Introduction
Transfeksjon av nukleinsyrer i cellene har et mangfoldig program i vitenskapelig forskning. Eksempler innbefatter (1) rapportørgener for å studere rollen til forskjellige genet elementer i gen-ekspresjon, (2) proteinet ekspresjonsplasmider for å overuttrykke proteinet av interesse, og (3) liten interfererende RNA for å nedregulere genekspresjon. Ved å manipulere ekspresjonsnivået av bestemte gener og måling av differensial effekten av slike manipuleringer, kan forskere utlede genfunksjoner i det valgte biologiske systemer. Ikke alle transfeksjonsmetoder gir samme transfeksjonseffektiviteter, og til og med den samme transfeksjon metoden ikke transfektere alle celletyper likt en. Derfor har forskjellige transfeksjonsmetoder blitt utviklet, slik som kalsiumfosfatmetoden, DEAE-dekstran, kationisk lipid transfeksjon, kationisk, ikke-lipid polymer transfeksjon, elektroporering, og nucleofection 2,3.
Transfeksjon til makrofager er spesielt vanskelig på grunn av det faktum at makrofager er profesjonelle fagocytter som er svært følsomme for fremmede materialer, inkludert bakterier som stammer (denaturert) DNA 4. Innføring av fremmed DNA aktiverer Toll-like receptor 9 (TLR9) banen som fører til produksjonen av cytokiner og nitrogenoksid 5,6. Disse aktiverte makrofager kan da være mindre mottakelig for behandling som forskerne har til hensikt å undersøke.
Vår lab transfects rutinemessig RAW264.7 makrofagcellelinjen med luciferase reporter gener, og vi har utviklet en protokoll som er robust nok til å ha luciferase signal betydelig høyere enn bakgrunnen, men også skånsom nok for makrofagene å holde seg på sitt hviletilstand. Atferd av de transfekterte cellene ble evaluert av en ildflue-luciferasereportergenet husing promoterregionen av IκBζ (pGL3- IκBζ). IκBζ uttrykk er oppregulert ved den bakterielle celleveggkomponent leppeopolyssacharide (LPS) 7,8, og nedregulert av anti-inflammatorisk cytokin interleukin-10 (IL-10) 8. Å gjøre rede for transfeksjon variasjon blant brønner, vi co-transfektere en kontroll plasmid som inneholder Renilla luciferasegenet (f.eks phRL-TK) for normaliserings formål. Protokollen er beskrevet er optimalisert etter testing av forskjellige parametre inkludert tidspunktet for transfeksjon, type transfeksjon reagenser, mengder av reagenser og transfeksjon av plasmid DNA, så vel som forholdet mellom transfeksjon reagens til plasmid DNA. De to transfeksjon reagenser som inngår i denne protokollen er (1) en lipid-basert reagens transfeksjon og (2) et protein / polyamin-baserte transfeksjon reagens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Plasmid DNA Purification
- Ekstraher plasmid-DNA ved hjelp av en maxiprep kit ifølge produsentens protokoll. Resuspender plasmid-DNA i 500 ul TE-buffer.
- Utføre en fenol: kloroform: isoamylalkohol-ekstraksjon og utfelling isopropanol for å fjerne gjenværende bakterielle forurensninger. Tilstedeværelsen av LPS forstyrrer transfeksjon 9.
- Legg 500 mL av fenol: kloroform: isoamylalkohol (25: 24: 1, pH 8) til plasmid DNA og rist kraftig i 15 sek. Fenol forårsaker alvorlige brannskader og er en bedøvelse så brenner ikke alltid følt før det er alvorlig skade. Utfør fenol: kloroform: isoamyl utvinning i avtrekksskap og vær forsiktig.
- Inkuber blandingen i 5 min ved RT. Sentrifuger ved 13000 xg i 10 min ved RT. Overfør 350 ul av øvre vandige fase inn i et nytt 1,5 ml oppsamlingsrør.
- Legg 350 ul TE-buffer til røret som inneholder den lavere organiske fasen. Rist kraftig i 15 sek. Sentrifuger ved 13000 x g i 5 min ved RT. Overfør 350 ul av øvre vandige fase til den samme 1,5 ml oppsamlingsrør.
