق ناقل عصبي. الوصول إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج الوجه لتسجيل الكهربية غير متوفر في معظم الاستعدادات والكالسيوم قبل المشبكي 2+ تميزت الدخول باستخدام تقنيات التصوير وmeasureme الحالي العيانيةاليلة - التقنيات التي ليس لديها قرار زمني يكفي لتصور دخول الكالسيوم 2+. لم يكن توصيف VGCCs مباشرة في محطات قبل المشبكي واحدة ممكن في نقاط الاشتباك العصبي المركزي وتمت حتى الآن تحققت بنجاح إلا في الكأس من نوع المشبك من العقدة الهدبية وفرخ في كؤوس زهرية الفئران. عالجنا هذه المشكلة بنجاح في المشبك الشبكي العملاق من الحبل الشوكي الجلكى من خلال تطوير إعداد فصلها تماما من الحبل الشوكي يمكن أن ينتج محاور الشبكي المعزولة مع محطات قبل المشبكي وظيفية خالية من الهياكل بعد المشبكي. يمكننا تسمية fluorescently وتحديد محطات قبل المشبكي الفردية واستهدافهم للتسجيل. باستخدام هذا الإعداد، واتسمت VGCCs مباشرة في وجه الافراج عن محطات قبل المشبكي الفردية باستخدام المناعية والكهربية النهج. وقد سجلت كاليفورنيا 2+ التيارات مباشرة في إطلاق الوجه غشاء سمحطات قبل المشبكي فردية جمعة، أول مثل هذا التسجيل التي يتعين الاضطلاع بها في نقاط الاشتباك العصبي المركزي.

Introduction

انتقال متشابك هو عملية سريعة ودقيقة للغاية. العمل غزو محتمل من المحطة قبل المشبكي يؤدي إلى فتح VGCCs تقع في الغشاء الإفراج جهه، والزيادة الناتجة في كاليفورنيا قبل المشبكي 2+ بوصفها الزناد عن الانصهار الحويصلة والعصبي الإفراج 1. كل هذه الخطوات تحدث داخل مئات ميكروثانية 2، وبالتالي تتطلب اقتران مكاني ضيق من VGCCs إلى حويصلة الانصهار الآلات 3. وقد تميزت الكالسيوم قبل المشبكي 2+ تدفقات المقام الأول من خلال النهج التصوير باستخدام الأصباغ الكالسيوم 2+ الحساسة 4. دمج الكالسيوم 2+ المخازن المؤقتة التي تعدل الكالسيوم في الخلايا العصبية قبل المشبكي 2+ وقد استخدم لتوصيف غير مباشر العلاقة بين الكالسيوم والنقل العصبي قبل المشبكي 3. بالإضافة إلى ذلك، تحوير قبل المشبكي مجانا كا 2+ تركيز الكالسيوم عن طريق uncaging 2+ 5 أو تسجيل macroscopiج كا استخدمت 2+ التيارات جنبا إلى جنب مع التدابير الانصهار الحويصلة و / أو الإطلاق. مثل قياسات السعة 2 6 أو بعد المشبكي الردود على معالجة نفس السؤال. ومع ذلك، تميز كا 2+ التيارات مباشرة في وجه الإفراج عنهم، وقسم متخصص للغشاء قبل المشبكي حيث تتم ترجمة الاستقطاب في غشاء الكالسيوم 2+ التيارات اثار الانصهار حويصلة متشابك وإطلاق ناقل عصبي، هو جزء لا يتجزأ من الحصول على قياس دقيق لكا 2+ شرط حويصلة متشابك الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، فإن القدرة على تميز مباشرة الكالسيوم 2+ التيارات في محطات قبل المشبكي فردية، إلى جانب قياسات دقيقة في وقت واحد الانصهار حويصلة والافراج يسمح التوضيح الدقيق للعلاقة بين توقيت مدار الساعة من إمكانات العمل، قبل المشبكي الكالسيوم 2+ الحالية، الانصهار حويصلة والافراج عنهم. الوصول إلى غشاء الإفراج الوجهغير متوفرة في معظم محطات قبل المشبكي المقرر ان تغلق بدل من التشعبات بعد المشبكي. وكانت هذه صعوبة الوصول عقبة رئيسية في توصيف VGCCs لأنه يمنع القياسات المباشرة الحالية في محطات قبل المشبكي فردية. وحتى الآن لم توصيف المباشر من قبل المشبكي الكالسيوم 2+ التيارات في محطات قبل المشبكي فردية ممكن في نقاط الاشتباك العصبي المركزي، وقد تتحقق إلا في اثنين من نوع كأسي محطات قبل المشبكي. الكأس من نوع المشبك من فرخ العقدة الهدبية 7-10 والفئران الكؤوس 11،12. في جميع محطات قبل المشبكي الأخرى بما في ذلك المشبك الشبكي العملاق في الجلكى الحبل الشوكي 13، وعدم الوصول إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج الوجه وقد استلزم استخدام الأساليب غير المباشرة مثل التصوير الكالسيوم 2+ لدراسة الكالسيوم قبل المشبكي 2+ التدفقات.

الشكل 1 الرقم 1. الجلكى المشبك الشبكي العملاق. (أ) عبر قسم من الجلكى الحبل الشوكي مما يدل توجيه ظهراني البطني. وتتميز محاور الشبكي مع أستريكس الأخضر (ب) إعادة الإعمار 3-D من المشبك الشبكي في النخاع الشوكي الجلكى تظهر المحوار قبل المشبكي الشبكي جعل العديد أون الاتصالات بسنت (تميزت السهام الخضراء) على عصبون بعد المشبكي 13. وقد وصفت محطات قبل المشبكي مع اليكسا فلور 488 هيدرازيد phalloidin مترافق (الأخضر)، بينما يتم شغل عصبون بعد المشبكي مع اليكسا فلور 568 هيدرازيد (الحمراء).

محاور الشبكي الجلكى العملاقة، وتقع في المنطقة البطنية من النخاع الشوكي مواز للمحور منقاري الذيلية-1A الشكل، شكل متعددة أون الاتصالات متشابك بسنت على الخلايا العصبية للالشوكي القرن البطني الشكل 1B 14 13. وقد سجلت العيانية خلية كاملة الكالسيوم 2+ التيارات من محاور الشبكي في النخاع الشوكي سليمة 13،15. ومع ذلك، محاولات عمياء السابقة في القياس المباشر من الكالسيوم أثبتت 2+ التيارات في محاور الشبكي في الجلكى الحبل الشوكي سليمة باستخدام الخلية المرفقة تقنية المشبك التصحيح الفاشل 13 بسبب عدم وجود الوصول إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج الوجه بسبب العمليات بعد المشبكي معارضة الشكل 1B. غشاء الإفراج وجه أحرز في السابق الوصول إليها عن طريق إزالة الخلايا العصبية بعد المشبكي 11، اضطراب الميكانيكية المشبك قبل تسجيل 12 أو المعالجة الأنزيمية إلى جانب التفكك الميكانيكية 16. نظرا لمنظمة معقدة من الحبل الشوكي، فإنه يكون من الصعب للغاية تحديد الخلايا العصبية بعد المشبكي وسحب ذلك ميكانيكيا أو التشويش عشرالبريد المشبك. ومن هنا، قررنا استخدام المعالجة الأنزيمية 17 تليها التفكك الميكانيكية.

باستخدام هذا النهج، قمنا بتطوير وإعداد فصلها تماما من الحبل الشوكي الجلكى أن ينتج محاور الشبكي منعزلة قابلة للحياة مع محطات قبل المشبكي وظيفية خالية من أي عمليات بعد المشبكي، وبالتالي توفير وصول غير مقيد إلى محطات قبل المشبكي الفردية. بالتزامن مع معيار مقلوب المجهر والتصوير مضان، وتمكننا من تحديد واستهداف محطات قبل المشبكي fluorescently التي تم تحديدها الفردية، مع ماصة التصحيح يحتوي على محلول التسجيل الذي يعزل الكالسيوم 2+ التيارات والشكل الشكل 4C 4D، لتسجيل باستخدام الخلوي تعلق تقنية الجهد المشبك. وقد سجلت كاليفورنيا 2+ التيارات مباشرة في الغشاء قبل المشبكي الإفراج مواجهة فردية محطات قبل المشبكي الشكل 4F. هذا هو الهامة فياختراق الإقليم الشمالي في مجال انتقال متشابك لأنه هو الأول من نوعه التسجيل التي يتعين الاضطلاع بها في نقاط الاشتباك العصبي المركزي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد بولي-D-يسين هيدروبروميد

  1. إعداد 1 ملغ / مل بولي-D-يسين هيدروبروميد في 0.1 م العازلة بورات (الرقم الهيدروجيني 8.5).
  2. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية.

2. طلاء بولي يسين من Coverslips

ملاحظة: إجراء جميع الخطوات التنظيف والطلاء في غرفة تدفق الصفحي.

  1. coverslips مكان في طبق بتري تحتوي على 1 حمض الهيدروكلوريك N (حمض الهيدروكلوريك) لمدة 2 ساعة.
  2. نضح كل حمض الهيدروكلوريك وشطف مع 70٪ إيثانول (ETOH) 2-3x.
  3. ترك في ETOH 70٪ لمدة 1 ساعة.
  4. نضح عن 70٪ ETOH وشطف مع 100٪ ETOH 2-3x.
  5. ترك في 100٪ ETOH لمدة 2 ساعة. نضح كل ETOH.
  6. وصمة عار الجافة مع ورق الترشيح والهواء الجاف لبضع ثوان.
  7. مكان O / N في 1 ملغ / مل حل بولي يسين.
  8. شطف coverslips اليوم التالي مع ميليبور 4-5x المياه.
  9. الهواء الجاف بولي يسين المغلفة coverslips على بكرات زجاجية في طبق بيتري نظيفة.
  10. لimmunohistochemistrذ، استخدم 35 × 10 مم طبق بيتري الأغطية. إعداد sylgard (polydimethylsilioxane، PDMS) اصطف أطباق بصب PDMS (المطاط الصناعي وكيل علاج 10: 1 بالوزن) في طبق لسمك 0.3 سم والسماح لضبط عند 30 درجة CO / N. مرة واحدة وقد وضعت هذا، وقطع 2 سم في 1 سم أقحم في PDMS. نظيفة ومعطف أقحم مع بولي يسين باتباع نفس الخطوات المذكورة أعلاه لcoverslips.
  11. مخزن بولي يسين coverslips المغلفة وأطباق غطت داخل غرفة التدفق الصفحي حتى استخدام (تصل إلى 2 أسابيع، ولكن تحقيق أفضل النتائج لاصقة من خلال إعداد دوري كل 3-4 أيام).
  12. إعداد كتلة PDMS، يعلقون الحبل الشوكي في تقطيع اللحم والأنسجة تهتز. مزيج المرنة A و B إلاستومر 1: 1 بالوزن. تصب في 100 × 15 مم طبق بتري والسماح لضبط O / N عند 30 درجة مئوية. قطع قطعة مستطيلة من نظام تطوير إدارة الأداء والغراء على قاعدة لوحة التقطيع باستخدام الغراء الايبوكسي. السماح للالغراء لتعيين تحديد PDMS في مكان وشريحة رقيقة أقسام متعددة من السطح للحصول على شقةسطح لدبوس الأنسجة جرا.

3. الحاد التفكك لالجلكى الحبل الشوكي إلى العائد المعزولة الشبكي المحاوير

  1. تخدير وammoecoete أو الكبار الجلكى (Petromyzon مارينوس) مع methanesulphonate تريكين (MS-222؛ 100 ملغم / لتر). إضافة مخدر في الماء، في كوب من البلاستيك غطاء من تغطيتها، تحتوي على الجلكى لا بد من التضحية.
  2. قطع رأس الجلكى في البارد (4 ° C) حل رينغر من التشكيل التالي (مم): 130 كلوريد الصوديوم، و 2.1 بوكل، 2.6 CaCl 2، 1.8 MgCl 2، 4 HEPES، 4 سكر العنب (الرقم الهيدروجيني 7.6، الأسمولية 270 الميلي أسمول) وإزالة الجسم عضلات جدار لفضح السطح الظهري للحبل الشوكي.
  3. إزالة السحاءة primitiva من السطح الظهري للحبل الشوكي باستخدام ملقط غرامة. لا تقم بإزالة بطني السحاءة primitiva في هذه المرحلة.
  4. قطع النخاع الشوكي في 1 سم قطع طويلة.
  5. دبوس قطعة الحبل الشوكي باستخدام دبابيس الحشرات الجميلة، الجانب الظهري متجهة لأعلى، على PDMS تشريح قاعدة جيش التحرير الشعبى الصينى واصطفالشركة المصرية للاتصالات (انظر 2.12) في تقطيع اللحم والأنسجة تهتز غرفة تحتوي على حل رينغر الجليد الباردة.
  6. إزالة الجزء الأوسط من العمود الظهري في النخاع الشوكي تشريح على طول محور rostro-الذيلية مع شفرة من قبل، تاركا وراءه أقسام العمود الظهري سليمة على منقاري والذيلية تنتهي لتكون بمثابة يعالج أثناء عملية التفكك الشكل 2A و 2B الشكل. استخدام أبطأ سرعة الإعداد الذي يسمح تشريح وإعداد عمق التي تزيل فقط العمود الظهري ترك العمود الأساسي محوار الشبكي الشكل 2B غير التالفة.
  7. احتضان قطع الحبل الشوكي شرائح في RT لمدة 45 دقيقة في مزيج من 1 ملغ / البروتيني مل (النوع الرابع عشر من المتسلسلة غريس) و 1 ملغ / كولاجيناز مل أعد (نوع IA من كلوستريديوم الحالة للنسج) في محلول رينغر (مقتبس من ش Manira وBussières ، 1997 17).
  8. قطع في الحبل الشوكي دبوس المعالجة انزيم باستخدام دبابيس الجميلة في PDMS اصطف طبق بتري حساب المشتركining الباردة (4 ° C) حل رينغر.
  9. إزالة بطني السحاءة primitiva مع ملقط غرامة.
  10. قطع مساحات الجانبية للنخاع الشوكي بشفرة المشرط في منتصف الجزء الظهري شرائح ترك العمود المركزي من المحاور الشبكي سليمة في الحبل الشوكي الشكل 2D.
  11. وضع قطرة من زيت الغمر على العدسة.
  12. وضع ساترة بولي يسين المغلفة (الشكل 3A، اكبر قطعة، مستطيل أحمر) في الفتحة من غرفة تسجيل الشكل 3 وتطبيق الشحوم فراغ لجميع الحواف (الفضاء بين المستطيلات الحمراء والزرقاء في الشكل 3A، لتسهيل ختم. برغي أعلى في مكانها. وضع الغرفة في أقحم على منصة التسجيل.
  13. إضافة حل رينغر إلى غرفة تسجيل باستخدام ماصة باستور.
  14. توصيل أنابيب تدفق زجاجة تحتوي على محلول مضاد الضغط على جهاز التبريد الحرارية إدخال الأنبوب. ربط OUTPالتحرير أنابيب للجهاز التبريد الحرارية إلى نهاية الإدخال من سترة التبريد الخارجي ونهاية الإخراج إلى 3B خزان الشكل.
  15. وضع قطعة واحدة من الحبل الشوكي في وقت في غرفة تسجيل وفصل بلطف الحبل الشوكي الحفاظ عليه على طول ساترة في جميع الأوقات باستخدام ملقط تفلون المغلفة حتى محاور هي معزولة 2E الشكل والشكل 2F.
  16. جعل درجة حرارة المحلول تسجيل إلى 10 ° C بتمرير الضغط (غاز النيتروجين يتم الضغط في زجاجة) حل التجمد (بالنزوح)، عن طريق جهاز التبريد الحرارية، من خلال سترة التبريد الخارجية لل3B تسجيل غرفة الشكل.
  17. تسمح محاور لاسترداد لمدة 1 ساعة آخر التفكك في 10 درجة مئوية.