- Legg 70 ul 3 M natriumacetat (pH 5,2) og bland godt. Legg 700 ul av 100% isopropanol. Bland godt og inkuber i 10 minutter ved RT. Sentrifuger ved 13.000 xg for 10 minat 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Legg 500 ul av 75% ethanol til pelleten. Vortex prøver å blande og sentrifuger ved 5000 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten. DNA er i pelleten.
- Åpne korken av røret og lufttørker pellet ved RT i 5 - 10 min. Pelleten bør bli gjennomskinnelig. Legg 500 ul TE-buffer for å resuspendere pelleten DNA. Oppvarm til 50 - 60 ° C i 10 minutter for å oppløse DNA pelleten.
- Mål absorbansen ved 260 nm (A260) og 280 nm (A280) med et spektrometer. Beregn konsentrasjonen av DNA ved å multiplisere verdien med A260 50 ng / mL. Vurdere kvaliteten på DNA ved calculating den A260 / A280 ratio. DNA med høy kvalitet bør gi en A260 / A280-forhold på 1,8 til 2,0.
2. celledyrking og Seeding
- Kultur RAW264.7 celler i DMEM supplert med 9% føtalt kalveserum (DMEM / 9% FCS) i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Under hver passering, løsne cellene fra platen ved kontinuerlig pipettering bruke en Pasteur pipette. Passage cellene hver 2 dager, og frø 1,5 til 2.000.000 celler på en 10 cm vev kultur behandlet rett som aksjen. Tine et nytt lager av celler hver 5-6 uker.
- På dagen for transfeksjon, frø 200 000 celler per brønn i en 24-brønns plate i et volum på 500 ul DMEM / 9% FCS. Cellene inkuberes i 4 timer i 37 ° C inkubator.
- Transfektere celler enten med lipid-baserte reagens (trinn 3.1) eller protein / polyamin-baserte reagens (trinn 3.2).
3. Transfeksjon
- Lipid-baserte transfeksjon:
- Varm opp transfeksjonen Reagent opp til romtemperatur i mørket. Varm opp serumfritt medium og DMEM / 9% FCS til 37 ° C.
- Tilsett 0,5 ug plasmid-DNA i 50 ul serumfritt medium i et 1,5 ml rør. Tilsett 2 pl av reagens transfeksjon med pipettespissen under overflaten av væsken. Vortex for 6 sek.
- La reagens / DNA-blandingen i mørke ved romtemperatur i 30 minutter.
- I løpet av 30 min inkubasjon, fjerne media fra brønnen og tilsett 250 mL av fersk DMEM / 9% FCS til hver brønn.
- Etter 30 minutter, tilsett 250 ul DMEM / 9% FCS til reagensen / DNA-blandingen. Bland godt ved å pipettere opp og ned.
- Tilsett 300 ul av den fortynnede blanding til hver brønn. Inkuber i 2 - 4 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
- Fjern transfeksjon løsning og legge 500 mL av DMEM / 9% FCS. Inkuber i 24-48 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator før cellestimulering.
- Protein / polyamine-baserte transfeksjon:
- Varm opp serum-freemedium og DMEM / 9% FCS til 37 ° C.
- Legg 0,75 mL av transfeksjon reagens til 18,75 ul serumfritt medium. Vortex kort å blande. Inkuber ved RT i 5 min. Tilsett 0,5 mL av 1 pg / pl DNA i fortynnet transfektert reagens. Inkuber ved RT i 10 min.
- I løpet av 10 min inkubering, fjernes mediet fra hver brønn av 24-brønns plate og tilsett 250 ul frisk DMEM / 9% FCS til hver brønn.
- Etter 10 minutter, tilsett 250 ul DMEM / 9% FCS i reagensen / DNA-blandingen.
- Legg 270 ul av den fortynnede blanding til brønnen. Inkuber i et 37 ° C og 5% CO2 inkubator i 2 - 4 timer.
- Fjern transfeksjon løsning og legge 500 mL av DMEM / 9% FCS. Inkuber i 24-48 timer i en 37 ° C, 5% CO2 inkubator.