الشكل 2
(أ) إزالة العمود الظهري. السهم يشير إلى اتجاه تشريح الأنسجة. يتم وضع علامة القرون الظهرية من الأبجدية D (لون الخط الأحمر)، في حين أن القرون البطنية بواسطة الأبجدية V (لون الخط الأحمر). (ب) إزالة عمود ظهري في الجزء المركزي من الحبل الشوكي تعريض محاور الشبكي (خطوط خضراء ). وتتميز قرون البطنية، التي لا تزال على حالها بعد عملية التقطيع، من خلال الأبجدية V (لون الخط الأحمر). (ج) العلاج 45 دقيقة مع البروتيني الانزيمات وكولاجيناز كوكتيل (1 ملغ / مل). (د) قطع مساحات الجانبية من الحبل الشوكي. مشيرا إلى موقف والتوجيه ومدى خفض الجانبي. (ه) التفكك الميكانيكية من الحبل الشوكي. السهام تشير موقف ملقط واتجاه القوة خلال فصل التفكك. (و) Representatiلقد مثال فصل إعداد محوار الشبكي. الأسهم الخضراء علامة مناطق محاور الشبكي فصلها تماما من دون أي عمليات بعد المشبكي.

الرقم 3
الرقم 3. تخطيطي لغرفة تسجيل للتجارب الكهربية. الأبعاد المقدمة هي في بوصة. مستطيل أحمر هو مبين في الرسم البياني basepiece (أ) يشير المواقع من ساترة في الأخدود ساترة في basepiece. المنطقة بين المستطيل الأحمر والأزرق، كما هو موضح في الرسم البياني basepiece (أ) حيث يتم تطبيق الشحوم فراغ عالية. (ب) يبين غرفة تسجيل تجميعها.

4. وصفها وتحديد محطات قبل المشبكي مع وزير الخارجية 1-43

  1. تسمية محطات قبل المشبكي، من خلال دمج FM 1-43 في الخامسesicles خلال متشابك EXO-K خلال الإلتقام عالية + الاستقطاب. يروي إعداد مع 5 ميكرومتر FM 1-43 (في 5 مل من محلول رينغر تحتوي على 30 ملي بوكل).
  2. يروي إعداد مع 1 ملغ / مل Advasep-7 (في 5 مل من محلول رينغر) لإزالة الصبغة الزائدة FM) 18.
  3. يروي التحضير مع حل رينغر لمدة 15 دقيقة لتبييض أي صبغة remant وAdvasep.
  4. صورة مع 100 X الغمر النفط عدسة (NA 1.25) على مجهر مضان مقلوب، جنبا إلى جنب مع كاميرا CCD الرقمية والحصول على الصور برنامج Micromanager، باستخدام بروتوكولات التصوير مضان القياسية.
  5. تحديد fluorescently المسمى لاستهداف محطات قبل المشبكي لتسجيل 4C الشكل والشكل 4D.

5. المناعية معزولة الشبكي من محاور عصبية

  1. ملء طبق أقحم (بروتوكول القسم 2.10.) ثنائي التكافؤ مع أيون (الكالسيوم والمغنيسيوم 2+ 2+) مجاناحل رينغر.
  2. تلفيق الماصات التصحيح في P-87 مجتذب micropipette. ضع كمية صغيرة من الغراء خياطة في واحدة من نهاية أقحم بولي يسين باستخدام ماصة التصحيح (1.5 ملم الزجاج القطر الخارجي) وشفط (باستخدام أنابيب السيليكون 0.89 مم القطر الداخلي مع طرف micropipette تعلق على نهاية الشفط).
  3. تنفيذ dissociations باستخدام نفس الإجراء كما هو مذكور في القسم بروتوكول 3 الشكل 2. ضع واحدة من نهاية الحبل الشوكي على الغراء خياطة واضغط بلطف مع ملقط على الالتزام بقوة إلى السطح. وضع آخر قطرة من خياطة الغراء في الطرف الآخر من أقحم وتمتد برفق الحبل الشوكي حتى يتم فصلها محاور والتمسك نهاية الحبل الشوكي المجانية عن طريق سحبه برفق فوق الغراء خياطة. إصلاح في مكانها بواسطة لطيف الضغط إلى أسفل مع ملقط.
  4. تبادل ثنائي التكافؤ تحرير حل رينغر مع حل قارع الأجراس منتظم من خلال نضح.
  5. تسمح محاور لاستعادة لمدة 20 دقيقة آخر dissocينتقم في 10 درجة مئوية.
  6. إصلاح محاور فصل في بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) {أعد العازلة الفوسفات المالحة (PBS، (ملم) 137 كلوريد الصوديوم، بوكل 2.7، نا 2 هبو 4 10، KH 2 PO 4 1.8، ودرجة الحموضة 7.4)} لمدة 20 دقيقة. تصفية PFA حل قبل استخدامها عن طريق تمرير من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرومتر.
  7. تغسل PFA بواسطة perfusing 0.1 M جليكاين (في PBS) لمدة 10 دقيقة.
  8. في احتضان 0.1٪ تريتون-X (في PBS) لمدة 10 دقيقة.
  9. يغسل من قبل perfusing برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  10. منع مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم (في برنامج تلفزيوني) لمدة 6 ساعة عند 4 درجات مئوية.
  11. إضافة إلى الأجسام المضادة الأولية في VGCC الفائدة (1: 200 التخفيف في برنامج تلفزيوني)، واحتضان لمدة 20 ساعة في 4 درجات مئوية.
  12. يغسل من قبل perfusing برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  13. منع مع 5٪ الحليب الخالي من الدسم (في PBS) لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  14. إضافة في الضد الثانوية (1: 400 التخفيف في برنامج تلفزيوني)، واحتضان في الظلام لمدة 2 ساعة في 4 درجات مئوية.
  15. يغسل من قبل perfusing مع برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  16. منع مع 1٪ مصل بقري البودقيقة (في PBS) لمدة 20 دقيقة.
  17. إضافة في اليكسا فلور 488 phalloidin (5 وحدات / ميكرولتر تركيز عمل، الأسهم أعدت في الميثانول 200 وحدة / مل).
  18. يغسل من قبل perfusing مع برنامج تلفزيوني لمدة 20 دقيقة.
  19. الصورة باستخدام 100X عدسة غمر المياه على المجهر متحد البؤر.

6. تسجيل الكهربية

  1. تلفيق الماصات الزجاج التصحيح ألومينوسيليكات (المقاومة ماصة 2-5 MΩ) في P-87 مجتذب micropipette. تصميم ماصة التصحيح بحيث يشمل كامل ماصة قطر المحطة قبل المشبكي.
  2. PDMS الماصات معطف التصحيح عن طريق غمس ماصة التصحيح تحت ضغط 50-60 رطل في PDMS 23 (إرفاق أنابيب السيليكون، 0.89 مم القطر الداخلي، متصلة اسطوانة غاز النيتروجين، إلى نهاية الجزء الخلفي من ماصة التصحيح) وتجفيف باستخدام الحرارة بندقية. بالتناوب، يدويا معطف ماصة مع PDMS، وتطبيق طلاء أقرب إلى الطرف ممكن، تحت المجهر المركب.
  3. النار ماصات التصحيح البولندية باستخدام ميكرoforge (خيوط البلاتين عرف بني تركيبها مرحلة المجهر المركب).
  4. تحديد محاور معزولة مما يدل محطات قبل المشبكي وصفت من قبل مضان المجهري.
  5. ملء حل تسجيل (المصممة لعزل التيارات الكالسيوم 2+ و 10 مم CaCl 2 أو 90 ملي بووتون 2 كما الناقل تهمة، مخزنة HEPES الرقم الهيدروجيني 7.6، الميلي أسمول الأسمولية 270) في ماصة التصحيح باستخدام حقنة.
  6. إدراج ماصة التصحيح في حامل ماصة وموقف فوق حمام باستخدام مناور MP225 الميكانيكيه. خفض بلطف ماصة التصحيح في الحمام وموقف ضد مواجهة محطة قبل المشبكي حددت fluorescently.
  7. دفع ماصة التصحيح ببطء حتى يتم الاتصال مع الغشاء. في هذه المرحلة، وتحقيق ختم gigaohm بواسطة طيف الامتصاص الفم من خلال أنبوب تعلق على حامل ماصة.
  8. لتحقيق منخفضة للغاية مستويات الضوضاء الخلفية المطلوبة لتسجيل قناة واحدة الكالسيوم 2+ التيارات، واستخدام وxopatch 200B مع headstage تبريد للتسجيلات. عينة البيانات في 20-50 كيلو هرتز ومرشح باستخدام 5 كيلو هرتز بسل التصفية. تنفيذ جمع البيانات باستخدام مسجل المحاور X.
  9. استخدام بروتوكول خطوة القياسية، في الزيادات من 10 بالسيارات والتحفيز. إدراج ما قبل النبض في البروتوكول، التي سبقت البروتوكول الخطوة، لضمان تفعيل القصوى من قنوات الكالسيوم 2+. إدراج 10 بالسيارات خطوة تسرب في بروتوكول خطوة لمرحلة ما بعد تحليل الطرح التيارات تسرب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

هذه العوائد بروتوكول التفكك صحية وظيفية محاور الشبكي معزولة خالية من التوقعات بعد المشبكي الشكل 2F، ولكنها مع ذلك تحتفظ محطات قبل المشبكي وظيفية قادرة على أثار حويصلة متشابك إكسو والإلتقام الشكل 4C و 4D الشكل. أجزاء من المناطق المعزولة من محاور الشبكي يمكن التعرف بوضوح تحت المجهر الضوئي أن يكون واضحا من أي عمليات الخلايا العصبية الأخرى مما يتيح الوصول غير المقيد إلى الشبكي غشاء المحوار الشكل 2F. محاور تحتفظ السلامة الهيكلية بعد التفكك. تم مصححة محاور المعزولة في تكوين خلية كاملة ومليئة اليكسا فلور 488 هيدرازيد. وقد لوحظ أن وزعت بشكل موحد ضمن محور عصبي وجود تسرب الصبغة صبغة من 4A محوار الشكل.

/ftp_upload/51925/51925fig4highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 4. التسجيلات التمثيلية من محور عصبي الشبكي معزولة. (أ) محور عصبي الشبكي معزولة مليئة اليكسا فلور 488 هيدرازيد مع ماصة التصحيح في تكوين خلية كاملة. يشار إلى موقف ماصة مع السهم الأبيض. (ب) ط. إمكانات العمل تمثيلية أطلقت في محور عصبي الشبكي معزولة. ثانيا. إمكانات العمل تمثيلية أطلقت في محور عصبي الشبكي في النخاع الشوكي سليما. السهم الأسود يشير إلى نقطة زمنية من التحفيز. (ج) و (د) صورتان من محور عصبي الشبكي معزولة تظهر العلامات منقط محطات قبل المشبكي مع وزير الخارجية 1-43 واستهداف محطة قبل المشبكي فردية مع ماصة التصحيح للتسجيل التصحيح الخلية المرفقة. الأسهم الخضراء علامة محطات قبل المشبكي فردية بينما يمثل السهم الأبيض ماصة التصحيح. (ه) الميت معزولة محوار الشبكي يظهر indiscrالتأسيس iminate من FM 1-43 في جميع أنحاء محور عصبي. 4F. مثال تمثيلي يظهر تسجيل الخلية المرفقة من الكالسيوم 2+ التيارات (10 ملي [كا 2+] الخارجية في الحل تسجيل في ماصة التصحيح) من غشاء قبل المشبكي الإفراج وجه يدل على افتتاح عدة قنوات الكالسيوم 2+. خط الصلبة علامة يشير 0 إلى دولة مغلقة من القناة، بينما تشير الخطوط المتقطعة القمم جاوس لفتحات القناة.

محاور فصلها تماما تحتفظ الخواص الكهربائية. يستريح غشاء المحتملة (RMP) يمكن قياسها بواسطة التخوزق محور عصبي نأت مع مسرى مكروي أو عن طريق الترقيع محور عصبي في تكوين خلية كاملة في وضع المشبك الحالي. وتسجل خطط إدارة غازات التبريد مماثلة في كلتا الطريقتين، بمتوسط ​​قدره -57.94 ± 1.63 بالسيارات (ن = 17 محاور عصبية). بالإضافة إلى ذلك، يمكن فصلها محاور حفز لاطلاق النار إمكانات العمل الشكل 4B، مع مسار الشكل والوقت من إمكانات العمل يجري مقارنةلواحدة أطلقت في محور عصبي الشبكي في النخاع الشوكي سليما.