4. Cell Stimulering og Luciferase Assay
- Bytt media i godt med 250 mL av fersk DMEM / 9% FCS.
- Tilsett 50 ul LPS eller LPS + IL-10 Ved de ønskede konsentrasjoner i brønnen. Returner platen til 37 ° C, 5% CO2 inkubator. Stimulere for 2 - 6 timer.
- Fjern stimulering løsning ved aspirasjon, vask med iskald PBS, og tilsett 200 ul 1x Passive Lysis Buffer. Stein ved romtemperatur i 30 minutter. Skrap og overføre lysat til 1,5 ml rør og fjerne celleavfall ved sentrifugering ved 20 000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Transfer 40 ul ryddet lysat (supernatant) til en hvit, klar bunn 96-brønns plate for bestemmelse av luciferase signaler i henhold til produsentens protokoll.
- Les luciferase signal med et luminometer over hele det synlige lysspekteret.
5. Data Analysis
- Beregn Firefly: Renilla forholdet ved å dele enkelte verdier av ildflueluciferase av verdiene Renilla luciferase fra hver brønn.
- Beregn ganger endring ved å dele Firefly: Renilla forholdet mellom behandlet godt avden av ubehandlet brønn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 sammen transfeksjonseffektiviteten av de to transfeksjon reagensene i RAW264.7. De lipid-baserte reagens typisk ga ca 25% transfeksjon hastigheten mens protein / polyamin-baserte transfeksjon resulterte i omtrent 5% effektivitet (figur 1A). Forskjellen i transfeksjonseffektivitet ble også observert i luciferase-signaler i RAW264.7 celler transfektert med den pGL3-promoter IκBζ reporter (figur 1B). Tilsetning av LPS til disse transfekterte celler økt ildflue luciferase signal, en direkte indikasjon på økt transkripsjon aktivitet av IκBζ promoter reporter. Med andre ord, antydet resultater at LPS oppregulert ekspresjonen av IκBζ genet, i samsvar med tidligere rapporter 7,8. Figur 2 viser typiske resultater som ble oppnådd i eksperimentene, ved hjelp av lipid-baserte transfeksjon som et eksempel. Etter å ha fått enkelte signalverdier fra firefly luciferase og Renilla luciferase (figurene 2A og 2B), den ildflueluciferase signaler ble normalisert til den Renilla luciferase-signalet (figur 2C). Normalisering anbefales på grunn av godt å vel variasjon i transfeksjonseffektivitet. For å bestemme om behandlingsbetingelsene (LPS eller LPS + IL-10) forandret rapportør signaler, Firefly: Renilla-forhold (dvs. de normaliserte signaler) av behandlingsgrupper ble sammenlignet med den for den ubehandlede (ikke-stimulert) prøve (figur 2D ). Våre data viser at behandling av celler med RAW264.7 LPS oppregulert aktiviteten til pGL3-promoter IκBζ reporter, noe som indikerer at LPS øket transkripsjon nivået av IκBζ genet. I nærvær av IL-10, den IκBζ promoter reporter hadde lavere aktivitet, noe som tyder på at IL-10 var i stand til å inhibere LPS-indusert transkripsjon av IκBζ genet. The protein / Polyaminet basert transfeksjon vanligvisga lavere verdier i både ildflue luciferase og Renilla luciferase signaler. Figur 3 sammenligner lengden av hviletiden mellom transfeksjon og stimuleringen (24 timer eller 48 timer), og viser at luciferase signaler redusert over tid. Nedgangen i signalet ikke forstyrrer data tolkning når den lipid-baserte transfeksjon reagens ble anvendt (figur 3A); induksjon av LPS og hemming av IL-10 var fortsatt observert etter 48 timers hvile. Imidlertid er reduksjonen i signalet var mer signifikant når det protein / polyamin-baserte transfeksjon reagens ble anvendt (figur 3B), spesielt Renilla luciferase signaler. Som et resultat, var forskjellen mellom behandlingsgruppene ikke observert etter en 48 timers hvile.
En uønsket effekt av transfeksjon er celledød, slik at virkningen av hver transfeksjon metoden på graden av apoptose ble bestemt. Cellene ble transfektert, eller ikke, og utsatt for Annexin-V og propidiumjodid (PI)farging. Lysatene fremstilt fra disse celler ble også analysert for tilstedeværelse av intakte og spaltede poly ADP ribose polymerase (PARP) protein. Strømningscytometrisk analyse av Annexin V / pi-fargede celler antydet at lipid-baserte transfeksjon noe øket andelen av Annexin V-positive celler sammenlignet med de ikke-transfekterte celler, mens protein / polyamin-baserte transfeksjon ikke (figur 4A) . Tilsvarende lipid-baserte transfektert svakt økt andelen spaltet PARP mens protein / polyamin-baserte transfeksjon ikke (figur 4B). Imidlertid, til tross for den forhøyede antall av apoptotiske celler, morfologien av cellene ved lysmikroskopi ble ikke endret (figur 4C). Enda viktigere, den biologiske respons av de lipid-baserte transfekterte celler forble identisk med de av de ikke-transfekterte celler (figur 4d). Cellene ble stimulert med LPS ± IL-10, og mengden av TNF ^5; utskilt i kultursupernatanten ble kvantifisert ved ELISA. Både de ikke-transfekterte og lipidbaserte transfekterte celler gjort lignende mengder av TNFa som respons på LPS, og ble inhibert ved tilsetning av IL10. Ingen TNFa ble gjort når cellene ikke ble stimulert (figur 4D) tyder på at celler forble naivt etter transfeksjon.
Figur 1. lipid-baserte transfeksjon ga høyere transfeksjonseffektiviteten enn protein / polyamin-baserte transfeksjon. (A) RAW264.7-celler ble transfektert et GFP-uttrykkende plasmid med enten lipid-baserte eller protein / polyamin-baserte transfeksjon reagenser. GFP-signalet ble målt ved flow-cytometri etter 24 timer. (B) RAW264.7 celler ble transfektert med pGL3-IkBζ promoter reporter. Etter 48 timers hvile, calen ble stimulert med LPS for 6 hr. Ildflueluciferase signalet ble målt i henhold til produsentens anvisninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Typiske luciferase assay data. RAW264.7 celler ble transfektert med TK-Renilla og IkBζ promoter reporter. Etter 24 timers hvile, ble celler stimulert med LPS ± IL-10 i 2 timer. (A) Firefly luciferase og (B) Renilla luciferasepreparater signalene ble målt i henhold til luciferase assay produsentens anvisninger. (C) rapportøraktivitet var normalisert til TK-Renilla signal og plottet som Firefly / Renilla-forhold. (D) Brett endring er beregnet ved å dividereFirefly:. Renilla forholdet mellom de stimulerte prøvene ved at av unstimulated prøven Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Styrken av luciferase-signalet er tidsavhengig. (A) lipidbasert transfektert og (B) Protein / polyamin-baserte transfekterte celler ble hvilt for enten 24 timer eller 48 timer før stimulering med LPS ± IL-10 2 timer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her ikke utelukkende fokusere på transfeksjonseffektivitet, men tar sikte på å finne en balanse mellom effektivitet og bevaring av de fysiologiske tilstander av cellene. Nærmere bestemt, lykkes vår fremgangsmåte til å minimalisere toksisitet av transfeksjon reagens og maksimere signal luciferase.
Et kritisk trinn i protokollen er helsen til cellene. Overgrodde kulturer er ikke egnet for transfeksjon som deres fysiologiske endringer, og kontinuerlig dyrking av RAW264.7 celler for en lengre periode kan også endre fenotype og funksjonen av cellene 10. Fersk tinte celler som har en lav passasje antall anbefales å bruke for transfeksjon.