الانصهار الحويصلة وإعادة التدوير تستمر في محاور فصلها. يمكن أن توصف مجموعات إعادة التدوير الحويصلة مع الصبغة styryl FM 1-43 خلال البوتاسيوم عالية (30 ملي بوكل) التحفيز 19. على إزالة الصبغة، ووضع العلامات منقط واضح في محطات قبل المشبكي يمكن ملاحظة الشكل والشكل 4C 4D، مع توزيع مماثل لمحاور الشبكي في النخاع الشوكي سليمة 13. يوفر FM 1-43 تلطيخ تمييزا واضحا بين محاور صحية وغير صحية وغير صحية تظهر محاور العشوائي دخول FM صبغ جميع أنحاء 4E محوار الشكل. القدرة على تحديد واضح محطات قبل المشبكي فردية تسمح لنا استهدافهم مع ماصة التصحيح لتسجيل 4C الشكل والشكل 4D. استخدام هذه القدرة، لقد سجلنا الكالسيوم 2+ التيارات مباشرة من الإفراج وجه مembrane من احد محطات قبل المشبكي الشكل 4F.

كما يقدم إعداد محوار الشبكي معزولة تماما مزايا واضحة بالمقارنة مع النخاع الشوكي سليمة لالمناعية محطات قبل المشبكي واحدة. عدم وجود أي خلفية تألق ذاتي وغياب تلطيخ على الهياكل بعد المشبكي أو الدبقية يسمح لتحديد واضح للوضع العلامات الأجسام المضادة في محطات قبل المشبكي تحديد (الشكل 5B، ط). إلى جانب وجود علامة قبل المشبكي مثل اليكسا-488 phalloidin مترافق (الشكل 5A، ب) و (الشكل 5B والثاني)، التي تصف الأكتين قبل المشبكي 20، توطين وضع العلامات المناعى للمحطات قبل المشبكي يمكن بوضوح (الشكل 5A، والثالث). وقد استخدم هذا النهج بالتزامن مع المجهري متحد البؤر لتنفيذ التوصيف المناعى من الأنواع الفرعية المختلفة تظهر VGCC رتوطين محددة ريث قبل المشبكي محطات الشكل 5A.

الرقم 5
الشكل 5. المناعية من محور عصبي الشبكي معزولة. (أ) توصيف المناعى من نوع R-(CaV2.3) قناة الكالسيوم في محطات قبل المشبكي فردية. ط. تم استخدام الأجسام المضادة الأولية بولكلونل لتسمية حاتمة في حلقة داخل الخلايا بين المجالات الثاني والثالث من قنوات الكالسيوم من نوع R (المضيف - أرنب). كان الضد الثانوية اليكسا فلور 633 هيدرازيد الماعز مترافق المضادة للأرنب مفتش. ثانيا. محطات قبل المشبكي التي حددها اليكسا فلور 488 التوسيم phalloidin من الأكتين قبل المشبكي. ثالثا. Colocalization بين R-نوع العلامات الأجسام المضادة (أحمر) واليكسا-488 phalloidin (الأخضر) هو مبين في تراكب المدمجة. (ب) ط. حضن مسبق المضادة R-نوع قناة الكالسيوم مع الأجسام المضادةالسيطرة مستضد لا تسفر عن أي وسم معين من قنوات الكالسيوم. ثانيا. اليكسا فلور 488 التوسيم phalloidin محطات قبل المشبكي لنفس محور عصبي تظهر العلامات منقط منفصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

بروتوكول التفكك الكبير الذي لدينا هو العائد محاور الشبكي معزولة خالية من التوقعات بعد المشبكي الشكل 2F، ولكن مع ذلك الذي يحتفظ ظيفية محطات قبل المشبكي 4C الشكل والشكل 4D. غياب العمليات بعد المشبكي معارضة المحطة قبل المشبكي يسمح تسجيل الوصول المباشر إلى غشاء قبل المشبكي الإفراج وجه في محطات قبل المشبكي واحدة، في السابق غير ممكن في نقاط الاشتباك العصبي المركزي وحققت بنجاح في كأسي من نوع محطات قبل المشبكي اثنين فقط؛ الكأس من نوع المشبك من فرخ العقدة الهدبية 7-10 والفئران الكؤوس 11،12. يمكن تحديد محطات قبل المشبكي الفردية، والتي على مستوى المجهرية الإلكترون وقد ثبت أن تقديم بسيطة والمناطق النشطة واحدة 21، من خلال مجموعات حويصلة إعادة التدوير وضع العلامات مع وزير الخارجية 1-43 واستهداف للتسجيل 4C الشكل والشكل 4D. كاليفورنيا الشكل 4F. تسجيل كا 2+ التيارات مباشرة من غشاء الإفراج وجه محطات قبل المشبكي فردية مهم لأن هذا هو الأول من نوعه في تسجيل نقاط الاشتباك العصبي المركزي. وشدد على أهمية الفسيولوجية للإعداد من حقيقة أن محاور تحتفظ ظيفة بعد التفكك، مما يسمح للتسجيل من محطات قبل المشبكي مع خصائص مشابهة لمحطات في محاور الشبكي في النخاع الشوكي سليما. بالإضافة إلى ذلك، اتسمت الكالسيوم قبل المشبكي 2+ العابرين في محاور الشبكي في الجلكى الحبل الشوكي سليمة من خلال التصوير الكالسيوم 13 توفير مرجع للتحقق من صحة النتائج التي تم الحصول عليها من محاور فصلها تماما.

مفتاح الحصول على محاور الشبكي المعزولة مع محطات قبل المشبكي وظيفية يكمن في سلسلة من الناقدآل خطوات متعاقبة. الأنسجة التي تعوق التفكك الحاد من محاور عملاقة تقع أساسا في المنطقة ظهراني الإنسي من الحبل الشوكي الشكل 1A كان لا بد من إزالتها أولا في تقطيع اللحم والأنسجة تهتز الشكل 2A. هذا يجعل من الاسهل لفصل ميكانيكيا الحبل الشوكي باستخدام أقل قوة ممكنة. تشريح العمود الظهري يتطلب الاستئصال الكامل للprimitiva الظهرية السحاءة لأن أي المتبقية primitiva الظهرية السحاءة شأنه أن يعرقل عمل القطع النصل. نجد أن ترك primitiva السحاءة بطني على الحبل الشوكي عند تشريح يساعد في الحفاظ على شكل من الحبل الشوكي ويساعد في أفضل تشريح. استمرار التوتر في الحبل الشوكي أثناء عملية التقطيع يمنع أي حركة جانبية أو تؤثر في الأنسجة تحت شفرة من شأنها أن تلحق الضرر محاور عصبية. 1 سم طويلة قطع الحبل الشوكي يوفر طول جيدة تشريح الأنسجة ويمكن أن تمتد وتمركزها الحفاظ على التوتر ث لبرقين تشريح. وثمة عامل آخر بالغ الأهمية لمراقبة هو عمق شريحة. ضحلة جدا شريحة يمنع فصل جيد من الحبل الشوكي بينما عميقة جدا الأضرار شريحة محاور الشبكي. وعمق شريحة الجيد هو العمود الظهري حيث تتم إزالة ترك اضح العمود الشبكي بطني التالفة. عمق شريحة لابد من قياسه أثناء عملية التقطيع نظرا هناك اختلاف في سمك الحبل الشوكي بين الحيوانات. من الأفضل القيام إزالة العمود الظهري في الجزء الأوسط من العمود الفقري الحبل قطعة الشكل 2B لأنها تسمح للمنقاري والذيلية unsliced ​​ينتهي لتكون بمثابة يعالج لفهم الأنسجة أثناء عملية التفكك الشكل 2E.

بعد إزالة العمود الظهري، علاج القطع في الحبل الشوكي شرائح مع خليط من كولاجيناز (كولاجيناز IA من نوع كلوستريديوم الحالة للنسج) والبروتيني (البروتياز النوع الرابع عشر من المتسلسلة غريس) الأنزيمات (1 مز / مل في حل رينغر) يساعد على هضم الأنسجة الضامة ويسهل التفكك ألطف. والهضم 30-45 دقيقة في RT مثالي للتفارق. تفارق الأنزيمية كاملة من الحبل الشوكي الجلكى وقد تم تنفيذ من قبل مع العلاجات متتابعة من كولاجيناز (2 ملغ / مل، 30 دقيقة) والبروتيني (2 ملغ / مل، 45 دقيقة) لعزل الخلايا العصبية في العمود الفقري 17. لم علاجات متتابعة مقابل العلاج مع مزيج من البروتيني وكولاجيناز لم تسفر عن نتائج أفضل في فصل محاور الشبكي. نحن جربت أيضا مع تركيزات مختلفة من الانزيمات التفكك. أعلى من 2 مغ / مل أو الهضم مرات أطول من 45 دقيقة أسفرت تركيزات الانزيم في الحبل الشوكي يفقد اتساقه وdissociations الفقيرة. تركيزات الانزيم أعلى وفترات العلاج لفترات طويلة قد تساعد في التفكك الكامل للحبل الشوكي عندما يطلب من العوائد من الخلايا العصبية الصغيرة. محاور الشبكي، في المقابل، أن يكون لها بمد فيما شكل إيجاركان cture والعلاجات أكبر من 45 دقيقة إلى نتائج عكسية. الإبقاء على بعض التوتر في الحبل الشوكي بمساعدة dissociations أفضل.

الخطوة الهامة التالية هي قطع مساحات الجانبية للقطع الحبل الشوكي المعالجة انزيم في منتصف المنطقة شرائح لعزل القوة التفكك النهائي للمنطقة تشمل محاور الشبكي. يجب على تخفيضات تمتد من الحافة الجانبية من المادة الرمادية القرن البطني إلى عمود وسطي ventro المركزي من المحاور الشبكي مما يجعلهم غير التالفة الشكل 2D. قطع مساحات الجانبية يوفر نقطة اتصال والذي اضطر فصل الحبل الشوكي سوف تحدث أثناء التفكك الميكانيكية ويسهل فصل أكثر سلاسة من الأنسجة. مطلوب التوتر المتواصل في الحبل الشوكي أثناء عملية التقطيع، ويمكن أن يتحقق عن طريق التمدد وتعلق نهايات الذيلية منقاري وقطعة من الحبل الشوكي. هذا يمنع تشوه النسيج تحت شفرة مشرطويترتب على ذلك ضرر للمحاور.

الخطوة النهائية في التفكك هو تطبيق التوتر الميكانيكية وتمتد بلطف الأنسجة على طول-rostro الذيلية محور الشكل 2E باستخدام ملقط لقبضة الأنسجة. يتم تنفيذ هذه الخطوة على بولي يسين coverslips المغلفة للسماح للالتصاق من محاور فصل لتسجيل لاحقة. من أجل تحقيق قدر أكبر من التصاق للمحاور الشبكي طويلة طويلة، وقد استخدمنا الوزن الجزيئي عالية (> 300،000) بولي-D-يسين هيدروبروميد، الذي يوفر أكبر عدد من النقاط المرفق، إلى معطف لل coverslips وإدراجات طبق بتري. يوفر السطح المطلي بولي يسين التصاق كاف للالحبل الشوكي ينتهي ومحاور الشبكي معزولة تماما. يرجى ملء تفلون المغلفة ملقط لقبضة الحبل الشوكي لأنها تتمسك بحزم ملقط الفولاذ المقاوم للصدأ العادية إعاقة dissociations. يجب أن تمتد الأنسجة ببطء وسحب بلطف محاور للخروج من سالحبل إينال. أفضل طريقة للحصول على محاور عصبية ليستقر هو الحفاظ على الحبل الشوكي ينتهي على طول ساترة الزجاج في جميع الأوقات أثناء عملية التفكك من خلال الحفاظ على الضغط النزولي على الحبل الشوكي منقاري والذيلية تنتهي مع ملقط.

من الأفضل تصنيف محاور معزولة جزئيا لأن بعض جزء من محور عصبي لا يزال داخل بأقل احدة من نهاية نهاية الحبل الشوكي اعتمادا على مدى التفكك. يمكن القيام بها العزلة فصل ميكانيكيا طرفي الحبل الشوكي حتى محاور منفصلة تماما عن واحدة من نهاية الحبل الشوكي. في هذه الحالة، جزء واحد من محور عصبي لا يزال داخل نهاية الحبل الشوكي التي يتضح بينما يتم عزل الجزء المتبقي من الحبل الشوكي الداخلية. نهاية مفتوحة النهائية للمحاور الأختام من قبل عملية إعادة إغلاق غشاء اعتمادا على صحة محور عصبي. ويمكن أيضا أن يتم من العزلة بحيث تظهر محاور الخروج من الحبل الشوكي، بحزب التحرير الذيلية ونهايات منقاري من الحبل الشوكي البقاء على اتصال من خلال محاور عصبية الشبكي معزولة الشكل 2E. عند هذه النقطة، والإفراج عن الضغط بلطف يسمح للمحاور تحت التوتر للاسترخاء وحلقة من الغلة المناطق المعزولة من المحاور تخلو من التوقعات بعد المشبكي. كلا تقنيات التفكك تسفر محاور عصبية وظيفية. درجة الحرارة الفسيولوجية للالجلكى هي 10 درجة مئوية، وبالتالي يسمح للإعداد لاسترداد في 10 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح محاور للتعافي من التفكك الحاد. عن التسجيلات الكهربية، تم تنفيذ التفكك الخروج على ساترة المغلفة بولي يسين إدراجها في الشكل غرفة مخصصة 3. وقد تم الحفاظ على الجلكى النخاع الشوكي عموما في 10 ± 2 درجة مئوية بحلول perfusing حل رينغر، precooled إلى 10 ° C بعبورها جهاز التبريد الحرارية. بشكل استثنائي مطلوب انخفاض الضوضاء في الخلفية لحل قناة واحدة الكالسيوم

ويستخدم عالية K + (30 ملي بوكل) ليزيل الاستقطاب محاور عصبية (القسم 4.1)، بحيث يتم تضمينها في صبغ FMحويصلات متشابك خلال EXO-الإلتقام. فمن الصعب الاحتفاظ ادراج مسرى مكروي في محاور معزولة لفترات طويلة كما أدنى الانجراف في موقف محور عصبي يسبب القطب في الانحسار من محور عصبي. هذا يجعل من الصعب تحفيز محاور لفترة طويلة باستخدام مسرى مكروي. قطر محور عصبي كبير (20-50 ميكرون) يجعل من الصعب تحفيز استخدام التحفيز الكهربائي التنغستن. وبالتالي تم استخدام عالية K + ليزيل الاستقطاب محاور عصبية. محطات قبل المشبكي في محاور الشبكي لديها قطرها 1-2 ميكرون.