En annen viktig faktor er valget av transfeksjonsteknikker reagenser. Lipid-baserte transfeksjon reagenser er vanligvis brukt i forskning på grunn av sin brukervennlighet og kommersiell tilgjengelighet. Men noen av disse reagenser forårsaket unintended (og vanligvis uønsket) endringer i global genekspresjon i transfekterte celler 11,12. For å løse dette problemet, blir cellene inkubert med bare transfeksjonsagensene reagensene i et par timer i stedet for de typiske O / N, eller et ikke-lipid-baserte reagens er valgt for transfeksjon. Lengre inkubasjon tid med transfeksjon reagenset vil øke transfeksjonseffektivitet, men det kan også være skadelig for cellene enten forårsaker celledød eller celleaktivering, som begge kan påvirke den eksperimentelle design. Figurene 4A og 4B viser at protein / polyamine- basert transfeksjon forårsaket ikke apoptose eller nekrose, sammenlignet med ikke-transfekterte celler. De lipid-baserte transfeksjon, selv med den korte inkubasjonstid, forårsaket høyere nivå av celledød. Det er korrelert til høyere transfeksjonseffektiviteten av lipid-baserte transfeksjon reagens. Imidlertid, når de transfekterte celler observert under mikroskop, var det ingen merkbar morfologisk endrings (Figur 4C). Aktiverte makrofager vanligvis vedta en viltvoksende form, men både utransfekterte og transfekterte celler viste ikke tegn til aktivisering før stimulering, noe som indikerer at de var i hvile stater. I tillegg er de transfekterte celler reagerte på lignende måte LPS og IL-10 stimulering i de ikke-transfekterte celler (figur 4d). Disse observasjonene kollektivt tyder på at dette transfeksjon prosedyren ikke endrer cellene naturlige atferd.
Tiden mellom transfeksjon og eksperimentell behandling (resten tid) er også avgjørende. Nok tid må gis for luciferase gener å uttrykke og for cellene å re-etablere sitt hviletilstand; kan imidlertid en lang inkubasjonstid redusere luciferasepreparater signaler, spesielt når transfeksjonseffektivitet er ikke høy.
Fremgangsmåten her gjelder for den spesifikke luciferase reporter-genet anvendt i vårt laboratorium. Mindre justeringer vil være neeDED når en annen reporter som brukes. Parametere som må testes inkludere annerledes ildflueluciferase reporter: Renilla luciferase ratio, hviletid mellom transfeksjon og behandling, og behandlingsforhold. En 50: 1 forhold av pGL3-IκBζ: phRL-TK er vanligvis brukes, men forholdet kan variere fra 1: 1 til 100: 1. Det ble funnet at en 24 timers hvile mellom fjerning av transfeksjon løsning fra cellene og starten av eksperimentell behandling ga den beste signal. Etter 48 timer begynte luciferasepreparater signaler fallende, og forskjeller mellom behandlingsgruppene ble redusert eller avskaffet.
Den beskrevne transfeksjon Prosedyren er ikke begrenset til luciferase reporter analyser. Andre eksperimentelle design som ikke trenger en homogen befolkning vil bli dratt nytte; for eksempel fluorescerende mikroskopi som bygger på observasjoner fra enkeltceller. En ulempe vil være å lokalisere med hell transfekterte celler hos ikke-transfekterte motparter, menFordelene ved å være mindre tidskrevende og arbeidskrevende, kan være mer ønskelig. I tilfeller hvor stabile cellelinjer er foretrukket, gir vår protokoll en midlere for innledende eksperimenter hvor forsøksprosedyre kan optimaliseres når stabile cellelinjer blir generert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit | Life Technologies | K210007 | Any maxiprep kit will work |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Life Technologies | 15593-049 | Molecular Biology Grade. Phenol is toxic so work in the fume hood, if possible. Use the lower clear organic layer if two layers of liquid form in the container. |
| DMEM | Thermo Scientific | SH30243.01 | Warm in 37 °C water bath before use. |
| Fetal bovine serum | Thermo Scientific | SH30396.03 | Inactivated at 56 °C water bath for 45 min before use. |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985-070 | Warm to at least room temperature before use. |
| XtremeGene HP DBA transfection reagent | Roche | 6366236001 | Warm to room temperature before use. |
| GeneJuice | EMD Millipore | 70967 | Warm to room temperature before use. |
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E1941 | 30 ml is included in the Dual Luciferase Reporter Assay System |
| Dual Luciferase Reporter Assay System | Promega | E1910 |
References
- Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
- Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
- Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
- Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
- Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
- Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
- Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
- Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336 (2013).
- Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
- Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
- Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
- Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).