يتم ترجمة كاليفورنيا 2+ التيارات إلى غشاء الإفراج وجه في محطات قبل المشبكي ولذلك فمن الأهمية بمكان أن يستهدف بدقة المحطة قبل المشبكي. ومن هنا، وهو شرط أساسي لتحقيق هذه التسجيلات هو أن تكون قادرة على التعامل مع حركة التصحيح في موقف ماصة ميكرون الزيادات. كا تم demonstrat 2+ التيارات في الإفراج قبل المشبكي الأغشية وجهإد في نقاط الاشتباك العصبي كأسي إلى أن تكون صغيرة للغاية في السعة، وأقل من 0.5 باسكال. تسجيلات قناة واحدة من الكالسيوم 2+ التيارات بالتالي تتطلب مستويات منخفضة للغاية من الضوضاء في الخلفية. وقد تحقق الضوضاء الحرارية منخفضة مع مكبر للصوت Axopatch 200B وheadstage تبرد. وعلاوة على ذلك، تحتاج مصادر تلوث الضوضاء الكشف عن هويته منهجي والقضاء عليها. ملفقة ماصات التصحيح من الزجاج ألومينوسيليكات لضمان انخفاض مستوى الضجيج منذ الزجاج لديه الشوائب منخفضة للغاية ومقاومة عالية. تم إنشاء ماصات بحيث يكون قطرها ماصة كان أكبر من قطر المحطة قبل المشبكي وبالتالي يشمل تماما المحطة قبل المشبكي، أبعاد التي يمكن ملاحظتها بوضوح من خلال وضع العلامات FM 1-43. كفل هذا التسجيل من كامل غشاء الإفراج الوجه. تم تخفيض الضوضاء بالسعة بواسطة طلاء ماصة مع PDMS أقرب إلى الطرف ممكن. الأختام gigaohm في الأغشية النهائية قبل المشبكي ليست مستقرة لفي طويلةiods والتسجيلات تدوم عادة مدة أقصاها 2 دقيقة. هذا يجعل التسجيلات صعبة للغاية للحصول منذ نسبة النجاح منخفضة يتطلب عددا كبيرا من محاولات للحصول على تسجيلات ناجحة. تسجيل الحلول يجب أن تكون مصممة بحيث يعرف كل التيارات الأخرى في الغشاء قبل المشبكي مثل محطة الجهد بوابات نا + و K + قنوات الكالسيوم ويتم حظر 2+ -activated K + القنوات، مما يسمح للتسجيل من الكالسيوم 2+ التيارات.

هناك بعض القيود على استخدام سطح بولي يسين لاصقة مع هذا المستحضر. واحد هو عدم القدرة على نقل الموقع الجغرافي للغرفة التي تحتوي على إعداد لأن أي اهتزازات عطلت التحضير. وقد كشف القيد آخر من سطح لاصق خلال التجارب المناعية، مثل قطع الحبل الشوكي نهاية منقاري والذيلية تفقد التصاق عندما حضنت في 4٪ امتصاص العرق. حاولنا بديل الص لاصقةمثل الرنين الخلوي تاك واجه قضايا مماثلة. من أجل حل هذه المشاكل، وكنا خياطة السائل الغراء لتركيب مقابض الحبل الشوكي. وقد نوقشت تفاصيل بشأن استخدام الغراء خياطة في مقال إن الرب السابقة التي تشن وفيذرستون 22. مجموعات الغراء بمعدل أبطأ في الحلول دون أيونات ثنائي التكافؤ ونحن قد استفادت من تلك الممتلكات ونفذوا dissociations في حل رينغر دون 2+ الكالسيوم والمغنيسيوم 2+. قدمت لنا مع هذا وقتا إضافيا للتلاعب من الأنسجة أثناء عملية التفكك. اعتمدنا نهجا مماثلا لتشن وفيذرستون 22 باستخدام ماصات التصحيح والفم الشفط من خلال أنابيب متصلة ماصة التصحيح لتطبيق الغراء على منطقة مستهدفة محددة على سطح التفكك قبل تنفيذ التفكك (بروتوكول القسم 5.2). أجريت في dissociations كما هو موضح سابقا، مع الفارق الوحيد هو أن العمود الفقري جتم اضافته نهايات أورد أثناء عملية التفكك عن طريق سحب بلطف نهاية مقبض على الغراء وضعت سابقا (بروتوكول القسم 5.3). وسمح مرة واحدة تم الانتهاء من التفكك، أيون ثنائي التكافؤ مجانا تم تبادل حل رينغر لحل رينغر تحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم الأيونات 2+ 2+ بواسطة نضح وإعداد لاسترداد في 10 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة على لوحة التبريد الحرارية قبل الشروع في الخطوات اللاحقة المناعية.

المعنى الضمني الرئيسي من هذه التقنية هو الفهم الدقيق للكا 2+ شرط لإطلاق ناقل عصبي، والتي لم يتم حلها تماما على الرغم من عقود من البحث. [كا 2+] قد أنشئ زيادة عابرة في قبل المشبكي بأنها حاسمة لاثار الافراج عنه في جميع نقاط الاشتباك العصبي. ومع ذلك، لا تزال تفتقر إلى الإجماع على عدد من قنوات الكالسيوم 2+ التي تساهم في كاليفورنيا 2+ نطاق النابضة releaحد ذاتها. ان قياس وقت واحد من التيارات الكالسيوم 2+ وقياسات السعة في الغشاء الإفراج وجه محطات قبل المشبكي فردية تسفر عن إجابة على هذا السؤال لا لبس فيها. وعلاوة على ذلك، فإنه تمكن من توضيح العلاقة بين توقيت الكالسيوم قبل المشبكي 2+ الدخول والحويصلة الانصهار، مما يتيح مقياسا دقيقا تأخير متشابك. إمكانية الوصول غير المقيد إلى غشاء الإفراج وجه في محطات قبل المشبكي فردية يوفر القدرة على تطبيق عدد من المناهج التجريبية المختلفة لدراسة مختلف مكونات عملية الإفراج العصبي. أمثلة على هذه النهج وتشمل التصوير حويصلة واحدة باستخدام نقاط الكم لدراسة متشابك الحويصلة الانصهار. الأحداث الانصهار الحويصلة ويمكن أيضا أن توصف مباشرة في محطات قبل المشبكي عن طريق قياس التغيرات السعة الغشاء التي تكمن وراء الأحداث الانصهار الحويصلة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm Syringe filter EMD Millipore SLGV004SL
22 x 60 mm Coverslips Fisherbrand 12545J
Advasep-7 Cydex Pharmaceuticals ADV7
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379
Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody Invitrogen/Life Technologies A21070
Antifreeze Prestone
Boric acid Sigma-Aldrich B7660
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A7906
Bright field light source Dolan-Jenner Fiberlite 180
Calcium chloride Sigma Aldrich C4901
Collagenase Type IA from Cloristridium Histolyticum Sigma-Aldrich C9891
Cover slip Fisher-Scientific 12-545-J
Dextrose Sigma-Aldrich D9559
Digital CCD Camera Hamamatsu C8484-03G01
Dissection fine forceps Fine Science Tools 91150-20
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-20
Dissection microscope Leica Biosystems Leica MZ 12
Dissection scissors Fine Science Tools 15025-10
Dissection scissors fine Fine Science Tools 91500-09
Dissection scissors ultra fine Fine Science Tools 15000-08
FM 1-43 Invitrogen/Life Technologies T3163
Glycine Sigma-Aldrich G7126
HEPES Sigma-Aldrich H7523
High vacuum grease Dow-Corning
Hydrochloric acid Fisherbrand SA-56-500
Immersion oil Fisher-Scientific M2000
Industrial grade nitrogen gas tank Praxair UN1066
Insect pins Fine Science Tools 26002-10
Liquid suture glue Braun Veterinary Cair Division 8V0305 The suture glue we used in our experiments was provided to us by another lab. It is no longer manufactured. We have sourced a Histoacryl Suture Glue for future use from Aesculap (Ts1050071FP)
Magnesium chloride Sigma-Aldrich M2670
Methanol Sigma-Aldrich 154903
Non-fat dry milk Cell Signaling Technology 9999S
P-87 Micropipette puller Sutter Instruments
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Perfusion pump Cole-Palmer Masterflex C/L
Petri dish 100 x 15 mm Fisher-Scientific 875712
Petri dish 35 x 10 mm Fisher-scientific 875712
Poly-D-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P1024 MW > 300,000
Potassium chloride Sigma-Aldrich P9333
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5379
Primary antibodies R-type calcium channel Alomone Labs ACC-006
Protease Type XIV from Streptomyces Griseus Sigma-Aldrich P5147
Scalpel blades World Precision Instruments  500240
Schot Duran Pressure Bottle Fisher-Scientific 09-841-006
Silicone tubing for glue application Cole-Palmer 07625-26
Slicing base plate Leica Biosystems 14046327404
Slicing chamber Leica Biosystems 14046230132
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium hydroxide S8045
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763
Sodium tetraborate Sigma-Aldrich B3545
Sylgard 160 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  SYLGARD® 160 To prepare, mix elastomer A and elastomer B 10:1 by weight
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning SYLGARD® 184  To prepare, mix elastomer and curing agent 10:1 by weight
Teflon coated forceps Fine Science Tools 11626-11
Tricaine methanesulphonate Sigma-Aldrich A5040
Vibratome blades World Precision Instruments  BLADES
Xenon lamp Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
  2. Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 170-172 (1996).
  3. Augustine, G. J., Adler, E. M., Charlton, M. P. The calcium signal for transmitter secretion from presynaptic nerve terminals. Annals of the New York Academy of Sciences. 635, 365-381 (1991).
  4. Zucker, R. S. Calcium and transmitter release. Journal of Physiology Paris. 87 (1), 25-36 (1993).
  5. Delaney, K. R., Shahrezaei, V. Uncaging Calcium in Neurons. Cold Spring Harbor protocols. (12), (2013).
  6. Paradiso, K., Wu, W., Wu, L. G. Methods for patch clamp capacitance recordings from the calyx. Journal of Visualized Experiments. (6), 244 (2007).
  7. Stanley, E. F. The calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion as a model of fast cholinergic transmission. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 70, S73-S77 (1992).
  8. Church, P. J., Stanley, E. F. Single L type calcium channel conductance with physiological levels of calcium in chick ciliary ganglion neurons. The Journal of Physiology. 496 (Pt 1), 59-68 (1996).
  9. Stanley, E. F. Single calcium channels and acetylcholine release at a presynaptic nerve terminal. Neuron. 11 (6), 1007-1011 (1993).
  10. Weber, A. M., Wong, F. K., Tufford, A. R., Schlichter, L. C., Matveev, V., Stanley, E. F. N-type Ca(2+) channels carry the largest current implications for nanodomains and transmitter release. Nature Neuroscience. 13 (11), 1348-1350 (2010).
  11. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  12. Sheng, J., He, L., et al. Calcium channel number critically influences synaptic strength and plasticity at the active zone. Nature Neuroscience. 15 (7), 998-1006 (2012).
  13. Photowala, H., Freed, R., Alford, S. Location and function of vesicle clusters, active zones and Ca2+ channels in the lamprey presynaptic terminal. The Journal of Physiology. 569. 569 (Pt 1), 119-135 (2005).
  14. Rovainen, C. M. Synaptic interactions of reticulospinal neurons and nerve cells in the spinal cord of the sea lamprey. Journal of Comparative Neurology. 154 (2), 207-223 (1974).
  15. Takahashi, M., Freed, R., Blackmer, T., Alford, S. Calcium influx independent depression of transmitter release by 5 HT at lamprey spinal cord synapses. The Journal of Physiology. 532 (2), 323-336 (2001).
  16. Stanley, E. F., Goping, G. Characterization of a calcium current in a vertebrate cholinergic presynaptic nerve terminal. The Journal of Neuroscience. 11 (4), 985-993 (1991).
  17. El Manira, A., Bussières, N. Calcium channel subtypes in lamprey sensory and motor neurons. Journal of Neurophysiology. 78 (3), 1334-1340 (1997).
  18. Kay, A. R., Alfonso, A., et al. Imaging synaptic activity in intact brain and slices with FM1 43 in C elegans lamprey and rat. 24 (4), 809-817 (1999).
  19. Betz, W. J., Bewick, G. S. Optical analysis of synaptic vesicle recycling at the frog neuromuscular junction. Science. 255 (5041), 200-203 (1992).
  20. Bleckert, A., Photowala, H., Alford, S. Dual pools of actin at presynaptic terminals. Journal of Neurophysiology. 107 (12), 3479-3492 (2012).
  21. Gustafsson, J. S., Birinyi, A., Crum, J., Ellisman, M., Brodin, L., Shupliakov, O. Ultrastructural organization of lamprey reticulospinal synapses in three dimensions. The Journal of Comparative Neurology. 450 (2), 167-182 (2002).
  22. Broadie, K., Featherstone, D. E., Chen, K. Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), (2009).
  23. Rae, J. L., Levis, R. A. A method for exceptionally low noise single channel recordings. Pflügers Archiv European Journal of Physiology. 420 (5-6), 618-620 (1992).

Tags

علم الأعصاب، العدد 92، المشبك الشبكي، محاور الشبكي، المحطة قبل المشبكي، قبل المشبكي الكالسيوم، وقنوات الكالسيوم الجهد بوابات، حويصلة الانصهار، انتقال متشابك، وإطلاق سراح العصبي والنخاع الشوكي، الجلكى، حويصلات متشابك، التفكك الحاد
التفكك الحاد من الجلكى الشبكي المحاوير لتمكين تسجيل من الإصدار الوجه غشاء من محطات قبل المشبكي الوظيفية الفردية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ramachandran, S., Alford, S. Acute… More

Ramachandran, S., Alford, S. Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals. J. Vis. Exp. (92), e51925, doi:10.3791/51925 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter